JPWO2003029441A1 - Dnaチップのシグナル増幅方法 - Google Patents
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Abstract
DNAチップ上で捕捉されたターゲット遺伝子に対して効率良くPALSAR法によりシグナルの増幅を確立させ、さらに、PALSAR法に用いる一対のHCPのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにしたDNAチップのシグナル増幅方法を提供する。オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、DNAチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させる。
Description
技術分野
本発明は、DNAチップのシグナル増幅方法に関し、更に詳しくは、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを利用して、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合しておく支持体又は基板(以下、支持体と称する)として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の基板型等の支持体を用いたDNAチップ(以下、総称してDNAチップという場合がある。)上のターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができる遺伝子のシグナル増幅方法に関する。
背景技術
DNAチップは、表面を特殊加工したマイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の固相基板型の支持体に多数の異なったDNAプローブを高密度に固定した後、核酸(ターゲット)をハイブリダイゼーション(Judy,M.,Geoffrey,W.Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports.Analytical Biochemistry,138,267−284,1984,Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips: an array of possibilities.Nat Biotechnol.16,27−31,1998,JP4135498,JP4135500,JP4135498,JP4135500,US005952172A,US6346387B1及びUS6180346B1参照)させ、核酸(ターゲット)のシグナルを測定して遺伝子を検出するものである。
現在、この技術は遺伝子の発現解析や変異遺伝子等の検出などに用いられているが、従来から用いられてきたサザンブロット法(Southern,E.M.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel lectrophoresis.J.Mol.Biol.,98,503−517,1975)と比較して、検出感度が十分の一(村松正明ら、DNAマイクロアレイと最新PCR法、秀潤社、85−86,2000)と低く、反応時間が長いという課題があった。
また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げるために耐熱性DNAリガーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するLCR法(USP5,792,607)や耐熱性DNAポリメラーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するPCR法(Saiki,R.,S.Scharf,F.Faloona,et al.Enzymatic amplification of β−globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.230,1350−1354(1985))などの遺伝子増幅法を用いて、事前にターゲット遺伝子を増幅する方法があるが、煩雑な操作が必要であり、且つ高コストであった。
上記の問題点に鑑み、本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した(USP6,261,846、日本特許第3267576号及びEP1,002,877A)。この方法は、3個所の領域から構成される1対のオリゴヌクレオチド(HoneyComb Probe、以下、HCPと称する)を用いる方法であり、第1HCPと第2HCPの各々の3個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の1個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のHCPを反応させた場合、お互いにハイブリダイズし、HCPの自己集合反応により集合体を形成させることができる(Probe alternation link self−assembly reaction、以下、このHCPの自己集合反応による集合体の形成法をPALSAR法と称する)。
発明の開示
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したPALSAR法を用いて、DNAチップの検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
本発明は、DNAチップ上で捕捉されたターゲット遺伝子に対して効率良くPALSAR法によりシグナルの増幅を確立させ、さらに、PALSAR法に用いる一対のHCPのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにしたDNAチップのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明のDNAチップのシグナル増幅方法は、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、DNAチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるものである。
上記自己集合反応として、第一に、互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記自己集合反応として、第二に、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第1の系と、
No.3及びNo.4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域及び5’側領域の2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第2の系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブ(ダイマー形成用プローブ及び該架橋プローブをプローブと総称する)をハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
また、上記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
上記DNAチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやブラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やITO電極(indium oxide電極)などを使用することができる。
上記ターゲット遺伝子に一本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子に二本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子にSNPs(一塩基多形)を用いることができる。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめターゲット遺伝子と相補的な配列にすることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子と上記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つジョイント・プローブを用いることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。
標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
図1〜図4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例を原理的に示す模式図である。第1の例は、互いに相補的な3領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ(即ち、一対のHCP;HCP−1,HCP−2)を用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のHCPを用いる例を示す。
図1に示した如く、支持体として使用したスライドガラス(符号A)上にターゲット遺伝子に相補的な領域を持つ捕捉用DNAプローブ(符号B)を結合させる(ステップ100)。次に図2に示した如く、ターゲット遺伝子(符号C)を捕捉した後(ステップ102)、図3に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質で標識された片方のHCP−1(符号D)を結合させる(ステップ110)。図3に示したこのDNAチップを対象にして、図4に示した如く、もう一方のHCP−2(符号E)を加えて(ステップ112)、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる(ステップ114)。なお、ステップ110とステップ112を同時に行うことも可能である。
図5及び図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例を原理的に示す模式図である。第2の例は、一対のHCPを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、蛍光物質で標識されていない一対のHCPを用いる例を示す。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、一対のHCPを添加し、自己集合体を形成させた後(ステップ120)、図5に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター(符号F)を挿入し(ステップ122)、図6に示した如く、シグナルを増幅させることができる(ステップ124)。なお、ステップ120とステップ122を同時に行うことも可能である。
図7〜図9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例を原理的に示す模式図である。第3の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のダイマー形成用プローブ(ダイマー形成用プローブ−1、2)を用いる例を示す。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、図7に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自らダイマーを形成するダイマー形成用プローブ−1、2(符号G、H)とターゲット遺伝子をハイブリダイゼーションさせる(ステップ130)。続いて、図8に示した如く、ダイマーを形成したダイマー形成用プローブ−1、2に対して相補的領域を有する架橋プローブ−1、2(符号I、J)をハイブリダイゼーションさせ(ステップ132)、図9に示した如く、ダイマー形成用プローブと架橋プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる(ステップ134)。なお、ステップ130とステップ132を同時に行うことも可能である。
図10は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例を原理的に示す模式図である。第4の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持つ一対のダイマー形成用プローブ(ダイマー形成用プローブ−1、2)を用いて、ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを標識しない場合である。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを添加し、自己集合体を形成させた後(ステップ140)、図10に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター(符号F)を挿入し(ステップ142)、シグナルを増幅させることができる(ステップ144)。なお、ステップ140とステップ142を同時に行うことも可能である。
本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド・プローブにあらかじめ検出のための標識物質として、例えば、I125やP32等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジウム・エステル等の発光物質やCy3・Cy5等の蛍光物質、4−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。
また、核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。図5、図6及び図10に示した如く、インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、SYBR Green I stain、SYBR Green II stain、SYBR Green Gold stain、Vistra Green stain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、RiboGreen、OllGreen、Hoechst33258(Bis−Benzimide)、Propidium lodide、YO−PRO−1 lodide、YO−PRO−3 lodide(以上、Molecular Probes社製)、臭化エチジウム、Distamycin A、TOTO、Psoralen、アクリニジウムオレンジ(Acridine Orange)、AOAO(homodimer)等が使用できる。
上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、通常DNA又はRNAで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸(PNA、WO92/20702)やLocked Nucleic Acid(LNA、Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54,3607−3630.,Koshkin AA et al.J.Am.Chem.Soc.1998.120,13252−13253.,Wahlestedt C et al.PNAS.2000.97,5633−5638.)が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばDNAプローブとRNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はDNA、RNAまたは核酸類似体(たとえばPNAやLNA等)から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばDNAのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、DNAとRNAから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ(キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも5塩基であり、好ましくは10〜100塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばDNAプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystem Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
本発明は、DNAチップで捕捉したターゲット遺伝子に対して、相補的な領域を有する一対のHCP又は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブで集合体を形成させるものである。使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、102〜1015本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。pHも常用の範囲で好適であり、好ましくはpH7.0〜9.0の範囲のものが使用できる。反応温度は40〜80℃、好ましくは55〜65℃である。
本発明におけるターゲット遺伝子(DNA及び/またはRNA)測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したDNA及び/またはRNA等の核酸も使用できる。
実施例
以下に、本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、この実施例は例示的に示されるもので、限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
(1)材料
以下に実施例において用いたオリゴヌクレオチド・プローブを示す。
[1]プローブ1;捕捉用DNAプローブ−1a
[2]プローブ2;ターゲット遺伝子−1
[3]プローブ3;HCP−1
[4]プローブ4;HCP−2
[5]プローブ5;HCP−3
[6]プローブ6;HCP−4
[7]プローブ7;ダイマー形成用プローブ−1
[8]プローブ8;ダイマー形成用プローブ−2
[9]プローブ9;架橋プローブ−1
[10]プローブ10;架橋プローブ−2
「11]プローブ11;捕捉用DNAプローブ−2a
[12]プローブ12;捕捉用DNAプローブ−1b
[13]プローブ13;ターゲット遺伝子−2
[14]プローブ14;HCP−5
[15]プローブ15;HCP−6
[16]プローブ16;捕捉用DNAプローブ−2b
ハイブリッド液として、(0.8μg/μLポリdA、0.1μg/μL酵母tRNA、0.15μg/μLヒトCot−I DNA、5×Denhardt’s液、0.1mg/mL Sarmon sperm DNA、0.2%SDS、6×SSC)のハイブリッド液を用いた。
(実施例1〜3及び比較例1〜3)
(1)目的
Cy3標識した一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)によるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例1〜3)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例1)、50ng/μL(実施例2)、5ng/μL(実施例3)に調製したターゲット遺伝子−1と相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、50ngのターゲット遺伝子−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し1次ハイブリ液Aを調製した。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−1と25pmolのCy3標識したHCP−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Aを調製した。
(比較例1〜3)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例1)、50ng/μL(比較例2)、5ng/μL(比較例3)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Bを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で24時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で16時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスを、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例1〜3及び比較例1〜3の結果を図11に示す。図11に示されるように、自己集合体を形成する実施例1〜3は、自己集合体を形成しない比較例1〜3に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例4〜6及び比較例4〜6)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、SYBR Green Iによる検出を行った。
(2)材料
(実施例4〜6)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例4)、50ng/μL(実施例5)、5ng/μL(実施例6)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのHCP−1と25pmolのHCP−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Cを調製した。
(比較例4〜6)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例4)、50ng/μL(比較例5)、5ng/μL(比較例6)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのHCP−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Dを調製した。
(3)方法
実施例1〜3及び比較例1〜3と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
原液を0.5×TBEで1000倍希釈したSYBR Green Iをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で3分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(475nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例4〜6及び比較例4〜6の結果を図12に示す。図12に示されるように、自己集合体を形成する実施例4〜6は、自己集合体を形成しない比較例4〜6に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、SYBR Green Iにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例7〜9及び比較例7〜9)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、PicoGreenによる検出を行った。
(2)材料
(実施例7〜9)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例7)、50ng/μL(実施例8)、5ng/μL(実施例9)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Cを用いた。
(比較例7〜9)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例7)、50ng/μL(比較例8)、5ng/μL(比較例9)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Dを用いた。
(3)方法
上記実施例1〜3及び比較例1〜3の(3)と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
原液をTEで200倍希釈したPicoGreenをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で30分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(475nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例7〜9及び比較例7〜9の結果を図13に示す。図13に示されるように、自己集合体を形成する実施例7〜9は、自己集合体を形成しない比較例7〜9に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、PicoGreenにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例10〜12及び比較例10〜12)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、EtBrによる検出を行った。
(2)材料
(実施例10〜12)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例10)、50ng/μL(実施例11)、5ng/μL(実施例12)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Cを用いた。
(比較例10〜12)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例10)、50ng/μL(比較例11)、5ng/μL(比較例12)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Dを用いた。
(3)方法
上記実施例1〜3及び比較例1〜3の(3)と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
10μg/μLのEtBrをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で30分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例10〜12及び比較例10〜12の結果を図14に示す。図14に示されるように、自己集合体を形成する実施例10〜12は、自己集合体を形成しない比較例10〜12に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、EtBrにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例13〜15及び比較例13〜15)
(1)目的
実施例1〜3のHCPとは異なる一対のHCP(HCP−3及びHCP−4)を用いて、Cy3標識した一対のHCPによるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例13〜15)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例13)、50ng/μL(実施例14)、5ng/μL(実施例15)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−3と25pmolのCy3標識したHCP−4をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Eを調製した。
(比較例13〜15)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例13)、50ng/μL(比較例14)、5ng/μL(比較例15)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したプローブ5をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Fを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて54℃で6時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例13〜15及び比較例13〜15の結果を図15に示す。図15に示されるように、自己集合体を形成する実施例13〜15は、自己集合体を形成しない比較例13〜15に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。実施例1〜3との比較より、一対のHCPの塩基配列及び反応条件を調節することにより、より検出感度を向上させることが可能なことがわかる。
(実施例16〜18及び比較例16〜18)
(1)目的
Cy3標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例16〜18)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例16)、50ng/μL(実施例17)、5ng/μL(実施例18)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液を以下の如く調製した。25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブ−1と25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブ−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱後、45℃で16時間静置した。これに50μMの架橋プローブ−1溶液及び50μMの架橋プローブ−2溶液を0.5μL加え2次ハイブリ液Gを調製した。
(比較例16〜18)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例16)、50ng/μL(比較例17)、5ng/μL(比較例18)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液を以下の如く調製した。25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブと25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブをハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱後、45℃で16時間静置した。これに蒸留水0.5μLを加え2次ハイブリ液Hを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて58℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例16〜18及び実施例16〜18の結果を図16に示す。図16に示されるように、自己集合体を形成する実施例16〜18は、自己集合体を形成しない比較例16〜18に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実験例1〜4)
(1)目的
Cy3標識した一対のHCP2種(HCP−3とHCP−4、HCP−5とHCP−6)を用いて、HCPによるシグナル増幅の特異性を調べた。
(2)材料
(a)捕捉用プローブは、50pmol/μL又は5pmol/μLにそれぞれ調製した、ターゲット遺伝子−2に相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−2aもしくはターゲット遺伝子−1と相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−1bを用いた。
(b)実験例1では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Bを用いた。ターゲット遺伝子−1;3pmolをハイブリ液X(5×Denhardt’s液、0.1mg/mL Salmon sperm DNA、0.2%SDS、6×SSC)30μLに溶解し、95℃で2分加熱し、1次ハイブリッド液Bを調製した。
実験例2では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Cを用いた。ターゲット遺伝子−2;3pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Cを調製した。
実験例3では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Dを用いた。ターゲット遺伝子−1とターゲット遺伝子−2それぞれ3pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Dを調製した。
実験例4では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Eを用いた。ターゲット遺伝子を加えないハイブリ液X:30μLを95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Eを調製した。
(c)2次ハイブリ液として、Cy3標識したHCP−5とCy3標識したHCP−6とCy3標識したHCP−3とCy3標識したHCP−4それぞれ30pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃2分加熱し、2次ハイブリ液Xを調製した。
(3)方法
捕捉用DNAプローブ−2(50pmol/μL又は5pmol/μL)又は捕捉用DNAプローブ−1b(50pmol/μL又は5pmol/μL)をそれぞれスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。同様にスポットしたスライドガラス4枚のそれぞれに一次ハイブリ液B〜E:25μLをin situ PCR用チャンバー内に滴下した後、シールし、42℃で2時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での2×SSC・0.1%SDSで2度すすいだ。続いて1×SSC、0.2×SSC中でそれぞれ2分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させた。
次に2次ハイブリ液25μLをin situ PCR用チャンバー内に滴下した後、シールし、57.7℃2時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での2×SSC・0.1%SDSで2度すすいだ。続いて1×SSC、0.2×SSC中でそれぞれ2分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させ、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(4)結果
実験例1〜4の結果を図17に示す。図17に示されるように、捕捉用DNAプローブ−1bが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−1が捕捉され、HCPによりシグナルが増幅された。また、捕捉用DNAプローブ−2aが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−2が捕捉され、HCPによりシグナルが増幅された。
(実験例5及び6)
(1)目的
支持体に微分パルスボルタンメトリー法により電流値が測定できる金電極を使用し、蛍光のインターカレーターの代わりに電気化学的に活性なインターカレーターを使用して、HCPによる遺伝子のシグナル増幅を調べた。
(実験例5)
(2)材料および方法
金電極(BAS社製)を0.05μmのアルミナパウダーサスペンジョン(バイカロックス社製)により研磨し、滅菌蒸留水でリンス後、100%エタノール中で15分間超音波洗浄した。滅菌蒸留水でリンス後、Au表面を乾燥させ、10pmol/μLに調製した捕捉用DNAプローブ−2bをAu上に2μLアプライした。乾燥を防ぐためにキャップをして、湿潤箱に入れて、室温で一晩静置した。
滅菌蒸留水でリンス後、測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、ALS630(BSA社製)を用いて微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブの値:i0)。
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−2;1pmol/μLを含有させた5×SSC溶液を調製した。滅菌蒸留水でリンス後、上記ターゲット溶液を2μL、Au電極上にアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ、45℃で180分静置しハイブリダイゼーションを行い、2×SSC+0.1%SDSで1回、0.2×SSC+0.1%SDSで2回、1×SSCで1回、0.2×SSCで1回洗浄後、乾燥させた。
測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブにターゲットが結合した時の値:i1)。
滅菌蒸留水でリンス後、一対のHCPを含有する溶液[HCP−5及びHCP−6を各0.156pmol/μL、12×SSC、10μM Hoechist33258]をAu電極上に2μLアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ58℃で120分静置してポリマーを形成させた。
2×SSC+0.1%SDSで1回、0.2×SSC+0.1%SDSで2回、1×SSCで1回、0.2×SSCで2回洗浄後、乾燥させ、測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブに結合しているターゲットにHCPを結合させて自己集合させた時の値:i2)。
(実験例6)
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−2;1pmol/μLを含有させた5×SSC溶液の代わりに、ターゲット遺伝子−2;0.5pmol/μLを含有させた5×SSC溶液を調製して用いた以外は上記実験例5と同様の手順及び条件により実験を行った。
(5)結果
表1は実験例5(ターゲット遺伝子−2;1pmol/μL)、表2は実験例6(ターゲット遺伝子−2;0.5pmol/μL)の結果である。
表1及び表2の結果に示した如く、表1、表2ともにターゲット遺伝子のみをハイブリダイゼーションさせた時よりも、HCPを使い自己集合させた時の方が、得られる電流のピーク値の増加率が大きくなった。
産業上の利用可能性
上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドの自己集合反応を利用したDNAチップのシグナル増幅方法により、煩雑な操作を行うことなく、簡便にDNAチップのターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上させることが可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ100を原理的に示す模式図である。
図2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ102を原理的に示す模式図である。
図3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ110を原理的に示す模式図である。
図4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ114を原理的に示す模式図である。
図5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ122を原理的に示す模式図である。
図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ124を原理的に示す模式図である。
図7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ130を原理的に示す模式図である。
図8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ132を原理的に示す模式図である。
図9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ134を原理的に示す模式図である。
図10は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例におけるステップ144を原理的に示す模式図である。
図11は、実施例1〜3及び比較例1〜3の結果を示す写真である。
図12は、実施例4〜6及び比較例4〜6の結果を示す写真である。
図13は、実施例7〜9及び比較例7〜9の結果を示す写真である。
図14は、実施例10〜12及び比較例10〜12の結果を示す写真である。
図15は、実施例13〜15及び比較例13〜15の結果を示す写真である。
図16は、実施例16〜18及び比較例16〜18の結果を示す写真である。
図17は、実験例1〜4の結果を示す写真である。
本発明は、DNAチップのシグナル増幅方法に関し、更に詳しくは、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを利用して、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合しておく支持体又は基板(以下、支持体と称する)として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の基板型等の支持体を用いたDNAチップ(以下、総称してDNAチップという場合がある。)上のターゲット遺伝子の検出感度を向上させることができる遺伝子のシグナル増幅方法に関する。
背景技術
DNAチップは、表面を特殊加工したマイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、電気伝導性の固相基板型の支持体に多数の異なったDNAプローブを高密度に固定した後、核酸(ターゲット)をハイブリダイゼーション(Judy,M.,Geoffrey,W.Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports.Analytical Biochemistry,138,267−284,1984,Marshall,A.,Hodgson,J.DNA chips: an array of possibilities.Nat Biotechnol.16,27−31,1998,JP4135498,JP4135500,JP4135498,JP4135500,US005952172A,US6346387B1及びUS6180346B1参照)させ、核酸(ターゲット)のシグナルを測定して遺伝子を検出するものである。
現在、この技術は遺伝子の発現解析や変異遺伝子等の検出などに用いられているが、従来から用いられてきたサザンブロット法(Southern,E.M.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel lectrophoresis.J.Mol.Biol.,98,503−517,1975)と比較して、検出感度が十分の一(村松正明ら、DNAマイクロアレイと最新PCR法、秀潤社、85−86,2000)と低く、反応時間が長いという課題があった。
また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げるために耐熱性DNAリガーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するLCR法(USP5,792,607)や耐熱性DNAポリメラーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するPCR法(Saiki,R.,S.Scharf,F.Faloona,et al.Enzymatic amplification of β−globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.230,1350−1354(1985))などの遺伝子増幅法を用いて、事前にターゲット遺伝子を増幅する方法があるが、煩雑な操作が必要であり、且つ高コストであった。
上記の問題点に鑑み、本発明者等は酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した(USP6,261,846、日本特許第3267576号及びEP1,002,877A)。この方法は、3個所の領域から構成される1対のオリゴヌクレオチド(HoneyComb Probe、以下、HCPと称する)を用いる方法であり、第1HCPと第2HCPの各々の3個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の1個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のHCPを反応させた場合、お互いにハイブリダイズし、HCPの自己集合反応により集合体を形成させることができる(Probe alternation link self−assembly reaction、以下、このHCPの自己集合反応による集合体の形成法をPALSAR法と称する)。
発明の開示
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したPALSAR法を用いて、DNAチップの検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
本発明は、DNAチップ上で捕捉されたターゲット遺伝子に対して効率良くPALSAR法によりシグナルの増幅を確立させ、さらに、PALSAR法に用いる一対のHCPのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにしたDNAチップのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明のDNAチップのシグナル増幅方法は、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、DNAチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させるものである。
上記自己集合反応として、第一に、互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記自己集合反応として、第二に、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第1の系と、
No.3及びNo.4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域及び5’側領域の2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第2の系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブ(ダイマー形成用プローブ及び該架橋プローブをプローブと総称する)をハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。
上記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
また、上記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
上記DNAチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやブラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やITO電極(indium oxide電極)などを使用することができる。
上記ターゲット遺伝子に一本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子に二本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることができる。
上記ターゲット遺伝子にSNPs(一塩基多形)を用いることができる。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめターゲット遺伝子と相補的な配列にすることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子と上記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つジョイント・プローブを用いることが好ましい。
上記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。
標識プローブとしては、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識したものを用いることができる。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
図1〜図4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例を原理的に示す模式図である。第1の例は、互いに相補的な3領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ(即ち、一対のHCP;HCP−1,HCP−2)を用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のHCPを用いる例を示す。
図1に示した如く、支持体として使用したスライドガラス(符号A)上にターゲット遺伝子に相補的な領域を持つ捕捉用DNAプローブ(符号B)を結合させる(ステップ100)。次に図2に示した如く、ターゲット遺伝子(符号C)を捕捉した後(ステップ102)、図3に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質で標識された片方のHCP−1(符号D)を結合させる(ステップ110)。図3に示したこのDNAチップを対象にして、図4に示した如く、もう一方のHCP−2(符号E)を加えて(ステップ112)、自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる(ステップ114)。なお、ステップ110とステップ112を同時に行うことも可能である。
図5及び図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例を原理的に示す模式図である。第2の例は、一対のHCPを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、且つターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、蛍光物質で標識されていない一対のHCPを用いる例を示す。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、一対のHCPを添加し、自己集合体を形成させた後(ステップ120)、図5に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター(符号F)を挿入し(ステップ122)、図6に示した如く、シグナルを増幅させることができる(ステップ124)。なお、ステップ120とステップ122を同時に行うことも可能である。
図7〜図9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例を原理的に示す模式図である。第3の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、あらかじめ蛍光物質で標識された一対のダイマー形成用プローブ(ダイマー形成用プローブ−1、2)を用いる例を示す。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、図7に示した如く、そのターゲット遺伝子と相補的な領域を持ち、自らダイマーを形成するダイマー形成用プローブ−1、2(符号G、H)とターゲット遺伝子をハイブリダイゼーションさせる(ステップ130)。続いて、図8に示した如く、ダイマーを形成したダイマー形成用プローブ−1、2に対して相補的領域を有する架橋プローブ−1、2(符号I、J)をハイブリダイゼーションさせ(ステップ132)、図9に示した如く、ダイマー形成用プローブと架橋プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させることができる(ステップ134)。なお、ステップ130とステップ132を同時に行うことも可能である。
図10は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例を原理的に示す模式図である。第4の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブを用いたPALSAR法を利用したDNAチップのシグナル増幅方法であり、ターゲット遺伝子と相補的な領域を持つ一対のダイマー形成用プローブ(ダイマー形成用プローブ−1、2)を用いて、ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブを標識しない場合である。
上記した第1の例と同様にして、ステップ100及びステップ102を行った後、一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを添加し、自己集合体を形成させた後(ステップ140)、図10に示した如く、形成された自己集合体に対してインターカレーター(符号F)を挿入し(ステップ142)、シグナルを増幅させることができる(ステップ144)。なお、ステップ140とステップ142を同時に行うことも可能である。
本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド・プローブにあらかじめ検出のための標識物質として、例えば、I125やP32等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジウム・エステル等の発光物質やCy3・Cy5等の蛍光物質、4−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。
また、核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。図5、図6及び図10に示した如く、インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲット遺伝子を検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、SYBR Green I stain、SYBR Green II stain、SYBR Green Gold stain、Vistra Green stain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGreen、RiboGreen、OllGreen、Hoechst33258(Bis−Benzimide)、Propidium lodide、YO−PRO−1 lodide、YO−PRO−3 lodide(以上、Molecular Probes社製)、臭化エチジウム、Distamycin A、TOTO、Psoralen、アクリニジウムオレンジ(Acridine Orange)、AOAO(homodimer)等が使用できる。
上記した一対のオリゴヌクレオチドを構成する核酸は、通常DNA又はRNAで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、たとえば、ペプチド核酸(PNA、WO92/20702)やLocked Nucleic Acid(LNA、Koshkin AA et al.Tetrahedron 1998.54,3607−3630.,Koshkin AA et al.J.Am.Chem.Soc.1998.120,13252−13253.,Wahlestedt C et al.PNAS.2000.97,5633−5638.)が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばDNAプローブとRNAプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はDNA、RNAまたは核酸類似体(たとえばPNAやLNA等)から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばDNAのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、DNAとRNAから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ(キメラプローブ)を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
オリゴヌクレオチド・プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも5塩基であり、好ましくは10〜100塩基、さらに好ましくは15〜30塩基である。
これらプローブは公知の方法により合成することができる。たとえばDNAプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystem Inc.)のDNAシンセサイザー394型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、H−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
本発明は、DNAチップで捕捉したターゲット遺伝子に対して、相補的な領域を有する一対のHCP又は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブで集合体を形成させるものである。使用するオリゴヌクレオチド・プローブの本数は特に限定されないが、102〜1015本の範囲で用いられる。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。pHも常用の範囲で好適であり、好ましくはpH7.0〜9.0の範囲のものが使用できる。反応温度は40〜80℃、好ましくは55〜65℃である。
本発明におけるターゲット遺伝子(DNA及び/またはRNA)測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したDNA及び/またはRNA等の核酸も使用できる。
実施例
以下に、本発明の実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、この実施例は例示的に示されるもので、限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
(1)材料
以下に実施例において用いたオリゴヌクレオチド・プローブを示す。
[1]プローブ1;捕捉用DNAプローブ−1a
[2]プローブ2;ターゲット遺伝子−1
[3]プローブ3;HCP−1
[4]プローブ4;HCP−2
[5]プローブ5;HCP−3
[6]プローブ6;HCP−4
[7]プローブ7;ダイマー形成用プローブ−1
[8]プローブ8;ダイマー形成用プローブ−2
[9]プローブ9;架橋プローブ−1
[10]プローブ10;架橋プローブ−2
「11]プローブ11;捕捉用DNAプローブ−2a
[12]プローブ12;捕捉用DNAプローブ−1b
[13]プローブ13;ターゲット遺伝子−2
[14]プローブ14;HCP−5
[15]プローブ15;HCP−6
[16]プローブ16;捕捉用DNAプローブ−2b
ハイブリッド液として、(0.8μg/μLポリdA、0.1μg/μL酵母tRNA、0.15μg/μLヒトCot−I DNA、5×Denhardt’s液、0.1mg/mL Sarmon sperm DNA、0.2%SDS、6×SSC)のハイブリッド液を用いた。
(実施例1〜3及び比較例1〜3)
(1)目的
Cy3標識した一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)によるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例1〜3)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例1)、50ng/μL(実施例2)、5ng/μL(実施例3)に調製したターゲット遺伝子−1と相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、50ngのターゲット遺伝子−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し1次ハイブリ液Aを調製した。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−1と25pmolのCy3標識したHCP−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Aを調製した。
(比較例1〜3)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例1)、50ng/μL(比較例2)、5ng/μL(比較例3)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Bを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で24時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で16時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスを、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例1〜3及び比較例1〜3の結果を図11に示す。図11に示されるように、自己集合体を形成する実施例1〜3は、自己集合体を形成しない比較例1〜3に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例4〜6及び比較例4〜6)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、SYBR Green Iによる検出を行った。
(2)材料
(実施例4〜6)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例4)、50ng/μL(実施例5)、5ng/μL(実施例6)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのHCP−1と25pmolのHCP−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Cを調製した。
(比較例4〜6)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例4)、50ng/μL(比較例5)、5ng/μL(比較例6)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのHCP−1をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Dを調製した。
(3)方法
実施例1〜3及び比較例1〜3と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
原液を0.5×TBEで1000倍希釈したSYBR Green Iをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で3分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(475nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例4〜6及び比較例4〜6の結果を図12に示す。図12に示されるように、自己集合体を形成する実施例4〜6は、自己集合体を形成しない比較例4〜6に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、SYBR Green Iにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例7〜9及び比較例7〜9)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、PicoGreenによる検出を行った。
(2)材料
(実施例7〜9)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例7)、50ng/μL(実施例8)、5ng/μL(実施例9)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Cを用いた。
(比較例7〜9)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例7)、50ng/μL(比較例8)、5ng/μL(比較例9)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Dを用いた。
(3)方法
上記実施例1〜3及び比較例1〜3の(3)と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
原液をTEで200倍希釈したPicoGreenをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で30分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(475nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例7〜9及び比較例7〜9の結果を図13に示す。図13に示されるように、自己集合体を形成する実施例7〜9は、自己集合体を形成しない比較例7〜9に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、PicoGreenにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例10〜12及び比較例10〜12)
(1)目的
一対のHCP(HCP−1及びHCP−2)を用いて、EtBrによる検出を行った。
(2)材料
(実施例10〜12)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例10)、50ng/μL(実施例11)、5ng/μL(実施例12)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Cを用いた。
(比較例10〜12)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例10)、50ng/μL(比較例11)、5ng/μL(比較例12)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、上記2次ハイブリ液Dを用いた。
(3)方法
上記実施例1〜3及び比較例1〜3の(3)と同様の手順及び条件にて、実験を行った。
(4)検出方法
10μg/μLのEtBrをこのスライドグラスのスポット面に滴下し、室温で30分間静置した。室温の0.5×TBEで3回すすぎ、このスライドグラスをエアスプレーで乾燥させ、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例10〜12及び比較例10〜12の結果を図14に示す。図14に示されるように、自己集合体を形成する実施例10〜12は、自己集合体を形成しない比較例10〜12に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用し、EtBrにより検出することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実施例13〜15及び比較例13〜15)
(1)目的
実施例1〜3のHCPとは異なる一対のHCP(HCP−3及びHCP−4)を用いて、Cy3標識した一対のHCPによるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例13〜15)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例13)、50ng/μL(実施例14)、5ng/μL(実施例15)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したHCP−3と25pmolのCy3標識したHCP−4をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Eを調製した。
(比較例13〜15)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例13)、50ng/μL(比較例14)、5ng/μL(比較例15)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液として、25pmolのCy3標識したプローブ5をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱し2次ハイブリ液Fを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて54℃で6時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例13〜15及び比較例13〜15の結果を図15に示す。図15に示されるように、自己集合体を形成する実施例13〜15は、自己集合体を形成しない比較例13〜15に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のHCPによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。実施例1〜3との比較より、一対のHCPの塩基配列及び反応条件を調節することにより、より検出感度を向上させることが可能なことがわかる。
(実施例16〜18及び比較例16〜18)
(1)目的
Cy3標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによるシグナル増幅の効果を調べた。
(2)材料
(実施例16〜18)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(実施例16)、50ng/μL(実施例17)、5ng/μL(実施例18)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液を以下の如く調製した。25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブ−1と25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブ−2をハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱後、45℃で16時間静置した。これに50μMの架橋プローブ−1溶液及び50μMの架橋プローブ−2溶液を0.5μL加え2次ハイブリ液Gを調製した。
(比較例16〜18)
(a)捕捉用プローブは、500ng/μL(比較例16)、50ng/μL(比較例17)、5ng/μL(比較例18)に調製した捕捉用DNAプローブ−1aをそれぞれ用いた。
(b)1次ハイブリ液として、上記1次ハイブリ液Aを用いた。
(c)2次ハイブリ液を以下の如く調製した。25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブと25pmolのCy3標識したダイマー形成用プローブをハイブリッド液10μLで溶解し95℃で2分間加熱後、45℃で16時間静置した。これに蒸留水0.5μLを加え2次ハイブリ液Hを調製した。
(3)方法
捕捉用プローブをスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。このスライドグラスのスポット面に1次ハイブリ液25μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて42℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
更にこのスライドグラスのスポット面に2次ハイブリ液10μLを滴下しカバーグラスを被せハイブリチャンバーに入れて58℃で2時間静置した。その後、スライドグラスを取り出し、室温の2×SSC、0.1%SDS中でカバーグラスを外し、2×SSC、0.1%SDSでスライドグラスをすすいだ。更に1×SSC中、室温の0.2×SSC中でそれぞれ2分間静置後、スライドグラスをエアスプレーで乾燥させた。
(4)検出方法
上記スライドグラスに対して、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(5)結果
実施例16〜18及び実施例16〜18の結果を図16に示す。図16に示されるように、自己集合体を形成する実施例16〜18は、自己集合体を形成しない比較例16〜18に比べて、非常に蛍光強度が増大していた。Cy3標識した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブによる自己集合体形成反応を利用することにより、捕捉用プローブの濃度に依存して、DNAチップのシグナルが著しく増幅された。
(実験例1〜4)
(1)目的
Cy3標識した一対のHCP2種(HCP−3とHCP−4、HCP−5とHCP−6)を用いて、HCPによるシグナル増幅の特異性を調べた。
(2)材料
(a)捕捉用プローブは、50pmol/μL又は5pmol/μLにそれぞれ調製した、ターゲット遺伝子−2に相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−2aもしくはターゲット遺伝子−1と相補的な領域を有する捕捉用DNAプローブ−1bを用いた。
(b)実験例1では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Bを用いた。ターゲット遺伝子−1;3pmolをハイブリ液X(5×Denhardt’s液、0.1mg/mL Salmon sperm DNA、0.2%SDS、6×SSC)30μLに溶解し、95℃で2分加熱し、1次ハイブリッド液Bを調製した。
実験例2では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Cを用いた。ターゲット遺伝子−2;3pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Cを調製した。
実験例3では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Dを用いた。ターゲット遺伝子−1とターゲット遺伝子−2それぞれ3pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Dを調製した。
実験例4では、1次ハイブリ液として、下記の如く調製した1次ハイブリッド液Eを用いた。ターゲット遺伝子を加えないハイブリ液X:30μLを95℃ 2分加熱し、1次ハイブリッド液Eを調製した。
(c)2次ハイブリ液として、Cy3標識したHCP−5とCy3標識したHCP−6とCy3標識したHCP−3とCy3標識したHCP−4それぞれ30pmolをハイブリ液X:30μLに溶解し、95℃2分加熱し、2次ハイブリ液Xを調製した。
(3)方法
捕捉用DNAプローブ−2(50pmol/μL又は5pmol/μL)又は捕捉用DNAプローブ−1b(50pmol/μL又は5pmol/μL)をそれぞれスライドグラス上にスポッティングしプローブの固定化を行った。同様にスポットしたスライドガラス4枚のそれぞれに一次ハイブリ液B〜E:25μLをin situ PCR用チャンバー内に滴下した後、シールし、42℃で2時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での2×SSC・0.1%SDSで2度すすいだ。続いて1×SSC、0.2×SSC中でそれぞれ2分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させた。
次に2次ハイブリ液25μLをin situ PCR用チャンバー内に滴下した後、シールし、57.7℃2時間静置した。その後、チャンバーをはずし、室温での2×SSC・0.1%SDSで2度すすいだ。続いて1×SSC、0.2×SSC中でそれぞれ2分静置した後、エアスプレーでスライドを乾燥させ、蛍光顕微鏡(580nm)で観察を行った。
(4)結果
実験例1〜4の結果を図17に示す。図17に示されるように、捕捉用DNAプローブ−1bが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−1が捕捉され、HCPによりシグナルが増幅された。また、捕捉用DNAプローブ−2aが固定化された場所では、ターゲット遺伝子−2が捕捉され、HCPによりシグナルが増幅された。
(実験例5及び6)
(1)目的
支持体に微分パルスボルタンメトリー法により電流値が測定できる金電極を使用し、蛍光のインターカレーターの代わりに電気化学的に活性なインターカレーターを使用して、HCPによる遺伝子のシグナル増幅を調べた。
(実験例5)
(2)材料および方法
金電極(BAS社製)を0.05μmのアルミナパウダーサスペンジョン(バイカロックス社製)により研磨し、滅菌蒸留水でリンス後、100%エタノール中で15分間超音波洗浄した。滅菌蒸留水でリンス後、Au表面を乾燥させ、10pmol/μLに調製した捕捉用DNAプローブ−2bをAu上に2μLアプライした。乾燥を防ぐためにキャップをして、湿潤箱に入れて、室温で一晩静置した。
滅菌蒸留水でリンス後、測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、ALS630(BSA社製)を用いて微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブの値:i0)。
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−2;1pmol/μLを含有させた5×SSC溶液を調製した。滅菌蒸留水でリンス後、上記ターゲット溶液を2μL、Au電極上にアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ、45℃で180分静置しハイブリダイゼーションを行い、2×SSC+0.1%SDSで1回、0.2×SSC+0.1%SDSで2回、1×SSCで1回、0.2×SSCで1回洗浄後、乾燥させた。
測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブにターゲットが結合した時の値:i1)。
滅菌蒸留水でリンス後、一対のHCPを含有する溶液[HCP−5及びHCP−6を各0.156pmol/μL、12×SSC、10μM Hoechist33258]をAu電極上に2μLアプライした。
キャップ後、湿潤箱に入れ58℃で120分静置してポリマーを形成させた。
2×SSC+0.1%SDSで1回、0.2×SSC+0.1%SDSで2回、1×SSCで1回、0.2×SSCで2回洗浄後、乾燥させ、測定バッファー[0.1M酢酸バッファー(pH5.6、酢酸カリウム/酢酸)、0.1M塩化カリウム、50μM Hoechist33258]中で180秒静置後、微分パルスボルタンメトリー法により電流値を測定した(捕捉用プローブに結合しているターゲットにHCPを結合させて自己集合させた時の値:i2)。
(実験例6)
ターゲット溶液として、ターゲット遺伝子−2;1pmol/μLを含有させた5×SSC溶液の代わりに、ターゲット遺伝子−2;0.5pmol/μLを含有させた5×SSC溶液を調製して用いた以外は上記実験例5と同様の手順及び条件により実験を行った。
(5)結果
表1は実験例5(ターゲット遺伝子−2;1pmol/μL)、表2は実験例6(ターゲット遺伝子−2;0.5pmol/μL)の結果である。
表1及び表2の結果に示した如く、表1、表2ともにターゲット遺伝子のみをハイブリダイゼーションさせた時よりも、HCPを使い自己集合させた時の方が、得られる電流のピーク値の増加率が大きくなった。
産業上の利用可能性
上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドの自己集合反応を利用したDNAチップのシグナル増幅方法により、煩雑な操作を行うことなく、簡便にDNAチップのターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上させることが可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ100を原理的に示す模式図である。
図2は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1〜第4の例におけるステップ102を原理的に示す模式図である。
図3は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ110を原理的に示す模式図である。
図4は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第1の例におけるステップ114を原理的に示す模式図である。
図5は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ122を原理的に示す模式図である。
図6は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第2の例におけるステップ124を原理的に示す模式図である。
図7は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ130を原理的に示す模式図である。
図8は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ132を原理的に示す模式図である。
図9は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第3の例におけるステップ134を原理的に示す模式図である。
図10は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第4の例におけるステップ144を原理的に示す模式図である。
図11は、実施例1〜3及び比較例1〜3の結果を示す写真である。
図12は、実施例4〜6及び比較例4〜6の結果を示す写真である。
図13は、実施例7〜9及び比較例7〜9の結果を示す写真である。
図14は、実施例10〜12及び比較例10〜12の結果を示す写真である。
図15は、実施例13〜15及び比較例13〜15の結果を示す写真である。
図16は、実施例16〜18及び比較例16〜18の結果を示す写真である。
図17は、実験例1〜4の結果を示す写真である。
Claims (18)
- オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応を利用し、DNAチップにおけるターゲット遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とするDNAチップのシグナル増幅方法。
- 前記自己集合反応が、互いに相補的な部分がn(n≧3)カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブの複数対を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、2本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項1記載のシグナル増幅方法。
- 前記自己集合反応が、No.1及びNo.2の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域、中央領域、及び5’側領域の3つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第1の系と、
No.3及びNo.4の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを3’側領域及び5’側領域の2つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの3’側領域及び5’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第2の系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項1記載のシグナル増幅方法。 - 前記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項3記載のシグナル増幅方法。 - 前記プローブの塩基配列を、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.3−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
第1の系のNo.2−オリゴヌクレオチドの3’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの3’側領域、
第1の系のNo.1−オリゴヌクレオチドの5’側領域と第2の系のNo.4−オリゴヌクレオチドの5’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項3記載のシグナル増幅方法。 - 前記DNAチップが、ターゲット遺伝子を捕捉するための遺伝子を結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体を用いることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記ターゲット遺伝子に一本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記ターゲット遺伝子に二本鎖のDNA及び/又はRNAを用いることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記ターゲット遺伝子にSNPs(一塩基多形)を用いることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめターゲット遺伝子と相補的な配列にすることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記ターゲット遺伝子と前記自己集合体を繋ぐために、ターゲット遺伝子の塩基配列と自己集合体の形成に使用するオリゴヌクレオチドの塩基配列に対して、それぞれに相補的な領域を持つジョイント・プローブを用いることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記ターゲット遺伝子に結合したオリゴヌクレオチドの自己集合反応により形成された自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項12記載のシグナル増幅方法。
- 前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項記載のシグナル増幅方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、PNAまたはLNAのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項1〜17のいずれかに記載のシグナル増幅方法。
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