JPH09508527A

JPH09508527A - リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用

Info

Publication number: JPH09508527A
Application number: JP7520829A
Authority: JP
Inventors: ニキフォロフ，テオ; カーン，ジョナサン; ゴレット，フィリップ
Original assignee: モレキュラー・ツール，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-02-07
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 1997-09-02
Anticipated expiration: 2016-06-11
Also published as: EP0754240B1; EP0754240A1; JP3175110B2; AU1840795A; ATE247716T1; AU694187B2; CA2182517C; WO1995021271A1; DE69531542T2; US5679524A; EP0754240A4; DE69531542D1; CA2182517A1; US5952174A

Abstract

(57)【要約】核酸分子中の前以て選択した部位のヌクレオチドの同一性を決定する方法が提供される。この方法は、該前以て選択した部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸をプライマー分子の末端に組み込み、ついで、これを第二オリゴヌクレオチドにライゲートすることを含む。反応のモニタリングは、反応の固相に結合した特異的標識を検出することにより、または溶液中で検出することにより行う。

Description

【発明の詳細な説明】リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用発明の技術分野本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、動物のゲノムの特定の部位、たとえば単一ヌクレオチド多型部位(single nucleoti de polymorphic site)などに存在するヌクレオチドの同一性を決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼ媒体された方法に関する。本発明はさらに、同一性、祖先または遺伝的体質を分析するための該決定法の使用に関する。発明の背景Ｉ．多型部位に存在するヌクレオチドの決定ウイルス、細菌、植物および動物は、自然にその継続的な進化の過程で自然突然変異を起こす(グセラ(Ｇusella,Ｊ.Ｆ.)、Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.５５：８３１〜８５４(１９８６))。かかる変異は種の成員のすべてに直ちに伝達されるわけではないので、進化の過程によって種の集団中に共存する多型対立遺伝子が生成される。ある場合には、かかる共存は安定なまたは準安定な平衡にある。他の場合には、該変異は種に生存上または進化上の利点を与え、それゆえ最終的に(すなわち、進化学的時間をかけて)該種の各成員のＤＮＡ中に取り込まれる。幾つかのクラスの多型が同定されている。たとえば、可変ヌクレオチドタイプ多型(variable nucleotide type polymorphism；「ＶＮＴＲ」)は、ヌクレオチドのジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド繰り返しモチーフの自発タンデム重複 (spontaneous tandem duplications)により起こる(ウエバー(Ｗeber,Ｊ.Ｌ.)、米国特許第５,０７５,２１７号；アーマー(Ａrmour,Ｊ.Ａ.Ｌ.)ら、ＦＥＢＳ Le tt .３０７：１１３〜１１５(１９９２)；ジョーンズ(Ｊones,Ｌ.)ら、Ｅur.Ｊ. Ｈaematol .３９：１４４〜１４７(１９８７)；ホーン(Ｈorn,Ｇ.Ｔ.)ら、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１４００３号；ジェフリーズ(Ｊeffreys,Ａ.Ｊ.)、ヨーロッパ特許出願第３７０,７１９号；ジェフリーズ、米国特許第５,１７５, ０８２号；ジェフリーズら、Ａmer.Ｊ.Ｈum.Ｇenet.３９：１１〜２４(１９８６ )；ジェフリーズら、Ｎature ３１６：７６〜７９(１９８５)；グレイ(Ｇray,Ｉ .Ｃ.)ら、Ｐroc.Ｒ.Ａcad.Ｓoc.Ｌond.２４３：２４１〜２５３(１９９１)；ムア(Ｍoore,Ｓ.Ｓ.)ら、Ｇenomics １０：６５４〜６６０(１９９１)；ジェフリーズら、Ａnim.Ｇenet.１８：１〜１５(１９８７)；ヒレル(Ｈillel,Ｊ.)ら、Ａ nim.Ｇenet .２０：１４５〜１５５(１９８９)；ヒレルら、Ｇenet.１２４：７８３〜７８９(１９９０))。かかる変異が制限エンドヌクレアーゼ開裂により生成する断片長を変化させるならば、かかる変異は制限断片長多型(「ＲＦＬＰ」)と呼ばれる。ＲＦＬＰは、ヒトおよび動物の遺伝子解析に広く用いられている(グラスバーグ(Ｇlassberg,Ｊ.)、英国特許出願第２１３５７７４号；スコルニク(Ｓk olnick,Ｍ.Ｈ.)ら、Ｃytogen.Ｃell Ｇenet.３２：５８〜６７(１９８２)；ボトシュタイン(Ｂotstein,Ｄ.)ら、Ａnn.Ｊ.Ｈum.Ｇenet.３２：３１４〜３３１(１９８０)；フィッシャー(Ｆischer,Ｓ.Ｇ.)ら、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１３６６８号；ウーレン(Ｕhlen,Ｍ.)、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１１３６９号)。殆どの多型は、最初に存在した遺伝子配列から単一のヌクレオチドのみが置換することにより起こる。稀な場合には、そのような置換が特定の制限部位の生成または破壊を引き起こすことがあり、かくしてＲＦＬＰ多型が構成される。しかしながら、多くの場合は、そのような単一のヌクレオチド多型におけるヌクレオチドの置換は制限断片分析によっては決定することができない。ある場合には、そのような多型は遺伝子疾患において決定的な特性となる変異を構成する。実際、そのような変異は、疾患(すなわち、血友病、鎌型赤血球貧血)を実際に引き起こすに充分な仕方でタンパク質をコードする遺伝子中の単一のヌクレオチドに影響を及ぼす。現代遺伝学においてそのような多型が中心的な重要性を担うにもかかわらず、多くのそのような多型において２人の個体の対立遺伝子を平行して比較することを可能にする方法は殆ど開発されていない。 II．本発明の単一ヌクレオチド多型の属性および遺伝子解析におけるその使用の利点「多型」は、種の幾つかの成員のＤＮＡ配列における変異である。それゆえ、多型は、多型の存在のために種の幾つかの成員では変異しない配列(すなわち、もともとの「対立遺伝子」)を有し、一方、他の成員は変異した配列(すなわち、変異「対立遺伝子」)を有するので「対立遺伝子的(allelic)」であるといわれる。最も単純な場合では、わずかに一つの変異した配列のみが存在し、この多型は２対立遺伝子的(diallelic)であるといわれる。２対立遺伝子的な二倍体生物の場合は３つの遺伝子型が可能である。これら遺伝子型は、一つの対立遺伝子に関してはホモ接合性であり、他の対立遺伝子に関してはホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性である。２対立遺伝子的な一倍体生物の場合は、これら遺伝子型は一つの対立遺伝子または他方の対立遺伝子のいずれかであり、それゆえ２つの遺伝子型のみが可能である。２対立遺伝子的な多型が本発明の好ましい多型である。他の変異が起こると３対立遺伝子などの多型を引き起こし得る。対立遺伝子は、変異を含むヌクレオチドにより言及することができる。本発明は、特定のクラスの対立遺伝子的多型、および植物または動物の遺伝子型決定におけるその使用に関する。そのような対立遺伝子的多型は、本明細書では「単一ヌクレオチド多型(single nucleotide polymorphisms)」または「ＳＮＰ」という。「単一ヌクレオチド多型」は、その特徴的な属性によって定義される。そのような多型の主要な属性は、最も好ましくは単一のヌクレオチドによって占められる多型部位「Ｘ」を有することであり、この多型部位は多型の変異の部位である(ゴレット(Ｇoelet,Ｐ.)およびクナップ(Ｋnapp,Ｍ.)、米国特許出願第０８／１４５,１４５号(参照のため本明細書に引用する))。ＳＮＰはＲＦＬＰやＶＮＴＲに比べて幾つかの顕著な利点を有する。まず、ＳＮＰは他のクラスの多型に比べて安定である。その自然突然変異率は約１０^-9であり(コーンバーグ(Ｋornberg,Ａ.)、ＤＮＡＲeplication、フリーマン(Ｗ.Ｈ. Ｆreeman ＆Ｃo.)、サンフランシスコ、１９８０)、ＶＮＴＲよりも約１,０００倍頻度が低い。有意に、ＶＮＴＲタイプの多型は高い突然変異率を特徴とする。第二に、ＳＮＰはＲＦＬＰやＶＮＴＲに比べて高い頻度および高い均一性で起こる。ＶＮＴＲおよびＲＦＬＰの特性は多型を検出するのに使用した方法に大きく依存する。対照的に、ＳＮＰは配列変異により生じるので、新たな多型はランダムなゲノム分子またはｃＤＮＡ分子をシークエンシングすることによって同定することができる。ＶＮＴＲおよびＲＦＬＰはまたＳＮＰの部分集合と考えることもできる。なぜなら、ＶＮＴＲまたはＲＦＬＰの領域における変異は該領域における単一塩基の変化となり得るからである。ＳＮＰはまた、欠失、点変異および挿入によっても起こる。いかなるものが引き起こすものであれ、あらゆる単一塩基変化はＳＮＰとなり得る。ＳＮＰの頻度が高いことは、それが他のクラスの多型に比べて一層容易に同定し得ることを意味する。ＳＮＰの分布の均一性が大きいことは、所望の特定の体質に「一層近い」ＳＮＰを同定することを可能にする。これら２つの属性が組合わさって得られる効果は、ＳＮＰを極めて価値の高いものにする。たとえば、特定の体質(たとえば、癌の素質)が特定の遺伝子座での変異を反映しているならば、該特定の遺伝子座と連係した多型を用い、ある個体が該体質を示すであろう蓋然性を予測することができる。ＳＮＰは種々の方法のいずれを用いても特徴付けることができる。そのような方法としては、該部位の直接または間接シークエンシング、該部位の各対立遺伝子が制限部位を生成もしくは破壊する場合の制限酵素の使用、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションプローブの使用、該多型の異なる対立遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体の使用、または他の生化学的な解釈によるものが挙げられる。しかしながら、正確さが優れ、なおかつ実施するのが容易なアッセイは未だ存在しない。 III．多型部位の分析法Ａ．ＤＮＡシークエンシング多型を特徴付ける最も明白な方法は、該多型の両側にある遺伝子座および該多型を含む遺伝子座を直接ＤＮＡシークエンシングすることを伴う。かかる分析は、「サンガー法」としても知られる「ジデオキシにより媒体されたチェインターミネーション法(dideoxy-mediated chain termination method)」(サンガー(Ｓange r,Ｆ.)ら、Ｊ.Ｍolec.Ｂiol.９４：４４１(１９７５))かまたは「マクサム−ギルバート法」としても知られる「化学的分解法」(マクサム(Ｍaxam,Ａ.Ｍ.)ら、Ｐroc . Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ )７４：５６０(１９７７))のいずれかを用いて行うことができる。複製連鎖反応(ムリス(Ｍullis,Ｋ.)ら、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｓ ymp.Ｑuant.Ｂiol .５１：２６３〜２７３(１９８６)；エーリヒ(Ｅrlich,Ｈ.)ら、ヨーロッパ特許出願第５０,４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４,７９６号、ヨーロッパ特許出願第２５８,０１７号、ヨーロッパ特許出願第２３７,３６２号；ムリス、ヨーロッパ特許出願第２０１,１８４号；ムリスら、米国特許第４,６８３,２０２号；エーリヒ、米国特許第４,５８２,７８８号；およびサイキ(Ｓai ki,Ｒ.)ら、米国特許第４,６８３,１９４号)などのゲノム配列特異的な増幅技術を組み合わせて用いて所望のポリヌクレオチドの回収を容易にすることができる。直接シークエンシング法は技術的に手間がかかり、比較的コスト高で、スループット率も低い。その結果、ＳＮＰの繰り返しおよび平行分析を簡便にする技術が必要とされている。Ｂ．エキソヌクレアーゼ耐性ムンディー(Ｍundy,Ｃ.Ｒ.)(米国特許第４,６５６,１２７号)は、特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するための他の方法を論じている。ムンディーの方法では特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を使用する。多型部位のすぐ３'側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得た標的分子にハイブリダイズさせる。標的分子上の該多型部位が、存在する該特定のエキソヌクレオチド耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含むなら、該誘導体はハイブリダイズした該プライマーの末端にポリメラーゼによって組み込まれるであろう。かかる組み込みによりプライマーはエキソヌクレアーゼに耐性となり、それによって検出することが可能となる。該試料のエキソヌクレオチド耐性誘導体の同一性はわかっているので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性になったという知見により、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが該反応に用いたヌクレオチド誘導体に相補的であったということが明らかになる。ムンディーの方法は、大量の外来配列データを決定する必要がないという点で有利である。この方法は、増幅した標的配列および非修飾プライマーが破壊され、使用した特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドのポリメラーゼによる組み込み率に極めて感受性であるという欠点がある。Ｃ．マイクロシークエンシング(Ｍicrosequencing)法最近、ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための幾つかのプライマーによる(p rimer-guided)ヌクレオチド組み込み法が記載されている(コムハー(Ｋomher,Ｊ. Ｓ.)ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１７：７７７９〜７７８４(１９８９)；ソコロフ( Ｓokolov,Ｂ.Ｐ.)、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１８；３６７１(１９９０)；シベネン( Ｓyvanen,Ａ.−Ｃ.)ら、Ｇenomics ８：６８４〜６９２(１９９０)；クップスウォミー(Ｋuppuswamy,Ｍ.Ｎ.)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ) ８８：１１４３〜１１４７(１９９１)；プレザント(Ｐrezant,Ｔ.Ｒ.)ら、Ｈum.Ｍutat.１：１５９〜１６４(１９９２)；ウゴゾッリ(Ｕgozzoli,Ｌ.)ら、ＧＡＴＡ９：１７１〜１７５(１９９３))。これら方法は、ジェネティックビットアナリシス( Ｇenetic Ｂit^TMＡnalysis)(下記で詳細に記載する「ＧＢＭ^TM」）とは、多型部位の塩基を識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依存する点で異なる。そのような態様において、シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの操作で生じた多型からは該操作の長さに比例するシグナルが得られる(シベネンら、Ａmer.Ｊ.Ｈum.Ｇenet.５２：４６〜５９(１９９３))。そのような遺伝子座特異的な範囲のシグナルは、ＧＢＭ^TM 法によって生成したシグナルの単純な３つ組の(２：０、１：１、または０：２) クラスに比べ、特にヘテロ接合体の場合に解釈が一層複雑である。加えて、幾つかの遺伝子座では、たとえ正しいジデオキシヌクレオチドが存在している場合でも正しくないデオキシヌクレオチドの組み込みが起こり得る(コムハーら、Ｎucl .Ａcids Ｒes .１７：７７７９〜７７８４(１９８９))。そのようなデオキシヌクレオチドの間違った組み込み事象は、ある種の配列の文脈においては正しく塩基対形成されたジデオキシ基質の比較的低いＫｍに匹敵する、間違って塩基対形成したデオキシ基質に対するＤＮＡポリメラーゼのＫｍによるものであるかもしれない(コーンバーグら、ＤＮＡＲeplication、第２版(１９９２)、フリーマン・アンド・カンパニー(Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany)、ニューヨーク；テーバー (Ｔabor,Ｓ.)ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ) ８６：４０７６〜４０８０ (１９８９))。この効果は、多型部位探索(interrogation)におけるバックグラウンドノイズの一因となる。Ｄ．ｄｄＮＴＰを用いた溶液中での伸長コーエン(Ｃohen,Ｄ.)らは(フランス特許第２,６５０,８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号)、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するための溶液ベースの方法を論じている。米国特許第４,６５６,１２７号のムンディーの方法と同様、多型部位のすぐ３'側の対立遺伝子配列に相補的なプライマーを用いる。この方法では、標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて該部位のヌクレオチドの同一性を決定するが、該誘導体は該多型部位のヌクレオチドに相補的であるなら該プライマーの末端に組み込まれるであろう。コーエンの方法は、標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸を用いる溶液ベースの伸長法であるという有意の欠点を有する。標的ＤＮＡ鋳型は、通常、ＤＮＡポリメラーゼの天然の基質であるデオキシヌクレオシド三リン酸を高濃度で使用するＰＣＲなどのＤＮＡ増幅反応により調製する。これらモノマーは、その後の伸長反応においてジデオキシヌクレオシド三リン酸と競合するであろう。それゆえ、ＰＣＲ後に組み込まれなかったｄＮＴＰからＤＮＡ鋳型を分離するためにさらなる精製工程が必要である。この方法は溶液ベースの方法であるので、組み込まれなかったｄＮＴＰを除去するのは困難であり、高容量の試験には適していない。Ｅ．ｄｄＮＴＰを用いた固相伸長ジェネティックビットアナリシス^TMとして知られる別法が、ゴレット(Ｇoelet ,Ｐ.)らによって記載されている(ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号)。好ましい態様においてゴレットらの方法は、標識ターミネーターおよび多型部位の３'側の配列に相補的なプライマーの混合物を用いる。それゆえ、組み込まれる標識ターミネーターは、評価しようとする標的分子の多型部位中に存在するヌクレオチドによって決定され、該ヌクレオチドに相補的である。コーエンらの方法(フランス特許第２,６５０,８４０号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号)とは対照的に、ゴレットらの方法は好ましくは不均一相アッセイであり、プライマーまたは標的分子が固相に固定化されている。それゆえ、実施するのが容易であり、コーエンによって論じられている方法よりも一層正確である。Ｆ．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ異なる酵素法を用いる他の固相法は「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」(「ＯＬＡ」)である(ランデグレン(Ｌandegren,Ｕ.)ら、Ｓcience ２４１：１０７７〜１０８０(１９８８))。ＯＬＡプロトコールでは、標的の一本鎖の隣接配列にハイブリダイズしうるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを用いる。これらオリゴヌクレオチドの一方はビオチン化され、他方は検出可能なように標識されている。もしも正確な相補的配列が標的分子中に認められたなら、これらオリゴヌクレオチドはそれぞれの末端が隣接するようにしてハイブリダイズし、ライゲーション基質を生成するであろう。ついで、ライゲーションすることにより、アビジンまたは他のビオチンリガンドを用いて標識オリゴヌクレオチドを回収することが可能になる。ＯＬＡでは点突然変異をも検出することができる。ニッカーソン(Ｎickerson,Ｄ.Ａ.)らは、ＰＣＲとＯＬＡとの属性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載している(ニッカーソンら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad. Ｓci.(ＵＳＡ) ８７：８９２３〜８９２７(１９９０))。この方法では、ＰＣＲは標的ＤＮＡの対数増幅を達成するのに用いられており、該標的ＤＮＡはついでＯＬＡを用いて検出される。ＯＬＡのようなアッセイでは、各ｄＮＴＰについて別々のセットのオリゴヌクレオチドを用い、多型の各候補ｄＮＴＰを別々に調べる必要がある。ＯＬＡの主要な欠点は、ライゲーションがそれほど識別力のある方法ではなく、非特異的なシグナルが有意の問題となるということである。 IV．結論認識されるであろうように、上記方法の殆どはプライマー分子の３'末端にヌクレオチド誘導体を組み込むのにポリメラーゼを必要とする。単一のヌクレオチド多型を識別するための一層選択的な方法を開発することが望まれる。本発明は、多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼにより媒体された方法を提供することにより、この要求を満足させるものである。工程にリガーゼを加えるということは、シグナル、伸長およびライゲーションを生成するために２つの事象が必要であることを意味する。このことは、伸長かまたはライゲーションのいずれかを単独で用いる方法に比べて一層高い特異性および一層低い「ノイズ」を可能とする。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイとは異なり、本発明では伸長の識別工程はポリメラーゼによって媒体されるが、ポリメラーゼはその活性においてリガーゼよりも特異性が高い。ポリメラーゼに基づくアッセイとは異なり、この方法は、シグナルを固相に結合させるための第二のハイブリダイゼーションおよびライゲーション工程と組み合わせることにより、ポリメラーゼ工程の特異性が増大している。発明の要約本発明は、生物(微生物、植物、非ヒト動物、またはヒトのいすれか)の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するためのリガーゼ／ポリメラーゼ媒体された方法に関する。本発明はさらに、そのような情報を遺伝子解析に使用する方法に関する。詳細には、本発明は、標的核酸分子中の前以て選択した単一ヌクレオチド部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定する方法を提供するものであり、該方法は、工程： (Ａ)第一オリゴヌクレオチド(リンカーかまたはプライマーのいずれか)を固相支持体に固定化し、その際、該第一オリゴヌクレオチドは該標的分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、ハイブリダイズした第一オリゴヌクレオチドの一方の末端が該前以て選択した部位にすぐに隣接するように、該標的分子の第一の領域にハイブリダイズすることができ、 (Ｂ)固定化された第一オリゴヌクレオチドを標的分子の存在下、およびさらに第二オリゴヌクレオチド(リンカーかまたはプライマーのいずれか)の存在下でインキュベートし、その際、該オリゴヌクレオチドの添加の順序は重要ではなく、該第二オリゴヌクレオチドは該標的分子の配列に相補的な配列を有し、該標的分子の第二の領域にハイブリダイズすることができ、その際、該第一の領域と該第二の領域とは該前以て選択した部位により互いに隔てられており、該インキュベーションは、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドが標的分子にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション生成物を生成するに充分な条件下で行い、該ハイブリダイゼーション生成物は、これらオリゴヌクレオチドが単一のヌクレオチドの空隙により互いに隔てられており、該空隙は該前以て選択した部位の反対側にあり、 (Ｃ)該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラーゼ、リガーゼ、および少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下でさらにインキュベートし、その際、該インキュベーションは、該固定化された第一または第二のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれかの３ '末端にヌクレオシド三リン酸を鋳型依存でポリメラーゼ媒体されて組み込むことを可能にするに充分な条件下で行い、それによってこれらハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の空隙を充填させ、これらオリゴヌクレオチドを隣接させ、該組み込みは該前以て選択した部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸を該ヌクレオシド三リン酸混合物が含有しているか否かに依存し、 (Ｄ)リガーゼにより隣接する第一または第二のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの対をライゲートさせ、 (Ｅ)該固定化された第一オリゴヌクレオチドを、非共有結合により結合した標的または第二オリゴヌクレオチドを該第一オリゴヌクレオチドから分離するに充分な条件下でさらにインキュベートし、ついで (Ｆ)該第二オリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド三リン酸の一つが固相支持体に固定化されたか否かを決定することにより、前以て選択した部位のヌクレオチドの同一性を決定するからなる。本発明はさらに、第一および第二オリゴヌクレオチドおよび標的分子がＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸および他の修飾ＤＮＡ分子である上記方法の態様を包含する。本発明はまた、工程Ａにおいて第一オリゴヌクレオチド(「リンカー」)の３'末端が固相支持体に固定化される上記方法の態様、工程Ｃにおいて該条件が該第二のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド(「プライマー」)の３'末端へのヌクレオシド三リン酸の組み込みを可能とするものである上記方法の態様、または工程Ａにおいて第一オリゴヌクレオチドの５'末端が固相支持体に固定化される上記方法の態様、および工程Ｃにおいて該条件が該第一のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド(プライマー)の３'末端へのヌクレオシド三リン酸の組み込みを可能とするものである上記方法の態様をも包含する。本発明はさらに、ヌクレオシド三リン酸の一つが検出可能に標識されている( ハプテン、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識などで)上記方法の態様に関する。本発明は特に、工程Ｃにおいてヌクレオシド三リン酸混合物が１またはそれ以上の検出可能に標識されたヌクレオシド三リン酸を含み、他の標識されていないヌクレオシド三リン酸がデオキシヌクレオシド三リン酸かまたはジデオキシヌクレオシド三リン酸のいずれかである上記方法の態様、および工程Ｆにおいて前以て選択した部位のヌクレオチドの同一性の決定を、固定化された標識デオキシ− またはジデオキシヌクレオシド三リン酸の標識を検出することにより行う上記方法の態様に関する。本発明はまた、第二オリゴヌクレオチドが検出可能に標識されている上記方法の態様、工程Ｃにおいてヌクレオシド三リン酸混合物が一つのヌクレオシド三リン酸のみを含み、該ヌクレオシド三リン酸が他の３つのジデオキシヌクレオチド三リン酸とともにまたは他の３つのジデオキシヌクレオチド三リン酸を含むことなく存在するデオキシヌクレオシド三リン酸である上記方法の態様、および工程Ｆにおいて前以て選択した部位のヌクレオチドの同一性の決定を、固定化された標識第二オリゴヌクレオチドの標識を検出することにより行う上記方法の態様にも関する。別の態様においては、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行い、ライゲートされたオリゴヌクレオチドが検出のために固相上に捕捉される。さらに別の態様においては、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行い、ライゲートされたオリゴヌクレオチドの検出を溶液中で行う。本発明は、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、植物およびヒトよりなる群から選ばれた動物を含む二倍体生物並びに細菌、真菌およびウイルスを含む一倍体生物の多型を分析するための上記方法の使用を包含する。図面の記載図１は、標識ｄＮＴＰを用いたリガーゼ媒体ＧＢＭ^TM手順の模式図てある。( １)において、５'リン酸化されたリンカーオリゴヌクレオチドがマイクロウエルの表面上に結合する。(２)において、鋳型ＤＮＡを該リンカーにハイブリダイズさせる。(３)において、該固定化された鋳型にプライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。(４)において、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、標識ｄＮＴＰおよび非標識ｄＮＴＰの存在下、標識ｄＮＴＰを組み込ませ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。(５)において、ウエルをアルカリで洗浄してライゲートしなかったすべてのＤＮＡを除去する。(６)において、酵素結合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出する。図２は、標識プライマーを用いたリガーゼ媒体ＧＢＭ^TM手順の模式図である。 (１)において、５'リン酸化されたリンカーオリゴヌクレオチドがその３'端にてマイクロウエルの表面上に結合する。(２)において、鋳型ＤＮＡを該リンカーにハイブリダイズさせる。(３)において、該固定化されたリンカーにビオチン化されたプライマーオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。(４)において、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、標識ｄＮＴＰおよび３つの非標識ｄｄＮＴＰの存在下、該ｄＮＴＰを組み込ませ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。 (５)において、ウエルをアルカリで洗浄してライゲートしなかったＤＮＡを除去する。(６)において、酵素結合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出する。図３は、標識リンカーを用いたリガーゼ媒体ＧＢＭ^TM手順の模式図である。( １)において、プライマーオリゴヌクレオチドがその５'端にてマイクロウエルの表面上に結合する。(２)において、鋳型ＤＮＡを該リンカーにハイブリダイズさせる。(３)において、該固定化された鋳型に５'リン酸化され３'ピオチン化されたリンカーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。(４)において、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、標識ｄＮＴＰおよび３つのｄｄＮＴＰの存在下、該ｄＮＴＰを組み込ませ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。(５)において、ウエルをアルカリで洗浄してライゲートしなかったＤＮＡを除去する。(６)において、酵素結合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出する。図４は、溶液中でのリガーゼ媒体ＧＢＭ^TM手順の模式図である。(１)において、５'リン酸化され３'フルオレセイン化されたリンカーオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡおよびプライマーオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする。( ２)において、これら３つのＤＮＡ分子を溶液中にてハイブリダイズさせる。(３ )において、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、標識ｄＮＴＰおよび非標識ｄＮＴＰの存在下、標識ｄＮＴＰを組み込ませ、リンカーとプライマーとをライゲートさせる。(４)において、該ライゲートされたオリゴヌクレオチドが固相上に捕捉され、ウエルを洗浄してライゲートしなかったＤＮＡを除去する。(５)において、酵素結合抗体および基質を用いて該標識塩基を検出する。好ましい態様の記載Ｉ．本発明のリガーゼ／ポリメラーゼ媒体アッセイＡ．試料の調製核酸試料は、「侵入性(invasive)」かまたは「非侵入性(non-invasive)」のサンプリング手段を用い、分析すべき種の個体から得ることができる。サンプリング手段は、動物(とりわけ、マウス、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、またはネコを含む)の皮膚または器官内からの核酸の回収を行う場合に「侵入性」であるといわれる。侵入性の方法の例としては、採血、精液の回収、針生検、胸膜吸引などが挙げられる。かかる方法の例は、キム(Ｋim,Ｃ.Ｈ.)ら(Ｊ.Ｖirol.６６：３８７９〜３８８２(１９９２))；ビスワス(Ｂiswas,Ｂ.)ら(Ａnnals ＮＹＡ cad.Ｓci .５９０：５８２〜５８３(１９９０)）；ビスワスら(Ｊ.Ｃlin.Ｍicrob iol .２９：２２２８〜２２３３(１９９１))において議論されている。対照的に、「非侵入性」のサンプリング手段は、動物の内部または外部表面から核酸分子を回収するものをいう。かかる非侵入性のサンプリング手段としては、「ふき取り(swabbing)」、涙、唾液、尿、糞便、汗などの回収が挙げられる。本明細書において「ふき取り」とは、吸着材料を含むアプリケーター／コレクター(「スワッブ(swab)」)を、表面の破片および／または死滅したまたは抜け落ちた細胞または細胞の破片を回収するに充分な仕方で表面に接触させることをいう。そのような回収は、鼻腔、口腔、直腸口、膣口または耳腔をこすることにより、皮膚または涙管に接触させることにより、または毛包を回収することによって行うことができる。Ｂ．標的配列の増幅ＤＮＡの試料中の多型部位の検出は、ＤＮＡ増幅法を使用することによって容易にできる。かかる方法は、多型部位にまたがるまたは該部位を含む配列、または該部位の遠位もしくは近位に位置する配列濃度を特異的に増大させる。かくして増幅された分子は、ゲル電気泳動その他の手段により容易に検出できる。そのような増幅を達成する最も好ましい方法は、二本鎖形態において多型を定める近位配列にハイブリダイズしうるプライマー対を用いたＰＣＲを用いることである。Ｃ．一本鎖ＤＮＡの調製本発明の方法は、標的核酸が天然の２つの鎖の一方のみを含有していることを必要としない。それゆえ、本発明の方法は、たとえばアルカリ処理により得られたいずれかの一本鎖ＤＮＡかまたは天然のＤＮＡのいずれかに対して行うことができる。使用されない(鋳型でない)鎖が存在しても反応に影響を及ぼさない。所望なら、種々の方法のいずれかを用い、標的ＤＮＡ分子の天然の２つの鎖の一方を反応から除去することができる。一本鎖ＤＮＡ分子は、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３を用いて生成させることができる(メッシング(Ｍessing,Ｊ.) ら、Ｍeth.Ｅnzymol.１０１：２０(１９８３)；また、サンブルック(Ｓambrook, Ｊ.)ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)をも参照)。幾つかの別法を用いて一本鎖ＤＮＡ分子を生成させることができる。ギレンステン(Ｇyllensten,Ｕ.)ら(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.(ＵＳＡ) ８５：７６５２〜７６５６(１９８８))およびミホビロビッチ(Ｍihovilovic,Ｍ.)ら(ＢioＴechniq ues７ (１)：１４(１９８９))は、「非対称ＰＣＲ」と称する方法を記載しており、この方法では異なるモル濃度で存在するプライマーを用いて標準「ＰＣＲ」を行う。ヒグチ(Ｈiguchi,Ｒ.Ｇ.)ら(Ｎucleic Ａcids Ｒes.１７：５８６５(１９８５)) は、一本鎖増幅生成物を生成する別の方法を例示している。この方法は、二本鎖の増幅生成物の一方の鎖の５'末端をリン酸化し、ついで５'→３'エキソヌクレアーゼ(エキソヌクレアーゼなど)によりリン酸化された鎖を優先的に分解させることを含む。一本鎖ＤＮＡ分子を生成するため、他の方法はまたホスホロチオエート誘導体のヌクレアーゼ耐性の性質を活用している(ベンコビッチ(Ｂenkovic)ら、米国特許第４,５２１,５０９号；１９８５年６月４日)；セイヤーズ(Ｓayers,Ｊ.Ｒ.) ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１６：７９１〜８０２(１９８８)；エックスタイン(Ｅc kstein,Ｆ.)ら、Ｂiochemistry １５：１６８５〜１６９１(１９７６)；オット( Ｏtt,Ｊ.)ら、Ｂiochemistry ２６：８２３７〜８２４１(１９８７))。最も好ましくは、そのような一本鎖分子はニキホロフ(Ｎikiforov,Ｔ.)により記載された方法(米国特許出願第０８／００５,０６１号、本明細書に参照のため引用する)を用いて生成されるであろう。簡単に説明すると、これら方法では、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド誘導体を用い、かかる誘導体を天然に存在するヌクレオチドの代わりに化学合成または酵素的手段によりプライマー分子またはその伸長生成物中に組み込む。適当なヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドのリン酸残基の１または２の非架橋酸素原子を、たとえば硫黄含有基(とりわけ、ホスホロチオエート)、アルキル基(とりわけ、メチルまたはエチルアルキル基)、窒素含有基(とりわけ、アミン)、および／またはセレン含有基で置換した誘導体が挙げられる。ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド誘導体(たとえば、ヌクレオシド５'−Ｏ−１−チオ三リン酸)は、最も好ましいヌクレオチド誘導体である。かかるホスホロチオエート誘導体を生成するため、種々の化学的方法のいずれをも用いることができる(たとえば、ゾン(Ｚon,Ｇ.)ら、Ａnti−Ｃan c.Ｄrug Ｄes .６：５３９〜５６８(１９９１)；キム(Ｋim,Ｓ.Ｇ.)ら、Ｂiochem .Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun .１７９：１６１４〜１６１９(１９９１)；ヴ(Ｖu,Ｈ.) ら、Ｔetrahedron Ｌett.３２：３００５〜３００８(１９９１)；テイラー (Ｔaylor,Ｊ.Ｗ.)ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.１３：８７４９〜８７６４(１９８５) ；エックスタインら、Ｂiochemistry １５：１６８５〜１６９１(１９７６)；オットら、Ｂiochemistry ２６：８２３７〜８２４１(１９８７)；ルードビッヒ( Ｌudwig,Ｊ.)ら、Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.５４：６３１〜６３５(１９８９)、すべて本明細書に参照のため引用する)。重要なことに、上記選択されたヌクレオチド誘導体は、インビトロのプライマー媒体伸長に適していなければならず、該誘導体が組み込まれた核酸分子の領域にヌクレアーゼ耐性を付与するものでなければならない。最も好ましい態様においては、該誘導体は、二本鎖ＤＮＡをその５'端から攻撃するエキソヌクレアーゼ(５'→３'エキソヌクレアーゼ)に対して耐性を付与するものでなければならない。そのようなエキソヌクレアーゼの例としては、バクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ(「Ｔ７エキソヌクレアーゼ」)およびバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ(「エキソヌクレアーゼ」)が挙げられる。Ｔ７エキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両者ともホスホロチオエート結合の存在によって有意の程度に阻害され、両鎖の一方の選択的な分解が可能となる。しかしながら、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体の結合の存在によって活性が影響を受けることを条件として、いかなる二本鎖特異的な５'→３'エキソヌクレアーゼをも用いることができる。ホスホロチオエート誘導体を用いる場合に好ましい酵素はＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼであり、該エキソヌクレアーゼはＴａｑポリメラーゼを含む多くのＤＮＡ依存性ポリメラーゼ緩衝液について使用した同じ緩衝液で最大の酵素活性を示す。ホスホロチオエート誘導体を含有するＤＮＡ分子の５'→３'エキソヌクレアーゼ耐性の性質は、たとえば、クンケル(Ｋunk el,Ｔ.Ａ.)のＮucleic Ａcids and Ｍolecular Ｂiology、第２巻、１２４〜１３５(エックスタインら編)、スプリンガー−フェアラーク、ベルリン(１９８８) において論じられている。ホスホロチオエートヌクレオチドを含有する核酸分子の３'→５'エキソヌクレアーゼ耐性の性質は、パットニー(Ｐutney,Ｓ.Ｄ.)らのＰroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. (ＵＳＡ)７８：７３５０〜７３５４(１９８１)およびグプタ(Ｇupta,Ａ.Ｐ.)らのＮucl.Ａcids Ｒes.１２：５８９７〜５９１１(１９８４) に開示されている。Ｄ．固定化法リンカーまたはプライマーオリゴヌクレオチドを固相支持体に固定化するため、種々の方法のいずれをも用いることができる。その後にハイブリダイゼーションベースのアッセイに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーのかかる固定化を達成するのに最も広く用いられる方法の一つは、これら固相をストレプトアビジンまたはアビジンで非共有結合によりコーティングし、ついでビオチン化したオリゴヌクレオチドを固定化することからなる(ホルムストロム(Ｈolmstrom ,Ｋ.)ら、Ａnal.Ｂiochem.２０９：２７８〜２８３(１９９３))。他の最近の方法(ラニング(Ｒunning,Ｊ.Ａ.)ら、ＢioＴechniques ８：２７６〜２７７(１９９０)；ニュートン(Ｎewton,Ｃ.Ｒ.)ら、Ｎucl.Ａcids Ｒes.２１：１１５５〜１１６２(１９９３))は、ポリスチレンまたはガラス固相をポリ−Ｌ−Ｌｙｓまたはポリ−Ｌ−Ｌｙｓ,Ｐｈｅで前以てコーティングし、ついで２官能性の架橋剤を用いてアミノ−またはスルフヒドリル−修飾したオリゴヌクレオチドを共有結合させることを必要とする。両方法とも、修飾したオリゴヌクレオチドの使用並びに固相の前処理を必要とするという欠点を有する。他の刊行された方法(カワイ(Ｋawai,Ｓ.)ら、Ａnal.Ｂiochem.２０９：６３〜６９(１９９３))では、短いオリゴヌクレオチドプローブを一緒にライゲートしてマルチマーを生成させ、これらをライゲートしてファージミド(phagemid)ベクターとする。これら一本鎖の形態のファージミドをインビトロ増幅および単離した後、ポリスチレンプレート上に固定化し、２５４ｎｍにてＵＶ照射して固定させる。ついで、このようにして固定化されたプローブを用いてビオチン化ＰＣＲ生成物を捕捉および検出する。短い５'リン酸化されたプライマーの化学修飾されたポリスチレンプレート(「コバリンク(Ｃovalink)」プレート、ヌンク(Ｎunc))への直接共有結合法もまた刊行されている(ラスムッセン(Ｒasmussen,Ｓ.Ｒ.)ら、Ａnal.Ｂiochem.１９８：１３８〜１４２(１９９１))。修飾したオリゴヌクレオチトと固相表面との間の共有結合は、水溶性のカルボジイミドを用いた縮合により導入される。この方法は、オリゴヌクレオチドの５'リン酸を介して５'結合が優勢に生成することを確実にしていると主張されている。しかしながら、この方法は特別に調製した高価なプレートを必要とする。最も好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドの固定化は、市販のポリスチレンマイクロウエルプレート(ＥＬＩＳＡプレート)や顕微鏡ガラススライド(ニキホロフおよびクナップ、米国特許出願第０８／１６２,３９７号、本明細書に参照のため引用する)を前処理する必要なく直接使用することのできる方法を用いて行う。ＥＬＩＳＡ試験では９６ウエルのポリスチレンプレートが広く用いられているので、その後のハイブリダイゼーションアッセイのためにこれらプレートのウエルに短いオリゴヌクレオチドプライマーを固定化する方法を開発することに顕著な関心がもたれてきた。同様に関心がもたれているのは、顕微鏡ガラススライドへの固定化法である。なぜなら、これはいわゆるスライドイムノエンザイマテイックアッセイ(Ｓlide Ｉmmunoenzymatic Ａssay；ＳＩＡ)に用いられるからである(デ・マカリオ(de Ｍacario,Ｅ．Ｃ.)ら、ＢioＴechniques ３：１３８〜１４５(１９８５))。固相支持体はガラス、プラスチック、紙などであってよい。支持体はビーズ、ディップスティック(dipstick)、試験管、または他の種々の形状として形成することができる。好ましい態様において、支持体は複数のウエルを有するマイクロタイターディッシュであろう。診断研究所および組織培養に用いられる従来の９６−ウエルマイクロタイターディッシュは好ましい支持体である。かかる支持体を用いることにより、多数の試料およびコントロールを同時に測定することが可能となり、それゆえ分析が容易になる。そのようなマイクロタイターディッシュに試薬を供給するために自動化デリバリーシステムを用いることができる。同様に、分光光度法を用いて多型部位を解析することができ、そのような解析は自動分光光度計を用いて行うことができる。本発明に従い、親水性の表面を有することを条件として、多くの市販のあらゆるポリスチレンプレートを固定化に直接用いることができる。適当なプレートの例としては、イムロン(Ｉmmulon)４プレート(ダイナテック(Ｄynatech))およびマキシソープ(Ｍaxisorp)プレート(ヌンク)が挙げられる。プレートへのオリゴヌクレオチドの固定化は、単に適当な塩の存在下でインキュベートすることによって行う(ニキホロフおよびクナップ、ＰＣＴ出願第０８／１６２,３９７号、本明細書に参照のため引用する)。塩の不在下では、すなわちオリゴヌクレオチドが水溶液中に存在する場合にはハイブリダイゼーションは起こらない。適当な塩の例は、５０−２５０ｍＭＮａＣｌ；３０−１００ｍＭ１−エチル−３−(３'−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ )、ｐＨ６.８；５０−１５０ｍＭオクチルジメチル−アミン塩酸塩、ｐＨ７.０；５０−２５０ｍＭテトラメチルアンモニウムクロライドである。固定化は、好ましくは室温で３〜２４時間インキュベートすることにより行う。かかるインキュベーションの後、プレートを好ましくは１５０ｍＭＮａＣｌおよび０.０５重量％のツイーン２０を含有する１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.５の溶液(ＴＮＴｗ)で洗浄する。後者の成分は、その後のハイブリダイゼーション工程の過程でオリゴヌクレオチドの非特異的な結合が起こらないように、ポリスチレン表面上に依然として存在するすべての遊離のオリゴヌクレオチド結合部位をブロックするうえで重要な役割を果たす。放射性標識されたオリゴヌクレオチドを用いることにより、ウエル当たりに固定化されたオリゴヌクレオチドの量は少なくとも５００フィコモルと決定された。オリゴヌクレオチドはプレートの表面上に充分な安定性にて固定化されているので、０.５ＭＮａＯＨ溶液で上昇温度にて長期間インキュベーションすることによってのみ除去することができる。プレートを水、ＴＮＴｗ(ツイーン２０)、ＰＢＳ、１.５ＭＮａＣｌ、その他類似の溶液で洗浄することによってはオリゴヌクレオチドは除去されない。この結合法は極めて簡単であり、あらゆるオリゴヌクレオチドで行うことができ、その相補的な配列へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を保持している。マイクロタイタープレートに加え、オリゴヌクレオチドは顕微鏡スライドやシリコンチップなどの小型フォーマットに固定化することができる。オリゴヌクレオチドはまた、インク−ジェットプリンティングや写真平板などの技術を用い、これらのフォーマットに特定のパターンで適用することもできる。これら小型フォーマット中のパターンの検出は、蛍光標識したヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよび蛍光顕微鏡などの装置を用いて光学的方法により行うことができる。Ｅ．反応成分および反応条件本発明は、その最も好ましい態様において、一つのオリゴヌクレオチドを固相支持体上に固定化した不均一相アッセイを包含する。３つの好ましい変種またはフォーマットを用いることができ、これらはいずれも同様に首尾よく行える。これらは、(ａ)標識ｄＮＴＰを非標識リンカーオリゴヌクレオチドおよび非標識プライマーオリゴヌクレオチドとともに用いること(図１)；(ｂ)標識プライマーオリゴヌクレオチドを非標識リンカーオリゴヌクレオチドおよび非標識ｄＮＴＰとともに用いること(図２)；(ｃ)標識リンカーオリゴヌクレオチドを非標識プライマーオリゴヌクレオチドおよび非標識ｄＮＴＰとともに用いること(図３)である。オリゴヌクレオチドの順序は変えることができるが、伸長の方向は、ポリメラーゼによって決定されるように常に３'から５'方向である。ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーションはまた溶液中でも行うことができ、ライゲートしたオリゴヌクレオチドを検出のため固相上に捕捉させる(図４)。固定化されたオリゴヌクレオチドは、該分子を相補的な分子に安定かつ特異的にハイブリダイズさせるに充分な長さである。本明細書において「安定な」ハイブリダイゼーションとは、それ以下の温度で探索アッセイを行う温度(一般に２０〜４０℃)よりも高いＴｍを有するハイブリダイゼーションをいう。「特異的な」ハイブリダイゼーションとは、ハイブリダイゼーションに関与するオリゴヌクレオチドの長さおよび／または配列の複雑さが所望でない偽のハイブリダイゼーション(たとえば、部分的にのみ相補的な配列間で起こるであろうように)を排除するに充分であることをいう。ハイブリダイゼーションは、通常、１.５ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＥＤＴＡを含む溶液中、室温にて１５〜３０分間行う。他のハイブリダイゼーション条件も別法として用いることができる。固定化するオリゴヌクレオチドの配列は、探索すべき多型の多型部位の両側に存在する不変領域にハイブリダイズするように選択する。好ましい態様において、固定化されるオリゴヌクレオチドは、３'端にて固相支持体に繋ぎ留められるリンカーである。この態様におけるリンカーオリゴヌクレオチドは、組み込まれるヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを固相に連結させる(伸長およびライゲーション後に)働きをする。ついで、標的配列(多型を含有する)および第二のオリゴヌクレオチドの両方の存在下で反応を行う。該第二のオリゴヌクレオチドの配列は、固定化されたオリゴヌクレオチドと該第二のオリゴヌクレオチドがともに同じ標的分子にハイブリダイズしたときに、該プライマーオリゴの３'端と該リンカーオリゴヌクレオチドの５'端とが該多型の可変ヌクレオチド部位(Ｘ)の正確に反対側に位置する単一の塩基の「空隙」により隔てられるように選択される。ＤＮＡの一つの標識した２'−デオキシヌクレオシド５'三リン酸を３つの非標識ｄＮＴＰとともに反応液に加える。これにより、反応液中のすべてのプライマー分子が伸長され、ライゲートされる。単一を越えるヌクレオチドのプライマー末端への組み込みを防ぎ、鎖置換(strand replacement)もまた潜在的に回避されるように、非標識ヌクレオシド三リン酸はまたジデオキシヌクレオシド三リン酸であってもよい。これはＧＢＡ^TMとは異なるが、それはＧＢＡ^TMが伸長の過程でｄＮＴＰではなくｄｄＮＴＰをプライマーに組み込むからである。ポリメラーゼが反応液中に存在し、反応条件をプライマーオリゴヌクレオチドの３'末端が単一のヌクレオチド(すなわち、多型の可変部位の反対側にあるヌクレオチド)によって伸長されるように維持する。所望のプライマー伸長は、第二のオリゴヌクレオチドが標的分子に正しくハイブリダイズした場合にのみ起こるであろう。ハイブリダイズしたプライマーオリゴヌクレオチドの伸長は空隙を「充填」し、それによってリンカーとプライマーオリゴヌクレオチドとが互いにライゲートすることが可能になる。反応液中にリガーゼが存在すると、隣接するオリゴヌクレオチドが連結される。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、熱安定性ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼを含む種々のリガーゼを用いることができる。ライゲーション後、固相支持体に結合しなかった核酸を除去するために反応容器を洗浄するかまたはその他の処理を行う。理解されるであろうように、ライゲート可能な基質は、標的分子が第一および第二のオリゴヌクレオチドと確かにハイブリダイズし、第二のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって適切に伸長された場合にのみ生成される。かかるライゲーションの結果、それまでは繋ぎ留められていなかったプライマーオリゴヌクレオチドが固定化される。それゆえ、プライマーオリゴヌクレオチドは標識ヌクレオチドにより伸長され、標識が固定化される結果となるであろう。重要なことに、このような固定化は多型部位Ｘの反対側に相補的なヌクレオシドが組み込まれることに依存する。それゆえ、標識の固定化は、反応液に加えたヌクレオシド三リン酸が多型部位の可変ヌクレオシド三リン酸に相補的であったことを明らかにする。好ましい態様において、リンカーオリゴヌクレオチドのみが特定の標的分子にライゲートした場合にはライゲート可能な基質は生成されず、(ヌクレオチドの)標識は固定化されない。同様に、好ましい態様において、プライマーオリゴヌクレオチドのみが標的分子にハイブリダイズした場合には固定化は起こらず、標識分子は洗浄によって失われてしまうであろう。第二の態様においては、固定化されるオリゴヌクレオチドは、その３'端によって固相支持体に繋ぎ留められたリンカーである。反応は上記と同様にして行うが、標識はプライマーオリゴヌクレオチドの５'端に存在する(図２)。第三の態様においては、固定化されるオリゴヌクレオチドは、その５'端によって固相支持体に繋ぎ留められたプライマーである。反応は上記と同様にして行うが、標識はリンカーオリゴヌクレオチドの３'端に存在する(図３)。第四の態様においては、ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーションを溶液中で行い、ライゲートしたオリゴヌクレオチドを検出のため固相上に捕捉させる(図４)。第五の態様においては、ハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーションを溶液中で行い、ライゲートしたオリゴヌクレオチドを溶液中で検出する。本発明の方法に従い、従来より用いられている放射性同位元素標識、酵素標識、蛍光標識または化学ルミネセンス標識のいずれも用いることができる。そのような標識の代わりに、ビオチンなどのハプテン標識、またはリガンド、抗原などの他の標識を用いることができる。適当な標識は、たとえば、クリルスキー(Ｋour ilsky)ら(米国特許第４,５８１,３３３号)、アルバレラ(Ａlbarella)ら(ＥＰ１４４９１４号)、シェルドン(Ｓheldon III)ら(米国特許第４,５８２,７８９号) 、アルバレラら(米国特許第４,５６３,４１７号)、およびミヨシ(Ｍiyoshi)ら( ＥＰ１１９４４８号)によって論じられている。好ましい態様において、反応液には単一の標識ヌクレオシド三リン酸および３つの非標識ヌクレオシド三リン酸が含まれるであろう。該標識ヌクレオシドが前以て選択した部位のヌクレオチドに相補的であるなら、上記方法に従って第二のプライマーオリゴヌクレオチドが固定化されるであろう。それゆえ、洗浄後に固相支持体上に保持される標識を検出することによって、該前以て選択された部位のヌクレオチドの同一性が決定される。本発明のリガーゼ／ポリメラーゼ媒体された多型探索法は、上記で論じたＧＢＡ^TM法の改良法である。ＧＢＡ^TMプライマーの約１５〜２０％が、鋳型の不在下でさえもある種のｄｄＮＴＰの組み込みを行う(鋳型非依存性のノイズ)。この鋳型非依存性のノイズは、ポリメラーゼによって伸長しうる自己相補的な配列がプライマー分子内に存在することによるものである。この鋳型非依存性のノイズは、２つの方法のいずれかにより、鋳型の存在下で減少させ、最小にすることができる。第一に、鋳型非依存性の伸長が多型のタイプ分けを妨害しない塩基によって行われるように、鋳型として働き特定のｄｄＮＴＰの組み込みを行う塩基を異なる塩基で置換することができる。このことは、２対立遺伝子座で可能である。第二に、プライマー内の特定の塩基を非塩基の１,３−プロパンジオールリンカーで置換することができ、これはポリメラーゼがいずれの塩基からも伸長させるのを妨害するであろう。それゆえ、ＧＢＡ^TMは正確な結果を生み出すけれども、鋳型非依存性の組み込みを生じにくい方法が非常に望まれている。ＧＢＡ^TMはまた、鋳型依存性のノイズも生じるが、これは多型部位のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドのＧＢＡ^TMプライマーへの組み込みである。鋳型依存性のノイズは幾つかの要因により引き起こされ得る。第一に、ＧＢＡ^TMプライマーは非特異的にハイブリダイズすることがあり、それによって関係のない位置での標識ｄｄＮＴＰの組み込みを起こさせる。第二に、ＧＢＡ^TMプライマーはポリメラーゼ伸長工程の過程で鋳型に沿って数塩基スライドすることがあり、この場合も関係のない塩基の組み込みを起こさせる。第三に、たとえ上記原因が排除されたとしても、ポリメラーゼは比較的高率で組み込みの誤りを起こし得る。この率は、天然のｄＮＴＰ基質を用いた場合よりも伸長工程で用いた非天然の標識ｄｄＮＴＰの場合の方が高いと予測される。 II．遺伝子解析におけるＳＮＰのリガーゼ／ポリメラーゼ媒体探索の使用Ａ．遺伝子解析に単一ヌクレオチド多型を使用することについての一般的考察本発明の多型部位の有用性は、所定の多型に関して２人の個体が同じ対立遺伝子を有する統計学的蓋然性を予測するために該部位を使用することができることに由来する。かかる統計学的分析は、種々の目的に用いることができる。特定の動物を以前に試験しておいた場合に、かかる試験をある動物が該特定の動物であるか否かを決定する「指紋」として用いることができる。推定の一方の親または両方の親を試験した場合には、本発明の方法はある特定の動物が該親の子孫であるか否かの見込みを決定するのに用いることができる。それゆえ、ＳＮＰの検出および分析は、特定の個体について雄の父性(特定の子馬に対する雄馬の父性など)を排除するため、または特定の個体が選択された雌の子孫である(特定の子馬および選択された雌馬)蓋然性を評定するのに用いることができる。一組の同種(ヒト、ウマなど)の個体、または一組の密接に関連する種の個体において検出された多型を分析することにより、特定の多型の存在または不在が特定の体質と相関関係を有するかどうかを決定することができる。かかる多型分析を行うため、一組の個体について一組の多型(すなわち、「多型アレイ」)の存在または不在を決定する。これら一組の個体のある者は特定の体質を示し、また別のある者は相互に排他的な特性(たとえば、ウマに関しては、脆い骨ｖｓ脆くない骨；成体期発症性盲目ｖｓ盲目なし；喘息または心血管系疾患に対する素質ｖｓかかる素質のないこと)を示す。ついで、これら一組の各多型の対立遺伝子を調べ、特定の対立遺伝子の存在が興味のもたれる特定の体質と関連があるかどうかを決定する。そのような相関関係により、個々の種の遺伝子地図が定められる。ある特定の体質に関してランダムに分離していない対立遺伝子は、特定の動物が該特性を発現するであろう蓋然性を予測するのに用いることができる。たとえば、ある特定の多型対立遺伝子が心血管状態を示す種の成員の２０％にのみ存在するなら、その対立遺伝子を含む種のある特定の成員はかかる心血管状態を示すことに関して２０％の蓋然性を有することになる。指摘したように、この分析の予測能力は特定の多型対立遺伝子と特定の特性との連関の程度に従って増大する。同様に、この分析の予測能力は、複数の多型遺伝子座と特定の体質とを同時に分析することにより増大し得る。上記例において、第二の多型対立遺伝子もまた上記心血管状態を示す成員の２０％に存在することが見いだされたが、かかる心血管状態を示す評価した成員のすべてがこれら第一および第二の多型の特定の組み合わせを有していたなら、かかる対立遺伝子を両方含む特定の成員は心血管状態を示す非常に高い蓋然性を有することになる。複数の多型部位の検出は、かかる部位がある集団で独立に分離する頻度を定めることを可能にする。たとえば、２つの多型部位がランダムに分離するなら、これらは別の染色体上に乗っているかまたは同じ染色体上で互いに離れて存在している。逆に、有意の頻度で共に遺伝される２つの多型部位は同じ染色体上で互いに連関している。それゆえ、分離頻度を分析することによってマーカーの遺伝子地図を確立することができる。本発明は標的種の遺伝子地図の構築を容易にする。それゆえ、遺伝病、状態または体質への特定の動物(または植物)の素質を予測するため、特定の多型アレイを特定の体質と関連付けることができる。本明細書において「体質」とは、「遺伝病」、「状態」または「特性」を包含する。「遺伝病」とは突然変異によって引き起こされる病的状態をいい、それが検出できるか無症候性であるかを問わない。「状態」とは、特性(喘息、弱い骨、盲目、潰瘍、癌、心臓または心血管系の疾患、骨格−筋肉系の不具など)への素質をいう。「特性」とは、植物または動物に経済的価値を付与する属性をいう。特性の例としては、長生き、敏速さ、忍耐力、老化速度、生殖能力などが挙げられる。遺伝子地図の解像力は、それが含むマーカーの数に比例する。本発明の方法は多数の多型部位を単離することができるので、あらゆる所望の程度の解像力を有する遺伝子地図を作成するのに用いることができる。多型部位のシークエンシングは、遺伝子マッピングにおける多型部位の有用性を非常に高める。かかるシークエンシングは、染色体を「ウォーキング(walk)」することにより新たなマーカー部位の同定に用いることができるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを設計するのに用いることができる(ベンダー(Ｂen der,Ｗ.)ら、Ｊ.Ｓupra.Ｍolec.Ｓtruc.１０(補遺)：３２(１９７９)；シノールト(Ｃhinault,Ａ.Ｃ.)ら、Ｇene ５：１１１〜１２６(１９７９)；クラーク(Ｃl arke,Ｌ.)ら、Ｎature ２８７：５０４〜５０９(１９８０))。遺伝子地図の解像力は、ゲノムがマッピングされている植物または動物の他の属性の表現型に関するデータと多型分析とを組み合わせることによってさらに増大させることができる。それゆえ、特定の多型が褐色の毛髪の色とともに分離するなら、その多型は毛髪の色を担う遺伝子の近くの遺伝子座にマッピングされる。同様に、生化学的データもまた遺伝子地図の解像力を増大させるのに用いることができる。この態様においては、生化学的な決定(血清型またはイソ型など)がいずれかの多型部位とともに分離するかどうかを決定するために該生化学的な決定を調べる。かかるマッピングは、たとえば、新たな遺伝子配列を同定するため、または疾患の原因となる突然変異を同定するために用いることができる。実際、本発明のＳＮＰの同定は、相補的なオリゴヌクレオチドをＰＣＲその他の反応においてプライマーとして用い、該ＳＮＰのいずれかの側に位置する新たな遺伝子配列を単離および配列決定することを可能にする。本発明は、かかる新規な遺伝子配列を含む。かかるプライマーの使用によってクローン的に単離することのできるゲノム配列は、ＲＮＡに転写し、タンパク質として発現させることができる。本発明はまた、かかるタンパク質並びに該タンパク質に結合することのできる抗体その他の分子をも含む。巨視的な植物および動物のＳＮＰの同定に加え、本発明は微生物の遺伝子型の決定にも有用であるに違いない。一つの例は、ヒト免疫不全ウイルス１型(ＨＩＶ−１)およびＨＩＶ−２のタイピングである。感染した患者からのＨＩＶの迅速なタイピングは、潜在的なワクチンの開発およびモニタリングにおいて重要な役割を果たす。というのは、ある種のワクチンは特定のＨＩＶ株に対してのみ有効であるかもしれないからである。ＨＩＶタイピングはまた、治療の試みのモニタリングにおいて、および潜在的な処置を患者に受けさせるうえで重要である。迅速なタイピングを要するウイルスの他の例はＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)であるが、その感染源を追跡し、Ｃ型肝炎疾患の経過を予測し、適切な処置を決定するためである。細菌の遺伝子型決定の例は疫学的研究のためのマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Ｍycobacterium tuberculosis)株のタイピングであり、これをマイコバクテリウム・ボビス(Ｍycobacterium bovis)から識別し、多剤耐性株を迅速に検出するためである。本発明をその態様の一つ(ウマおよびウマの遺伝学)に関して下記に説明する。遺伝学の基本的な原理は種に関係なく適用されるので、かかる説明はヒトを含む他のいかなる種にも同様に適用することができる。それゆえ、当業者は、他のいかなる種においてもＳＮＰを分析するために上記方法を直接使用し、それによって本発明の遺伝子解析を行うだけでよい。本発明を一般的に記載したので、ウマの多型の単離および分析に関する下記例示を参照することによって本発明は一層容易に理解されるであろう。これら例示は説明のために記載するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。実施例１標識ｄＮＴＰおよび非標識ｄｄＮＴＰを用いたウマ多型の分析単一ヌクレオチドのウマ多型を探索するため、下記オリゴヌクレオチドを用いた(ｐはリン酸基を示す)。オリゴヌクレオチド＃１６５４および＃１１１２は固相伸長／ライゲーションアッセイに用いた。オリゴヌクレオチド＃１２１４および＃１２１５は、ウマゲノムＤＮＡの所望の断片を増幅するのに用いたＰＣＲプライマーであった。ＰＣＲプライマー＃１２１４は、４つのホスホロチオエート結合を導入することにより５'端において修飾した。これらは、二本鎖ＰＣＲ生成物の鎖の一方がＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼにより加水分解されるのを防ぐ働きをする。ホスホロチオエート結合は、該配列の下線残基間に位置する。ＰＣＲ増幅ＰＣＲ増幅反応におけるＤＮＡ源はウマゲノムＤＮＡであった。反応は５０μ ｌの全容量で行った。ＰＣＲプライマーの最終濃度は０.５μＭであった。９５ ℃での最初の２分間の変性工程の後、それぞれ変性(９５℃で１分間)、アニーリンク(６０℃で２分間)および伸長(７２℃で３分間)からなるサイクルを３５サイクル行った。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはパーキン−エルマー(Ｐerkin−Ｅlmer )から入手し、０.０２５単位／μｌの濃度で使用した。ＰＣＲ緩衝液の最終組成は、１.５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.３および２００μｇ／ｍｌＢＳＡであった。一本鎖ＰＣＲ生成物の調製二本鎖ＰＣＲ生成物の鎖の一方をエキソヌクレアーゼ加水分解から保護するため、４つのホスホロチオエート結合を合成の段階でＰＣＲプライマーの一つ(＃１２１４)の５’端に導入した。一本鎖ＰＣＲ生成物を生成させるため、ＰＣＲ増幅後にＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを２単位／μｌＰＣＲ反応液の最終濃度にて加えた。インキュベーションを室温にて１時間行った。Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼはＵＳＢから購入し、製造業者によって推奨された緩衝液中に希釈した。マイクロタイタープレート中に固定化されたオリゴヌクレオチドへの一本鎖ＰＣＲ断片のハイブリダイゼーションエキソヌクレアーゼ処理後、等容量の３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡを反応混合物に加え、得られた溶液の２０μｌアリコートを固定化オリゴヌクレオチド＃１６５４を含む各ウエルに移した。このハイブリダイゼーション溶液に１．５ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマー＃１１１２を加えた。ハイブリダイゼーションを室温にて３０分間行い、ついでＴＮＴｗで洗浄した。伸長／ライゲーション反応伸長／ライゲーション混合物は下記成分を有していた：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５；１０ｍＭＭｇＣｌ₂；２５ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭＡＴＰ；０.６５単位／ウエルのシークエナーゼおよび０.４単位／ウエルのＴ４ＤＮＡリガーゼ。加えて、幾つかのウエルには３０μＭのビオチン−１４−ｄＣＴＰ(ギブコ−ＢＲＬ(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ)より入手)および各３０μＭの他のｄｄＮＴＰが含まれていた。他のウエルには３０μＭのビオチン−ｄＣＴＰ(ギブコ−ＢＲＬ)および各３０μＭの他のｄｄＮＴＰが含まれていた。伸長／ライゲーション反応を室温にて１５分間行い、ついでウエルを０.１ＮＮａＯＨで洗浄して固定化オリゴヌクレオチドに共有結合しなかった分子をすべて除去した。その後、１％ＢＳＡを含むＴＮＴｗ中の抗−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体 (ベクター・ラボラトリーズ(Ｖector Ｌaboratories))の１：１２００希釈とともに室温にて３０分間ウエルをインキュベートした。プレートをＴＮＴｗで６回洗浄し、ついで１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン(ＯＰＤ)および０.０１２％Ｈ₂Ｏ₂を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４.５)の溶液を加えた。プレートを直ちにプレートリーダーで読み取り、発色を４５０ｎｍにて２分間追跡した。３頭の異なるウマから得られた結果(ｍＯＤ／分として示す)を表１にまとめて示す。表１に示す結果は、この多型遺伝子座については、ウマ＃１５３４はＣホモ接合であり、ウマ＃８６６はＣＴヘテロ接合であり、ウマ＃５２７はＴホモ接合であることを示している。実施例２非標識のｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰおよび標識したオリゴヌクレオチドリンカー分子を用いた単一ヌクレオチド多型のリガーゼ／ポリメラーゼ媒体されたジェネティック・ビット^TMアナリシス使用したオリゴヌクレオチドは下記の通りである(Ｆ１はフルオレセイン残基を示す)：この実験ではオリゴヌクレオチド＃１３７６を合成鋳型として用いた。このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマー＃７１３−１および標識リンカー分子＃１４０１の両方にハイブリダイスする。＃１３７６の配列中の下線塩基はモデル単一ヌクレオチド多型として働く。オリゴヌクレオチドプライマー＃７１３−１を９６ウエルポリスチレンプレート(イムロン４、ダイナテック)のウエルに固定化した。このプライマーは標識オリゴヌクレオチド＃１４０１の存在下で合成鋳型分子＃１３７６にハイブリダイズした。下記量の＃１３７６を用いた：ウエル当たり２５０および５００フィコモル。オリゴヌクレオチド＃１４０１は過剰に用いた(ウエル当たり１.５ピコモル)。ハイブリダイゼーションは上記実施例１と同様にして行った。プレートを洗浄し、上記のようにして伸長／ライゲーション反応を行ったが、非標識ヌクレオチド(濃度はすべて３０μＭ)のみの存在下で行った。下記４つのヌクレオチド混合物を用いた：ｄＡＴＰプラスｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰ；ｄＣＴＰプラスｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ；ｄＧＴＰプラスｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰ；ｄＴＴＰプラスｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰ。伸長／ライゲーション反応後、固定化オリゴヌクレオチドに共有結合しなかったすべての分子を除去するためプレートを０.１ＮＮａＯＨで洗浄した。ついで、１％ＢＳＡを含むＴＮＴｗ中に１：５００希釈した抗フルオレセイン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(デュポン(ＤuＰont))を用い、ウエル中のフルオレセインの存在を室温にて３０分間検出した。酵素検出は実施例１の記載と同様にして行った。その結果を表２にまとめて示す。コントロールとして同様の反応を行ったが、伸長混合物からポリメラーゼを除いた。これら結果を表３に示す。これら結果から、多型塩基の性質がＣであることが明らかになった。実施例３標識ｄＮＴＰおよび非標識ｄＮＴＰを用いたウマ多型の分析特定のウマ多型を探索するため、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。これら分子は下記配列を有していた。オリゴヌクレオチド＃１３５７は３'端および５'端の両方がリン酸化されていた。オリゴヌクレオチド＃７１３は末端リン酸基を欠いていた。Ｎ−エチル−Ｎ’−(３−ジメチルアミノ)プロピルカルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)を用い、オリゴヌクレオチド＃１３５７を９６ウエルポリスチレンプレートのウエルに結合させた。洗浄して未結合物質を除去した後、約２５０フィコモルの増幅した５５ｂｐのウマゲノム配列を加えた。このウマ配列はウマゲノムＤＮＡからＰＣＲにより製造したものであった。この増幅生成物は下記配列を含んでいた。ハイブリダイゼーションを１.５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ中、室温にて３０分間行った。ハイブリダイゼーション工程にはまた１ピコモルの第二のオリゴヌクレオチド(＃７１３)も含まれていた。両オリゴヌクレオチド(＃７１３および＃１３５７)はＰＣＲ生成物にハイブリダイズし、配列番号：１０の残基Ａ２６の反対側に位置する正確に一つの塩基の空隙を＃７１３の３'端と＃１３５７の５'端との間に残した。ハイブリダイゼーション工程の後、プレートを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体を含むウエルを下記組成の伸長−ライゲーション混合物とともにインキュベートした：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５；１０ｍＭＭｇＣｌ²；２５ｍＭＮａＣｌ；１０ｍＭＤＴＴ；１ｍＭＡＴＰ；０.６５単位(ウエル当たり)のシークエナーゼ^TM；０.４単位(ウエル当たり)のＴ４ＤＮＡリガーゼ。加えて、幾つかのウエルには３０μＭのビオチン−１４−ｄＡＴＰ(ギブコ− ＢＲＬより入手)および各３μＭの他の３つのｄＮＴＰが含まれていた。他のウエルには３０μＭのビオチン−２１−ｄＵＴＰ(クローンテック(Ｃlontech)より入手)および３０μＭの他の３つのｄＮＴＰが含まれていた。伸長／ライゲーション反応を室温にて１５分間行った。ウエルを１ＮＮａＯＨで洗浄し、ついで、抗−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体の希釈液とともにインキュベートした。洗浄後、動力学モードのマイクロプレートリーダーを用い、Ｈ₂Ｏ₂ およびｏ−フェニレンジアミン塩酸塩を用いて酵素の存在を検出した。ビオチン化ｄＴＴＰを含むウエルは１６８ｍＯＤ／分の値を与えた。ビオチン化ｄＡＴＰを含むウエルは７.８ｍＯＤ／分の値を与えた。それゆえ、これら２つのオリゴヌクレオチド間の空隙は標識Ｔで充填され、それゆえ反対鎖をＡとして同定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゴレット，フィリップアメリカ合衆国21030メリーランド、クッキーズビル、ウエスタン・ラン・ロード 301番

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸分子中の前以て選択した単一ヌクレオチド長部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定する方法であって、工程：（Ａ）プライマーオリゴヌクレオチドかまたはリンカーオリゴヌクレオチドのいずれかである第一オリゴヌクレオチドを固相支持体に固定化し、その際、該第一オリゴヌクレオチドは該標的分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、該ハイブリダイズした第一オリゴヌクレオチドの末端が該前以て選択した部位にすぐに隣接するように、該標的分子の第一の領域にハイブリダイズすることができ、（Ｂ）該固定化された第一オリゴヌクレオチドを該標的分子の存在下、およびさらにプライマーオリゴヌクレオチドかまたはリンカーオリゴヌクレオチドのいずれかである第二オリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートし、その際、該第二オリゴヌクレオチドは該標的分子の配列に相補的な配列を有し、該標的分子の第二の領域にハイブリダイズすることができ、その際、該第一の領域と該第二の領域とは該前以て選択した部位により互いに隔てられており、該インキュベーションは、該第一オリゴヌクレオチドおよび該第二オリゴヌクレオチドが標的分子にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション生成物を生成するに充分な条件下で行い、該ハイブリダイゼーション生成物は、該第一および第二オリゴヌクレオチドが単一のヌクレオチドの空隙により互いに隔てられており、該空隙は該前以て選択した部位の反対側にあり、（Ｃ）該ハイブリダイゼーション生成物をポリメラーゼ、リガーゼ、および少なくとも一つのヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸混合物の存在下でさらにインキュベートし、その際、該インキュベーションは、該第一または第二のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのいずれかの３'末端に該ヌクレオシド三リン酸を鋳型依存でポリメラーゼ媒体されて組み込むことを可能にするに充分な条件下で行い、それによって該ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の空隙を充填させ、該オリゴヌクレオチドを隣接させ、該組み込みは該前以て選択した部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸を該ヌクレオシド三リン酸混合物が含有しているか否かに依存し、（Ｄ）リガーゼにより隣接する第一または第二のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの対をライゲートさせ、（Ｅ）該固定化された第一オリゴヌクレオチドを、非共有結合により結合した標的または第二オリゴヌクレオチドを該第一オリゴヌクレオチドから分離するに充分な条件下でさらにインキュベートし、ついで（Ｆ）該前以て選択した部位の該ヌクレオチドの同一性を決定するからなることを特徴とする方法。２．該第一および第二オリゴヌクレオチドおよび該標的分子がＤＮＡ分子である請求項１に記載の方法。３．該第一および第二オリゴヌクレオチドおよび該標的分子がＲＮＡ分子である請求項１に記載の方法。４．該ポリメラーゼが逆転写酵素であり、該リガーゼがＲＮＡリガーゼである請求項３に記載の方法。５．工程Ａにおいて該第一オリゴヌクレオチドがリンカーオリゴヌクレオチドであり、該第一オリゴヌクレオチドの３'末端が該固相支持体に固定化され、工程Ｃにおいて該条件が該第二のハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの３'末端への該ヌクレオシド三リン酸の組み込みを可能とするものであり、該第二オリゴヌクレオチドがプライマーオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。６．工程Ｃにおいて該ヌクレオシド三リン酸混合物が少なくとも１の検出可能に標識されたヌクレオシド三リン酸を含み、他の非標識ヌクレオシド三リン酸がデオキシヌクレオシド三リン酸かまたはジデオキシヌクレオシド三リン酸のいずれかである、請求項２に記載の方法。７．該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識である、請求項６に記載の方法。８．工程Ｆにおいて該前以て選択した部位の該ヌクレオチドの同一性の決定を、該ヌクレオチドの固定化された標識を検出することにより行う、請求項６に記載の方法。９．該第二オリゴヌクレオチドがプライマーオリゴヌクレオチドであり、工程Ｂにおいて該第二オリゴヌクレオチドが検出可能に標識されており、ヌクレオシド三リン酸のすべてが標識されていない、請求項２に記載の方法。１０．該検出可能な標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、または化学ルミネセンス標識である、請求項９に記載の方法。１１．工程Ｆにおいて、該前以て選択した部位の該ヌクレオチドの同一性を、工程Ｃに用いたデオキシヌクレオチド三リン酸およびジデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物から推定する、請求項９に記載の方法。１２．該第一オリゴヌクレオチドがプライマーオリゴヌクレオチドであり、工程Ａにおいて該第一オリゴヌクレオチドの５'末端が該固相支持体に固定化され、工程Ｃにおいて該条件が該固定化オリゴヌクレオチドの３'末端への該ヌクレオシド三リン酸の組み込みを可能とするものである、請求項１に記載の方法。１３．該第二オリゴヌクレオチドがリンカーオリゴヌクレオチドであり、該第二オリゴヌクレオチドがその３'端で検出可能に標識されている、請求項１２に記載の方法。１４．工程Ｆにおいて、該前以て選択した部位の該ヌクレオチドの同一性を、工程Ｃに用いたデオキシヌクレオチド三リン酸およびジデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物から推定する、請求項１３に記載の方法。１５．該標的分子が多型を含み、該前以て選択した部位が該多型の可変ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。１６．該標的分子が、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、およびヒトよりなる群から選ばれた動物から得られたものである、請求項１５に記載の方法。１７．該標的分子が動物の核酸からインビトロで増幅される、請求項１５に記載の方法。１８．該動物が、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、およびヒトよりなる群から選ばれる請求項１７に記載の方法。１９．該標的分子が植物から得られたものである請求項１５に記載の方法。２０．該標的分子が植物の核酸からインビトロで増幅される、請求項１５に記載の方法。２１．該標的分子が、ウイルス、細菌、酵母または真菌から得られたものである請求項１５に記載の方法。２２．該標的分子がウイルス、細菌、酵母または真菌の核酸からインビトロで増幅される、請求項１５に記載の方法。２３．該第一オリゴヌクレオチドが特定の巨大分子に対して高親和性を有するリガンドで標識され、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行い、工程Ｅをライゲートしたオリゴヌクレオチドを該特定の巨大分子を用いて最初に固相に捕捉させることにより行う、請求項１に記載の方法。２４．該第一オリゴヌクレオチドが、該第二オリゴヌクレオチドへのライゲーションの溶液中での検出を可能とするように修飾されており、工程Ａ〜Ｄを溶液中で行い、ライゲートした第一および第二オリゴヌクレオチドを検出することを含む、請求項１に記載の方法。