WO2004072302A1

WO2004072302A1 - 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法

Info

Publication number: WO2004072302A1
Application number: PCT/JP2004/001588
Authority: WO
Inventors: Mitsugu Usui; Toshihiko Fujikawa
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2004-08-26
Also published as: JP4351210B2; EP1593746B1; AU2004212083A1; KR20050103904A; EP1593746A1; EP1593746A4; CN1745180A; JPWO2004072302A1; CA2515734C; KR101050510B1; CA2515734A1; US20060035235A1; CN1745180B; AU2004212083B2

Abstract

高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法やＰＣＲ法を用いないため、元のＲＮＡの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

Description

発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法技術分野

本発明は、発現遺伝子検出のた明めのシグナル増幅方法に関し、更に詳しくは、オリゴヌクレオチドによる自己集合反応を利用して、検出感度を向田

上させ、標的 RNAの長さ及ぴ発現量に応じて目的遺伝子を検出することができる発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法に関する。背景技術

通常、 DNAチップを用いた発現遺伝子の検出は、ポリ d Tのみを有するプライマーもしくはランダムプライマーを用い、逆転写反応により、 C y 3や C y 5等の蛍光物質でラベルした核酸を取り込ませた標識 c DNA をプローブとしている。また、微量のサンプルに対しては、リニア増幅法を用いアンチセンス RNAを合成することが一般的である（例えば、林崎良英監修、「DNAマイクロアレイ実戦マニュアル」羊土社、 2000年 1 2月 1 日、 p . 8 0— 9 0参照。）。しかし、リニア増幅法は、第 1鎖 c D NA合成後、 RN a s e H、 DNAポリメラーゼ I、 DNAリガーゼの 3 種類の酵素を用いて第二鎖 c DNAを合成し、最終的に RN Aポリメラーゼにより in vitro転写反応を行いアンチセンス RNAを増幅するという方法であるが、高額な酵素を多種用いなければならず、その上操作も非常に煩雑であるという欠点がある。また、サンプルが極微量である場合、このリニァ増幅法を複数回繰り返さなければならない。リニァ増幅法で得られたアンチセンス RNAは、元の RNAより短くなる傾向があり、もとの R N Aの長さを正確には反映していないという問題点があった。一方、本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した (例えば、米国特許第 6， 2 6 1， 84 6号公報、特許第 3 26 7 5 7 6 号公報、及ぴ欧州特許出願公開第 1， 0 0 2， 8 7 7 A号明細書参照。）。この方法は、 3個所の領域から構成される 1対のオリゴヌクレオチド (HoneyComb Probe, 以下、 HC Pと称する）を用いる方法であり、第 1 HC Pと第 2HC Pの各々の 3個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の 1個所のみとハイブリダィズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対の HC Pを反応させた場合、互いにハイブリダィズし、 HC Pの自己集合反応により集合体を开成させることができる（Probe alternation link self-assembly reaction, 以下、この H C Pの自己集合反応による集合体の形成法を P A L S AR法と称する）。発明の開示

本発明は、高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法や P CR法を用いないため、元の R N Aの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 1の態様は、逆転写反応及びオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズ（本発明では、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズを DNAチップと総称する。）における発現遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする。

本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 2の態様は、逆転写反応及ぴオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、 3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記オリゴヌクレオチド .プローブにハイブリダイズすることが可能な領域を有する第 1プローブをプライマーとして用いて mRN Aの逆転写反応を行レ、、 c DNA領域を有する第 2プローブを形成させる工程、前記 mRNA を前記第 2プローブから解離させる工程、前記第 2プローブを、標的 mR NAの c DN A領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダィズさせる工程、及び前記第 2プローブと前記オリゴヌクレオチド ·プローブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を有することを特徴とする。

上記自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を行う段階は、特に限定されないが、上記第 2プローブを上記捕捉用プローブにハイプリダィズさせる工程の後に行うことが望ましい。

上記自己集合反応として、第 1に、互いに相補的な塩基配列領域が n (n ≥ 3) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイプリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。

上記自己集合反応として、第 2に、 N o . 1及ぴ N o . 2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3，側領域、中央領域、及ぴ 5，側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3，側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相捕的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プロープを複数対含む第 1の系と、 N o . 3及ぴ N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域及ぴ 5，側領域の 2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの 3，側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第 2の系とを有し、該架橋プローブを該ダイマー形成用プロープより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイプリダイゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。

上記プローブの塩基配列を、第 1の系の N o . 1_オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1の系の N o . 2—ォリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5，側領域、第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域をそれぞれ相捕的な塩基配列とすることができる。

上記プローブの塩基配列を、第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域と第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域と第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域をそれぞれ相捕的な塩基配列とすることができる。

本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第 3の態様は、逆転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域が n (n≥ 3) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド · プローブである第 1 HC P及び第 2 HC Pの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイプリダイゼーシヨンさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DN Aチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、 3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 1プローブを mRN Aに結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、 c DNA領域及び前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 2プローブを形成させ、 mRNAを除去した後、前記第 2プローブを標的 mRNAの c D NA領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダイゼーションさせ、前記第 1 H C P及ぴ前記第 2 H C P又は前記第 2 H C Pを添加し、オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることを特徴とする。

本発明のシグナル増幅方法において、標的発現遺伝子としては、末端にポリ Aを含む mRN Aを用いることができる。

上記 DNAチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための捕捉用プロ一ブを結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極や I TO電極（indium oxide電極）などを使用することができる。

上記自己集合体に対して、標識プローブをハイプリダイゼーションさせることによりより上記自己集合体の存在を検出することができる。

上記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオァイソトープで標識した標識プローブであることが好適である。

上記自己集合体に対して、核.酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することができる。

あらかじめ自己集合体を形成するォリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することができる。

あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することができる。

あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することができる。

上記オリゴヌクレオチドは、 D N A、 R N A、 P N Aまたは L N Aのいずれかから選ばれる塩基から構成される。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の一例を示すフローチヤ一トである。

図 2は、本発明.のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 0 0を原理的に示す模式図である。

図 3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 0 2を原理的に示す模式図である。

図 4は、本発明のシダナル增幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 0 4を原理的に示す模式図である。

図 5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 0 6を原理的に示す模式図である。

図 6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 1 0を原理的に示す模式図である。

図 7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 1 2を原理的に示す模式図である。

図 8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 1の例におけるステツプ 2 1 4を原理的に示す模式図である。

図 9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステツプ 3 0 0を原理的に示す模式図である。

図 1 0は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステップ 3 0 2を原理的に示す模式図である。

図 1 1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステップ 3 0 4を原理的に示す模式図である。

図 1 2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第 2の例におけるステップ 3 ◦ 6を原理的に示す模式図である。

図 1 3は、実施例 1及ぴ比較例 1の結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。

図 1は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の一例を示すフローチヤ一トである。

図 1に示したように、まず、 3，末端にポリ d Tを有し且つ自己集合反応に用いられるオリゴヌクレオチド ·プローブの少なくとも一つとハイプリダイズすることが可能な領域を有する第 1プローブを準備する。該第 1 プローブをプライマーとして用いて、ポリ Aを含む ni R N Aに結合させ、逆転写酵素により m R N Aの逆転写反応を行い（ステップ 1 0 0 )、該第 1 W 200

8 プローブ及び該_mRNAの c DN A領域からなる第 2プローブを形成させる。上記第 1プローブの 5 ' 側の塩基配列を、上記自己集合反応に用いられるオリゴヌクレオチド ·プローブの塩基配列を少なくとも一部分有するように構成することが好適である。

次に、 mRNAを第 2プローブから解離させる（ステップ 1 02)。 mR NAを解離する方法としては、特に限定されず、例えば、熱変性、アル力リ変性、 RNa s e Hによる RNA消化等を用いた方法が挙げられる。解離後の第 2プローブを、標的 mRNAの c DN A領域に相捕的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダイズさせ、第 2プローブを捕捉させる（ステップ 1 04)。捕捉用プローブを予め支持体に結合させておくことが好ましい。

オリゴヌクレオチド .プローブを添加し、自己集合反応により、第 2プローブとハイプリダイズした自己集合体を形成させ（ステップ 106)、シグナルを増幅させることができる。

試料中に標的 mRNAが存在しない場合、第 2プローブは、捕捉用プローブと結合しないため、シグナル増幅は行われない。よって、本発明のシグナル増幅方法により標的 mRNAの存在を確認することができる。また、本発明のシグナル増幅方法は、リニア増幅法を用いないため、元の RNA の長さに対応した検出が可能であり、更に P CR法を用いないため、発現量に対応したシグナル増幅を行うことができる。

自己集合反応としては、互いに相補的な 3領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対の HC Pによる自己集合反応 (特許第 326 7576号公報、特許第 33' 1 0662号公報等参照。）を用いることができる。また、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブによる自己集合反応（特開 200 2 - 3 5 508 1号公報等参照。）を用いることも可能である。

なお、図 1においては、ステップ 1 04の後にステップ 1 06を行った場合の例を示したが、ステップ 1 04の前もしくはステップ 1 04と同時にステップ 1 06を行うことも可能である。

図 2〜図 8は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法のェ程順の第 1の例を原理的に示す模式図である。第 1の例は、自己集合反応として、予め蛍光物質 2 2で標識した一対の HC Pを用いた PAL S AR 法を利用したシグナル増幅法であり、第 1プローブ 1 2 a として、 3 ' 末端にポリ d Tを含む HC Pを用いた場合の例を示す。

図 2に示した如く、ターゲット遺伝子の mRNA 1 0 aを検出するために、第 1プローブ 1 2 a として、 3 ' 末端にポリ d Tを含み、 5 ' 側に H CPの 3領域を有するオリゴヌクレオチド ' プローブ（HC P— 1) を準備し（ステップ 20 0)、図 3に示した如く、 mRNA 1 0 aのポリ Aテール部分に 3 ' 末端にポリ（！丁を含む！！じ？一 1 (1 2 a) を結合させる（ステツプ 202)。その後、図 4に示した如く、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、 mRNAの相補配列を有する HC Pである第 2プローブ 1 4 aを作製した後（ステップ 2 04)、図 5に示した如く、 mRNA l O aを解離し、 c DNA領域とHC P領域からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドとする（ステップ 20 6)。

図 6に示した如く、支持体 1 8上にターゲット遺伝子の c DN Aと相補的な領域を持つ捕捉用プローブ 1 6 aを結合させておき（ステップ 2 1 0)、図 7に示した如く、上記形成された c DNA領域を有する HC Pである第 2プローブ 1 4 aを捕捉用プローブ 1 6 aにハイプリダイゼーションさせ (ステップ 2 1 2)、図 8に示した如く、一対のもう一方の H CP (HCP - 2) を加え、自己集合反応により自己集合体 2 0 aを形成させ（ステツプ 2 1 4)、シグナル増幅を行うことができる。なお、上記ステップ 20 6 の標的 mRNAを除去する際、 .洗浄操作を行った場合は、上記ステップ 2 1 4において、一対の HC Pを添加する必要がある。

上記第 1の例では、 HC P— 1の 3領域中の 3，側領域の一部をポリ d Tとした一対の HC Pを用いた例を示したが、 11〇卩ー 1の 3 ' 側領域を全てポリ d Tとし、 HC P— 2の 3領域中の 3 ' 側領域を全てポリ Aとした一対の HC Pを用いることもできる。

図 9〜図 1 2は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の第 2の例を原理的に示す模式図である。第 2の例は、自己集合反応として、蛍光物質で標識されていない一対の HC Pを用いた P AL S A R法を利用したシグナル増幅法であり、第 1プローブ 1 2 bとして、 3 ' 末端にポリ d Tを含み且つ HC Pの相補領域を 1つ含んでいるオリゴヌクレオチド ·プローブを用いた場合の例を示す。

図 9に示した如く、ターゲット遺伝子の mRNA 1 0 bを検出するために、第 1プローブ 1 2 bとして、 3 ' 末端にポリ d Tを含み、 5，側に H C Pの相補領域を一つ有するオリゴヌクレオチド 'プローブを準備し（ステツプ 300)、図 1 0に示した如く、 mRNA 1 0 bのポリ Aテール部分に該オリゴヌクレオチド ·プローブ 1 2 bを結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、 mRNAの相補配列を有する第 2プローブ 1 4 bを作製する（ステップ 3 0 2)。 mRNA l O bを解離し、 c DNA領域と HC P領域を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドとする。

図 1 1に示した如く、上記第 2プローブ 1 4 bを支持体 1 8に結合した捕捉用プロープ 1 6 bにハイプリダイゼーションさせ（ステップ 3 04)、図 1 2に示した如く、一対の HC Pを添加し、自己集合反応により自己集合体 20 bを形成させ（ステップ 3 0 6)、形成された自己集合体 20 bに対してインターカレーター 24等を挿入し（ステップ 3 0 8)、シグナル増幅を行うことができる。なお、ステップ 3 0 6とステップ 3 08を同時に行うことも可能である。

一対のオリゴヌクレオチド .プローブに、あらかじめ検出のための標識物質として、例えば、 I ^{1 2 5}や P ^{3 2}等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲユンゃァクリジニゥム . エステル等の発光物質や C y 3 · C y 5等の蛍光物質、 4ーメチルゥンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビォチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（F R E T ) を利用するためのドナ一蛍光色素とァクセプター蛍光色素を付加させておき、標的遺伝子を検出することも可能である。

また、核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、標的遺伝子を検出することも可能である。インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、 SYBR Green I stain、 SYBR Green ll stain、 SYBR Green Gold stain ^ vistra reen stain、 Geistar stain、 Radiant Red stain、 PicoGreen、 Eiboureen、 011Green、 Hoechst 33258 (Bis-Benzimide)、 Propidium Iodide, YO -PRO- 1 lodide YO-PRO-3 Iodide (以上、 Molecular Probes社製）、臭化工チジゥム、 Distamycin A、 TOTO、 Psoralen、ァクリジニゥムオレンジ ( Acridine Orange )、 AOAO (homodimer) 等が使用できる。

上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、通常 D N A又は R N Aで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ぺプチド核酸（P N A、例えば、国際公開第 9 2 Z 2 0 7 0 2号パンフレツト参照。）や Locked Nucleic Acid ( L N A、例えば、 Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998. 54, 3607-3630、 Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998. 120, 13252-13253、及ぴ Wahlestedt C et al. PNAS. 2000. 97, 5633-5638.参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド 'プロープは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえば DNAプローブと RNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は DNA、 RNAまたは核酸類似体（たとえば P NAや L NA等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえば DNAのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、 DNAと RNAから構成されるオリゴヌクレオチド .プローブ（キメラプロープ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。

オリゴヌクレオチド ·プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも 5塩基であり、好ましくは 1 0〜 1 00塩基、さらに好ましくは 1 5〜 30塩基である。

これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえば D N Aプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc.) の DNAシンセサイザ一 394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、 H— ホスホネート法、チォホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。

本発明は、 DNAチップで捕捉したターゲット遺伝子に対して、相補的な領域を有する一対の HC Pで自己集合体を形成させるものである。使用するオリゴヌクレオチド ·プローブの本数は特に限定されないが、 1 0²〜 10¹⁵本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。 p Hも常用の範囲で好適であり、好ましくは p H 7. 0〜9. 0の範囲のものが使用できる。反応温度は 40〜80°C、好ましくは 55〜65°Cである。

本発明における標的発現遺伝子（mRNA) 測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、カビ等の末端にポリ A鎖を含む mRN Aを持つあらゆる真核生物の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中の標的遺伝子を公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。

(実施例）

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。

以下に実施例において用いた材料を示す。

( a ) ターゲット遺伝子：培養細胞より抽出した T o t a 1 RN A

( b ) キヤプチヤープローブ（捕捉用プローブ）：

1 ) C P— 1 ： 5'-CACGAAACTACCTTCAACTCCATC-3'

2 ) C P - 2 5'-TGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3'

( c ) プライマー：

1 ) 第 1プロープ（ポリ d T— HC P) ( 7 8 m e r ) ： 5'"GCATATAGA TATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATAAC GTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

2 ) ポリ d Tプライマー ( 1 8 m e r ) : 5'-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-3'

( d ) HC P ：

1 ) HC P— 1 ( 5 ' 末端 C y 3標識、 6 0 m e r ) : 5'-Cy3"CGCCGGA GATATCTATATGCCCGGTATCACAAAGTATCCGGACGTTATAAGGGCG AACTC-3'

2 ) HC P - 2 ( 5 ' 末端 C y 3標識、 6 0 m e r ) : 5'-Cy3-GCATATA GATATCTCCGGCGCGGATACTTTGTGATACCGGGAGTTCGCCCTTATA ACGTC-3'

( e ) ポリスチレン製粒子ビーズ： 1種類の粒子ビーズに上記 2種類のキャプチヤープローブを固定したもの

(実施例 1 )

培養細胞から抽出した T o t a 1 RNAを用い、ハウスキーピング遺伝子である Beta-actinの検出を、 PAL S AR法を利用して試みた。

(1) RNAの逆転写反応及び逆転写産物の精製

上記ターゲット遺伝子、上記第 1プローブ、逆転写酵素（SuperScriptll：インビトロジェン社製）、及ぴ反応溶液（Reaction Buffer, DTT, dNTP, RNase inhibitor) を用いて逆転写反応を 37 °Cで 2時間行った。その後 6 5 °Cで 30分アルカリ処理を行い、塩酸を用いて中和した。逆転写産物で' ある c DNAを QIAquick PCR Purification Kit (Q i a g e n社製）を用いて精製した。

(2) ハイプリダイゼーシヨン

次に、 [上記得られた c DNA、上記粒子ビーズ、 6 X S S C、 0. 2 % SDS、 5 Xデンハルト溶液]の組成を、全量 5 O Lになるように調整し、 42°Cで 2時間ハイブリダィゼーシヨンを行った。終了後 0. 22μπιフィルターでろ過し、未反応プローブを除去し、 2 X S S C + 0. 1 %SD Sで 1回、 0. 2 X S S Cで 1回洗浄し上記フィルターでろ過した。

その後、 [上記得られた粒子ビーズ、上記 HCP— 1及ぴ 2 (1. 5 pm 0 1 / μ L )、 1 % Blocking Reagent ( R o c h e社製）、 0. 1 % N-lauroylsarcosine 0. 02%SD S、 5 X S S C] の組成（全量 1 00 μ L) で 65°C30分間、ハイブリダィゼーシヨンを行った。

(3) 検出

洗浄後の粒子ビーズをフローサイトメーター用シース液に再懸濁しフロ一サイトメ一ターで、 HC Pに標識されている C y 3の蛍光を測定した。

(比較例 1 )

通常行われているポリ dTプライマーによる C y 3 - dNTP取り込み 5 の系を用いてターゲット遺伝子の検出を行った。

(1) RN Aの逆転写反応及び解離反応

プライマーとして上記ポリ d Tプライマーを用い、 dNTPの他に、 C 3ラべル_£111丁（Ame r c h a m社製）を取り込ませた以外は実施例 1と同様にして逆転写反応及び逆転写産物の精製を行った。

( 2 ) ハイプリダイゼーション

次に、 [上記得られた c DNA、上記粒子ビーズ、 6 X S S C、 0. 2 % SD S、 5 Xデンハルト溶液]の組成を、全量 5 O Lになるように調整し、 42 °Cで 2時間ハイプリダイゼーシヨンを行った。終了後 0. 2 2μπιフィルターでろ過し、未反応プローブを除去し、 2 X S S C + 0. 1 %SD Sで 1回洗浄ろ過した。

(3) 検出

洗浄後の粒子ビーズをフローサイトメーター用シース液に再懸濁しフロ一サイトメ一ターで、粒子ビーズ上のキヤプチヤープローブと結合した c DNAに標識されている C y 3の蛍光を測定した。

[結果]

実施例 1及び比較例 1の結果を図 1 3に示した。蛍光強度は、各々の種類に対し 20 3から 5 04個の粒子ビーズの蛍光強度を測定しそのメジァン値を示した。図 1 3に示した如く、比較例 1と比べて実施例 1の検出感度は著しく向上した。産業上の利用可能性

以上述べた如く、本発明によれば、逆転写反応のみであるため、高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法や P C R法を用いないため、元の RNAの長さや発現量に対応した検出が可能となるという著大なる効果を奏する。

Claims

冃求の範囲

1. 逆転写反応及びオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

2. 逆転写反応及ぴオリゴヌクレオチド ·プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、

3，末端にポリ d Tを有し且つ前記オリゴヌクレオチド .プローブにハイプリダイズすることが可能な領域を有する第 1プローブをプライマーとして用いて mRNAの逆転写反応を行い、 c DNA領域を有する第 2プロ一ブを形成させる工程、

前記 m R N Aを前記第 2プローブから解離させる工程、

前記第 2プローブを、標的 mRNAの c DNA領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダィズさせる工程、及び

前記第 2プローブと前記オリゴヌクレオチド ·プローブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を有することを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

3. 前記自己集合反応が、互いに相補的な塩基配列領域が n (n≥ 3) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。

4. 逆転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域が n ( 1 ≥ 3 ) 力所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド ·プローブである第 1 HC P及び第 2 HC Pの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイプリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、 DNAチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、

3 ' 末端にポリ d Tを有し且つ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 1プローブを mRNAに結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、 c DNA領域及ぴ前記第 1 HC Pの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第 2プローブを形成させ、 mRNAを除去した後、前記第 2プローブを標的 mRNAの c D N A領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイプリダイゼーションさせ、前記第 1 HC P及び前記第 211。？又は前記第2^[。？を添加し、オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

5. 前記自己集合反応が、 N o . 1及ぴ N o . 2の一対のオリゴヌクレオチドの各ォリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域、中央領域、及ぴ 5 ' 側領域の 3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、 3，側領域及ぴ 5，側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第 1の系と、

N o . 3及ぴ N o . 4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを 3 ' 側領域及ぴ 5 ' 側領域の 2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域及び 5 ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第 2の系とを有し、

該架橋プローブを該ダイマー形成用プロープより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイプリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項 1又は 2記載のシグナル増幅方法。

6 . 前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の N o .

3—オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5 ' 側領域、

第 2の系の N o . 4—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 1の系の N o . 2—ォリゴヌクレオチドの 3，側領域、

第 2の系の N o . 3一オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 1の系の N 0 .

1一オリゴヌクレオチドの 5，側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 5記載のシグナル増幅方法。

7 . 前記プローブの塩基配列を、

第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 3 '側領域と第 2の系の N o .

3—オリゴヌクレオチドの 3 ' 側領域、

第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 5 '側領域と第 2の系の N o . 3—オリゴヌクレオチドの 5，側領域、

第 1の系の N o . 2—オリゴヌクレオチドの 3，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 3，側領域、

第 1の系の N o . 1—オリゴヌクレオチドの 5，側領域と第 2の系の N o . 4一オリゴヌクレオチドの 5，側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項 5記載のシグナル増幅方法。

8 . 前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項 2〜 7のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

9 . 前記支持体が、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、 9 又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項 8記載のシグナル増幅方法。

1 0 . 前記自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダィゼーシヨンさせることによりより前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載のシグナル増幅方法。

1 1 . 前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオァイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項 1 0記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

1 2 . 前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

1 3 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

1 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

1 5 . あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項 1〜 9のいずれか 1項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。

1 6 . 前記オリゴヌクレオチドが、 D N A、 R N A、 P N Aまたは L N A のいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項 1〜のいずれか 1記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法 _c