JPWO2004072302A1

JPWO2004072302A1 - 発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法

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Publication number: JPWO2004072302A1
Application number: JP2005505011A
Authority: JP
Inventors: 薄井　貢; 貢薄井; 利彦藤川
Original assignee: Eisai Co Ltd
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Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-02-13
Publication date: 2006-06-01
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Abstract

高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法やＰＣＲ法を用いないため、元のＲＮＡの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させるようにした。

Description

本発明は、発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法に関し、更に詳しくは、オリゴヌクレオチドによる自己集合反応を利用して、検出感度を向上させ、標的ＲＮＡの長さ及び発現量に応じて目的遺伝子を検出することができる発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法に関する。

通常、ＤＮＡチップを用いた発現遺伝子の検出は、ポリｄＴのみを有するプライマーもしくはランダムプライマーを用い、逆転写反応により、Ｃｙ３やＣｙ５等の蛍光物質でラベルした核酸を取り込ませた標識ｃＤＮＡをプローブとしている。また、微量のサンプルに対しては、リニア増幅法を用いアンチセンスＲＮＡを合成することが一般的である（例えば、林崎良英監修、「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」羊土社、２０００年１２月１日、ｐ．８０−９０参照。）。しかし、リニア増幅法は、第１鎖ｃＤＮＡ合成後、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼの３種類の酵素を用いて第二鎖ｃＤＮＡを合成し、最終的にＲＮＡポリメラーゼによりｉｎｖｉｔｒｏ転写反応を行いアンチセンスＲＮＡを増幅するという方法であるが、高額な酵素を多種用いなければならず、その上操作も非常に煩雑であるという欠点がある。また、サンプルが極微量である場合、このリニア増幅法を複数回繰り返さなければならない。リニア増幅法で得られたアンチセンスＲＮＡは、元のＲＮＡより短くなる傾向があり、もとのＲＮＡの長さを正確には反映していないという問題点があった。
一方、本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（例えば、米国特許第６，２６１，８４６号公報、特許第３２６７５７６号公報、及び欧州特許出願公開第１，００２，８７７Ａ号明細書参照。）。この方法は、３個所の領域から構成される１対のオリゴヌクレオチド（ＨｏｎｅｙＣｏｍｂＰｒｏｂｅ、以下、ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１ＨＣＰと第２ＨＣＰの各々の３個所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のＨＣＰを反応させた場合、互いにハイブリダイズし、ＨＣＰの自己集合反応により集合体を形成させることができる（Ｐｒｏｂｅａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｌｉｎｋｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、このＨＣＰの自己集合反応による集合体の形成法をＰＡＬＳＡＲ法と称する）。

本発明は、高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法やＰＣＲ法を用いないため、元のＲＮＡの長さや発現量に対応した検出を可能とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第１の態様は、逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズ（本発明では、ＤＮＡテップ、ＤＮＡマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズをＤＮＡチップと総称する。）における発現遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする。
本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第２の態様は、逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、３’末端にポリｄＴを有し且つ前記オリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズすることが可能な領域を有する第１プローブをプライマーとして用いてｍＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ領域を有する第２プローブを形成させる工程、前記ｍＲＮＡを前記第２プローブから解離させる工程、前記第２プローブを、標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダイズさせる工程、及び前記第２プローブと前記オリゴヌクレオチド・プローブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を有することを特徴とする。
上記自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を行う段階は、特に限定されないが、上記第２プローブを上記捕捉用プローブにハイブリダイズさせる工程の後に行うことが望ましい。
上記自己集合反応として、第１に、互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。
上記自己集合反応として、第２に、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を用いることができる。
上記プローブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
上記プローブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第３の態様は、逆転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブである第１ＨＣＰ及び第２ＨＣＰの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、３’末端にポリｄＴを有し且つ前記第１ＨＣＰの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第１プローブをｍＲＮＡに結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、ｃＤＮＡ領域及び前記第１ＨＣＰの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第２プローブを形成させ、ｍＲＮＡを除去した後、前記第２プローブを標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダイゼーションさせ、前記第１ＨＣＰ及び前記第２ＨＣＰ又は前記第２ＨＣＰを添加し、オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることを特徴とする。
本発明のシグナル増幅方法において、標的発現遺伝子としては、末端にポリＡを含むｍＲＮＡを用いることができる。
上記ＤＮＡチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための捕捉用プローブを結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やＩＴＯ電極（ｉｎｄｉｕｍｏｘｉｄｅ電極）などを使用することができる。
上記自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせることによりより上記自己集合体の存在を検出することができる。
上記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることが好適である。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することができる。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することができる。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することができる。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することができる。
上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。

図１は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の一例を示すフローチャートである。
図２は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２００を原理的に示す模式図である。
図３は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２０２を原理的に示す模式図である。
図４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２０４を原理的に示す模式図である。
図５は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２０６を原理的に示す模式図である。
図６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２１０を原理的に示す模式図である。
図７は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２１２を原理的に示す模式図である。
図８は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ２１４を原理的に示す模式図である。
図９は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ３００を原理的に示す模式図である。
図１０は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ３０２を原理的に示す模式図である。
図１１は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ３０４を原理的に示す模式図である。
図１２は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ３０６を原理的に示す模式図である。
図１３は、実施例１及び比較例１の結果を示すグラフである。

以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。
図１は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の一例を示すフローチャートである。
図１に示したように、まず、３’末端にポリｄＴを有し且つ自己集合反応に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つとハイブリダイズすることが可能な領域を有する第１プローブを準備する。該第１プローブをプライマーとして用いて、ポリＡを含むｍＲＮＡに結合させ、逆転写酵素によりｍＲＮＡの逆転写反応を行い（ステップ１００）、該第１プローブ及び該ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域からなる第２プローブを形成させる。上記第１プローブの５’側の塩基配列を、上記自己集合反応に用いられるオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を少なくとも一部分有するように構成することが好適である。
次に、ｍＲＮＡを第２プローブから解離させる（ステップ１０２）。ｍＲＮＡを解離する方法としては、特に限定されず、例えば、熱変性、アルカリ変性、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ消化等を用いた方法が挙げられる。
解離後の第２プローブを、標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダイズさせ、第２プローブを捕捉させる（ステップ１０４）。捕捉用プローブを予め支持体に結合させておくことが好ましい。
オリゴヌクレオチド・プローブを添加し、自己集合反応により、第２プローブとハイブリダイズした自己集合体を形成させ（ステップ１０６）、シグナルを増幅させることができる。
試料中に標的ｍＲＮＡが存在しない場合、第２プローブは、捕捉用プローブと結合しないため、シグナル増幅は行われない。よって、本発明のシグナル増幅方法により標的ｍＲＮＡの存在を確認することができる。また、本発明のシグナル増幅方法は、リニア増幅法を用いないため、元のＲＮＡの長さに対応した検出が可能であり、更にＰＣＲ法を用いないため、発現量に対応したシグナル増幅を行うことができる。
自己集合反応としては、互いに相補的な３領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のＨＣＰによる自己集合反応（特許第３２６７５７６号公報、特許第３３１０６６２号公報等参照。）を用いることができる。また、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブによる自己集合反応（特開２００２−３５５０８１号公報等参照。）を用いることも可能である。
なお、図１においては、ステップ１０４の後にステップ１０６を行った場合の例を示したが、ステップ１０４の前もしくはステップ１０４と同時にステップ１０６を行うことも可能である。
図２〜図８は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の第１の例を原理的に示す模式図である。第１の例は、自己集合反応として、予め蛍光物質２２で標識した一対のＨＣＰを用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅法であり、第１プローブ１２ａとして、３’末端にポリｄＴを含むＨＣＰを用いた場合の例を示す。
図２に示した如く、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ１０ａを検出するために、第１プローブ１２ａとして、３’末端にポリｄＴを含み、５’側にＨＣＰの３領域を有するオリゴヌクレオチド・プローブ（ＨＣＰ−１）を準備し（ステップ２００）、図３に示した如く、ｍＲＮＡ１０ａのポリＡテール部分に３’末端にポリｄＴを含むＨＣＰ−１（１２ａ）を結合させる（ステップ２０２）。その後、図４に示した如く、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、ｍＲＮＡの相補配列を有するＨＣＰである第２プローブ１４ａを作製した後（ステップ２０４）、図５に示した如く、ｍＲＮＡ１０ａを解離し、ｃＤＮＡ領域とＨＣＰ領域からなる一本鎖のオリゴヌクレオチドとする（ステップ２０６）。
図６に示した如く、支持体１８上にターゲット遺伝子のｃＤＮＡと相補的な領域を持つ捕捉用プローブ１６ａを結合させておき（ステップ２１０）図７に示した如く、上記形成されたｃＤＮＡ領域を有するＨＣＰである第２プローブ１４ａを捕捉用プローブ１６ａにハイブリダイゼーションさせ（ステップ２１２）、図８に示した如く、一対のもう一方のＨＣＰ（ＨＣＰ−２）を加え、自己集合反応により自己集合体２０ａを形成させ（ステップ２１４）、シグナル増幅を行うことができる。なお、上記ステップ２０６の標的ｍＲＮＡを除去する際、洗浄操作を行った場合は、上記ステップ２１４において、一対のＨＣＰを添加する必要がある。
上記第１の例では、ＨＣＰ−１の３領域中の３’側領域の一部をポリｄＴとした一対のＨＣＰを用いた例を示したが、ＨＣＰ−１の３’側領域を全てポリｄＴとし、ＨＣＰ−２の３領域中の３’側領域を全てポリＡとした一対のＨＣＰを用いることもできる。
図９〜図１２は、本発明の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の工程順の第２の例を原理的に示す模式図である。第２の例は、自己集合反応として、蛍光物質で標識されていない一対のＨＣＰを用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅法であり、第１プローブ１２ｂとして、３’末端にポリｄＴを含み且つＨＣＰの相補領域を１つ含んでいるオリゴヌクレオチド・プローブを用いた場合の例を示す。
図９に示した如く、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡ１０ｂを検出するために、第１プローブ１２ｂとして、３’末端にポリｄＴを含み、５’側にＨＣＰの相補領域を一つ有するオリゴヌクレオチド・プローブを準備し（ステップ３００）、図１０に示した如く、ｍＲＮＡ１０ｂのポリＡテール部分に該オリゴヌクレオチド・プローブ１２ｂを結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、ｍＲＮＡの相補配列を有する第２プローブ１４ｂを作製する（ステップ３０２）。ｍＲＮＡ１０ｂを解離し、ｃＤＮＡ領域とＨＣＰ領域を含む一本鎖のオリゴヌクレオチドとする。
図１１に示した如く、上記第２プローブ１４ｂを支持体１８に結合した捕捉用プローブ１６ｂにハイブリダイゼーションさせ（ステップ３０４）、図１２に示した如く、一対のＨＣＰを添加し、自己集合反応により自己集合体２０ｂを形成させ（ステップ３０６）、形成された自己集合体２０ｂに対してインターカレーター２４等を挿入し（ステップ３０８）、シグナル増幅を行うことができる。なお、ステップ３０６とステップ３０８を同時に行うことも可能である。
一対のオリゴヌクレオチド・プローブに、あらかじめ検出のための標識物質として、例えば、Ｉ^１２５やＰ^３２等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光物質やＣｙ３・Ｃｙ５等の蛍光物質、４−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、標的遺伝子を検出することも可能である。
また、核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、標的遺伝子を検出することも可能である。インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＧｏｌｄｓｔａｉｎ、ＶｉｓｔｒａＧｒｅｅｎｓｔａｉｎ、Ｇｅｌｓｔａｒｓｔａｉｎ、ＲａｄｌａｎｔＲｅｄｓｔａｉｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｌＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｂｉｓ−Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｌｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−１ｌｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−３ｌｏｄｉｄｅ（以上、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製）、臭化エチジウム、ＤｉｓｔａｍｙｃｉｎＡ、ＴＯＴＯ、Ｐｓｏｒａｌｅｎ、アクリジニウムオレンジ（ＡｃｒｉｄｉｎｅＯｒａｎｇｅ）、ＡＯＡＯ（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）等が使用できる。
上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット参照。）やＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ、例えば、ＫｏｓｈｋｉｎＡＡｅｔａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ１９９８．５４，３６０７−３６３０、ＫｏｓｈｋｉｎＡＡｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８．１２０，１３２５２−１３２５３、及びＷａｈｌｅｓｔｅｄｔＣｅｔａｌ．ＰＮＡＳ．２０００．９７，５６３３−５６３８．参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
本発明は、ＤＮＡチップで捕捉したターゲット遺伝子に対して、相補的な領域を有する一対のＨＣＰで自己集合体を形成させるものである。使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、１０^２〜１０^１５本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜６５℃である。
本発明における標的発現遺伝子（ｍＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、カビ等の末端にポリＡ鎖を含むｍＲＮＡを持つあらゆる真核生物の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中の標的遺伝子を公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
以下に実施例において用いた材料を示す。
（ａ）ターゲット遺伝子：培養細胞より抽出したＴｏｔａｌＲＮＡ
（ｂ）キャプチャープローブ（捕捉用プローブ）：

（ｃ）プライマー：

（ｄ）ＨＣＰ：

（ｅ）ポリスチレン製粒子ビーズ：１種類の粒子ビーズに上記２種類のキャプチャープローブを固定したもの

培養細胞から抽出したＴｏｔａｌＲＮＡを用い、ハウスキーピング遺伝子であるＢｅｔａ−ａｃｔｉｎの検出を、ＰＡＬＳＡＲ法を利用して試みた。
（１）ＲＮＡの逆転写反応及び逆転写産物の精製
上記ターゲット遺伝子、上記第１プローブ、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ：インビトロジェン社製）、及び反応溶液（ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，ＤＴＴ，ｄＮＴＰ，ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いて逆転写反応を３７℃で２時間行った。その後６５℃で３０分アルカリ処理を行い、塩酸を用いて中和した。逆転写産物であるｃＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて精製した。
（２）ハイブリダイゼーション
次に、［上記得られたｃＤＮＡ、上記粒子ビーズ、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液］の組成を、全量５０μＬになるように調整し、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。終了後０．２２μｍフィルターでろ過し、未反応プローブを除去し、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、０．２×ＳＳＣで１回洗浄し上記フィルターでろ過した。
その後、［上記得られた粒子ビーズ、上記ＨＣＰ−１及び２（１．５ｐｍｏｌ／μＬ）、１％ＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）、０．１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ、０．０２％ＳＤＳ、５×ＳＳＣ］の組成（全量１００μＬ）で６５℃３０分間、ハイブリダイゼーションを行った。
（３）検出
洗浄後の粒子ビーズをフローサイトメーター用シース液に再懸濁しフローサイトメーターで、ＨＣＰに標識されているＣｙ３の蛍光を測定した。
（比較例１）
通常行われているポリｄＴプライマーによるＣｙ３−ｄＮＴＰ取り込みの系を用いてターゲット遺伝子の検出を行った。
（１）ＲＮＡの逆転写反応及び解離反応
プライマーとして上記ポリｄＴプライマーを用い、ｄＮＴＰの他に、Ｃｙ３ラベルｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｃｈａｍ社製）を取り込ませた以外は実施例１と同様にして逆転写反応及び逆転写産物の精製を行った。
（２）ハイブリダイゼーション
次に、［上記得られたｃＤＮＡ、上記粒子ビーズ、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液］の組成を、全量５０μＬになるように調整し、４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを行った。終了後０．２２μｍフィルターでろ過し、未反応プローブを除去し、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回洗浄ろ過した。
（３）検出
洗浄後の粒子ビーズをフローサイトメーター用シース液に再懸濁しフローサイトメーターで、粒子ビーズ上のキャプチャープローブと結合したｃＤＮＡに標識されているＣｙ３の蛍光を測定した。
［結果］
実施例１及び比較例１の結果を図１３に示した。蛍光強度は、各々の種類に対し２０３から５０４個の粒子ビーズの蛍光強度を測定しそのメジアン値を示した。図１３に示した如く、比較例１と比べて実施例１の検出感度は著しく向上した。

以上述べた如く、本発明によれば、逆転写反応のみであるため、高価な酵素を必要とせず、安価で安易な操作で短時間で検出することができ、更に、リニア増幅法やＰＣＲ法を用いないため、元のＲＮＡの長さや発現量に対応した検出が可能となるという著大なる効果を奏する。

【配列表】

Claims

逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
逆転写反応及びオリゴヌクレオチド・プローブの自己集合により自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、
３’末端にポリｄＴを有し且つ前記オリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズすることが可能な領域を有する第１プローブをプライマーとして用いてｍＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ領域を有する第２プローブを形成させる工程、
前記ｍＲＮＡを前記第２プローブから解離させる工程、
前記第２プローブを、標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダイズさせる工程、及び
前記第２プローブと前記オリゴヌクレオチド・プローブを用いた自己集合反応により自己集合体を形成させる工程を有することを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
前記自己集合反応が、互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項１又は２記載のシグナル増幅方法。
逆転写反応及び互いに相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブである第１ＨＣＰ及び第２ＨＣＰの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成させる自己集合反応を利用し、ＤＮＡチップにおける発現遺伝子の検出感度を向上させる方法であって、
３’末端にポリｄＴを有し且つ前記第１ＨＣＰの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第１プローブをｍＲＮＡに結合させ、逆転写酵素を用いて逆転写反応させ、ｃＤＮＡ領域及び前記第１ＨＣＰの塩基配列領域を少なくとも一部分有する第２プローブを形成させ、ｍＲＮＡを除去した後、前記第２プローブを標的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブにハイブリダイゼーションさせ、前記第１ＨＣＰ及び前記第２ＨＣＰ又は前記第２ＨＣＰを添加し、オリゴヌクレオチドの自己集合反応による自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることを特徴とする発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
前記自己集合反応が、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、
Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、
該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項１又は２記載のシグナル増幅方法。
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項５記載のシグナル増幅方法。
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項５記載のシグナル増幅方法。
前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
前記支持体が、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項８記載のシグナル増幅方法。
前記自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせることによりより前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項１０記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１記載の発現遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。