JP4121757B2 - オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法及び遺伝子の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイマーを形成する一対のオリゴヌクレオチドの複数対とそのダイマーを架橋する一対のオリゴヌクレオチドの複数対を使用するオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法、該方法により形成された自己集合体、該自己集合体の検出方法、および該自己集合体の作製方法を利用するターゲット遺伝子の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一対のオリゴヌクレオチドが相補的塩基配列に従って正確に結合するハイブリダイゼーション法（Judy,M.,Geoffrey,W.Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports.Analytical Biochemistry,138,267-284,1984）は、サザンブロット法（Southern,E.M.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol.Biol.,98,503-517,1975）、ノーザンブロット法（Thomas,P.S.Hybridization of denatured RNA and small DNA fragmenta transferred to nitrocellulose. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 77,5201-5205,1980）、in situ hiblydization法（Jones,K.W.,et al. Chromosomal and nuclear location of mouse satellite DNA in individual cells. Nature. 225,912-915,1970）や近年汎用されているＤＮＡチップ法（Marshall,A., Hodgson,J. DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol. 16,27-31,1998）などの遺伝子を解析する基本技術として広く応用されている。
【０００３】
また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げるために開発された耐熱性ＤＮＡリガーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＬＣＲ法（United States Patent No.5,792,607）や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＰＣＲ法（Saiki,R.,S.Scharf,F.Faloona,et al.Enzymatic amplification ofβ-globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.230,1350-1354(1985)）などの遺伝子増幅法も、基本的にはこのオリゴヌクレオチドが正確にハイブリダイゼーションすることを利用したものである。
【０００４】
しかし、サザンブロット法、ノーザンブロット法、in situ hiblydization法、ＤＮＡチップ法では、遺伝子を増幅することができないために微量の遺伝子を検出することが困難であり、また、ＬＣＲ法やＰＣＲ法では、その増幅操作に加えて検出するための煩雑な操作が必要なため高コストであった。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の問題点に鑑み、本発明者等は、酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（USP6,261,846、日本特許３２６７５７６号及びEP1002877A）。この方法は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（HoneyComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイブリダイズし、プローブの自己集合によりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる（Probe alternation link self-assembly reaction、以下、このオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法をＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
【０００６】
本発明は、このＰＡＬＳＡＲ法に検討を加え、オリゴヌクレオチドの自己集合による自己集合体の作製において、その二本鎖の規則的な高次構造の形成にかかる反応時間を短縮し、至適反応温度域を広くし、その操作性と応用性を高くするために更なる改良を試みたものである。
【０００７】
本発明は、複数対のダイマー形成用プローブで形成した複数のダイマーに対して、複数対の架橋プローブでそのダイマーを架橋することにより、二本鎖の規則的な高次構造の形成にかかる反応時間を短縮し、また、至適反応温度域を広くし、操作性と応用性を高くすることを可能としたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法、及び得られた自己集合体の性質を利用した簡便な遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが報告した酵素を使用しない新規な上記等温核酸増幅法は、３個所の領域から構成される一対のプローブを用いる方法であるが、この第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有しているため、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様にそれぞれの領域が競い合うようにして反応するため、ＰＡＬＳＡＲ法では、厳密な反応温度と３０分以上の反応時間が必要であった。
【０００９】
また、本発明者らは上記したＰＡＬＳＡＲ法及びライゲーション反応を用いた方法を既に提案した（特願２０００−２６１６８７）。このライゲーション反応を利用した方法では、図２（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマーの中央領域（Ｙ）を特定のターゲット遺伝子と相補的になるように設定しておき、その相補的な領域をあらかじめ切断した場合、図２（ｂ）に示したように切断された部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応により連結されるが、一方では特定のターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションと同時に、図２（ｃ）に示したようなダイマーの形成により、図２（ｄ）に示したような複合体を形成するために、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション効率が低下するという欠点があった。
【００１０】
上記した課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、一対のダイマー形成用プローブで形成したダイマーに対して、一対の架橋プローブでそのダイマーを架橋することにより、ＰＡＬＳＡＲ法における反応時間を短縮し、また、至適反応温度域を広くすることを見出した。加えて、図１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマーの中央領域（Ｂ）を特定のターゲット遺伝子と相補的になるように設定しておき、その相補的な領域をあらかじめ切断した場合、図１（ｂ）に示したように切断された部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応により連結され、一方、図１（ｃ）に示したようなダイマーが形成されてもそれ以上反応しないために複合体が形成されず、ターゲット遺伝子との高いハイブリダイゼーション効率が得られることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とする。
【００１２】
上記自己集合体の作製方法において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ＝1の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１３】
ｎ＝1の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１４】
上記自己集合体の作製方法において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１５】
ｎ≧２の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１６】
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブ（本明細書において、これらを単にプローブと称す場合がある）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
【００１７】
上記プローブのハイブリダイゼーションは、あらかじめ上記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、上記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。
【００１８】
上記複数対のダイマー形成用プローブとして、上記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形成用プローブからなるものを用いることができる。
【００１９】
上記架橋プローブが、３’側領域と５’側領域の中央部にダイマー形成用プローブと架橋プローブの各領域の塩基配列とは非相補的な領域（以下、フリーサイト領域（Free site regions）と称す）を有することが好適である。
【００２０】
上記フリーサイト領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びオリゴヌクレオチドと結合できるペプチド、ポリマー性粒子、磁性体粒子、またはその他の化合物から構成されるものを用いることができる。
【００２１】
上記一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列とすることも可能である。
【００２２】
上記プローブの相補的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることが可能となる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体（以下、単に自己集合体と称すことがある。）は、上記方法で形成されたものである。
【００２４】
本発明の自己集合体の検出方法の第1の態様は、上記自己集合体を、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することを特徴とする。
【００２５】
本発明の自己集合体の検出方法の第２の態様は、上記自己集合体を、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することを特徴とする。
【００２６】
本発明の自己集合体の検出方法の第３の態様は、上記自己集合体を、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することを特徴とする。
【００２７】
本発明の遺伝子の検出方法は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いる遺伝子の検出方法であり、上記ダイマー形成用プローブ及び／又は架橋プローブのオリゴヌクレオチドを、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むように構成し、ターゲット遺伝子と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、温度制御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反応及び解離反応をさせ、該切断されたプローブを連結させて完全なプローブを形成させ、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いて自己集合体を作製させ、該自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することを特徴とする。
【００２８】
上記ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとして、上記ダイマー形成用プローブを用いて、ダイマー形成用プローブのオリゴヌクレオチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する領域となるように構成し、ターゲット遺伝子と相補的なダイマー形成用プローブの各オリゴヌクレオチドの中央領域の片側、または両側の一箇所、または複数箇所をあらかじめ切断しておくことが好ましい。
【００２９】
上記遺伝子の検出方法は、さらに具体的には以下の通りである。上記ライゲーション反応において、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有し、その箇所を切断されたプローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたままのプローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたプローブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。温度制御により、上記ハイブリダイゼーション反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連結させて完全なプローブを形成させる。連結したプローブは上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法により、二本鎖の自己集合体を形成する。ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたプローブは連結されず、切断されたプローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成の有無により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。
【００３０】
自己集合体の形成は、ターゲット遺伝子の量に依存しており、形成された自己集合体の量を測定することにより、ターゲット遺伝子の量を測定することが可能である。
【００３１】
上記自己集合体は、第一に、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することができる。
【００３２】
上記自己集合体は、第二に、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することが可能である。
【００３３】
上記自己集合体は、第三に、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することができる。
【００３４】
上記ライゲーション反応を、リガーゼ酵素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオートライゲーションを用いて行うことが好ましい。
【００３５】
上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることができる。
【００３６】
上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることが可能である。
【００３７】
上記あらかじめ切断されたオリゴヌクレオチドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と相補的になるようにデザインされることができる。
【００３８】
上記方法においては、反応温度を制御する機器を使用することが好適である。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法は、３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
３’側領域及び５’側領域の２つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させるようにしたことを特徴とする。
【００４１】
本発明は、複数対のダイマー形成用プローブで形成された複数のダイマーに対して、複数対の架橋プローブを等温で酵素不在の条件下で反応させることによりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させるものである。使用するプローブの本数は特に限定されない。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜７０℃である。これら条件は特に限定されない。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ＝１、即ち、一組のダイマー形成用プローブ及び一組の架橋プローブを用いる場合について例示する。一例として、第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、図３（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００４３】
一方、第２の系においては、図３（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−２）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００４４】
次に、図４（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図４（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法におけるｎ＝１の場合の別の例として、図５（ａ）に示した一対の架橋プローブにおける３’側領域、及び５’側領域の２つの領域は、図５（ｂ）に示したように、領域の入れ替えが可能である。
【００４６】
第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、図６（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００４７】
一方、第２の系においては、図６（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−４）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００４８】
次に、図７（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−３と架橋プローブ−４を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−３の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−４の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−４の３側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−３の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図７（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ≧２、即ち、二組以上のダイマー形成用プローブ及び二組以上の架橋プローブを用いる場合について例示する。一例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにおける複数対のダイマー形成用プローブから形成される複数のダイマーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることが可能である。
【００５０】
図８及び図９は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図である。二組のダイマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用いた場合は、一組のダイマー形成用プローブは、図８（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５１】
もう一組のダイマー形成用プローブは、図８（ｃ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５２】
一方、二組の架橋プローブは、図８（ｂ）、図８（ｄ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−７）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−８）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００５３】
次に、図９（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４から形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−５とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−７、架橋プローブ−８を加えると、
ダイマー形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−７の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−８の３’側領域（Ｌ）、ダイマー形成用プローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマー形成用プローブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プローブ−５の３’側領域（Ｈ）と架橋プローブ−７の３’側領域（Ｈ’）、ダイマー形成用プローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ−８の５’側領域（Ｊ）、ダイマー形成用プローブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域（Ｅ）、
が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図９（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００５４】
図１０は、本発明の自己集合体の作製方法におけるｎ＝４の場合の一例を示す模式図である。図１０（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を有し、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ’）、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ’）、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ）、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ）、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ’）、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ’）、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、
第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ）、
がそれぞれ相補的な塩基配列であるため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１０（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成される。
【００５５】
図１０（ｂ）に示したように、ダイマー形成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プローブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマー形成用プローブの第７の系と第１の系を架橋プローブの第８の系が、それぞれ架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、自己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・・・７，８，１，２，３，４，５，６，７，８，１，２，・・・７，８，１，・・・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ，１，２，・・・２ｋ−１，２ｋ，１，・・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成する。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法におけるｎ≧２の場合の別の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系までの順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにおける複数対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な自己集合体を形成させることが可能である。
【００５７】
図１１は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の別の例を示す模式図である。二組のダイマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用いた場合は、一組のダイマー形成用プローブは、図１１（ａ）に示したように、上記したｎ＝２の場合の一例と同様、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５８】
もう一組のダイマー形成用プローブは、図１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５９】
一方、二組の架橋プローブは、図１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−９）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−１０）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００６０】
次に、図１１（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４から形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−５とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−９、架橋プローブ−１０を加えると、
ダイマー形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１０の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−１０の３’側領域（Ｌ）、ダイマー形成用プローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマー形成用プローブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プローブ−５の３’側領域（Ｈ）と架橋プローブ−９の３’側領域（Ｈ’）、ダイマー形成用プローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ−９の５’側領域（Ｊ）、ダイマー形成用プローブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域（Ｅ）、
が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１１（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成されるＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６１】
図１２は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の別の例を示す模式図である。図１２（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を有し、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ’）、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ’）、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ）、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ）、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ’）、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ’）、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ）、
がそれぞれ相補的な塩基配列であるため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１２（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成されるＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６２】
図１２（ｂ）に示したように、ダイマー形成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プローブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマー形成用プローブの第１の系同士を架橋プローブの第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドが、ダイマー形成用プローブの第７の系同士を架橋プローブの第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドが、それぞれ架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、自己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・・・７，８のＮｏ．１（８1），７，６，５，４，３，２，１，８のＮｏ．１（８2），１，２，３，４，５，６，７，８1，７・・・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ1，２ｋ−１，２ｋ−２・・・３，２，１，２ｋ2，１，２，３・・・２ｋ−２，２ｋ−１，２ｋ1，２ｋ−１，２ｋ−２・・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成する。
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法においては、図１３に示すように、架橋プローブにおける２領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋プローブを用いて、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法に従い、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。例えば、ｎ＝１の場合、一組のダイマー形成用プローブは、図１３（ａ）に示したように、上記ｎ＝１の第１の系で用いたダイマー形成用プローブと同じダイマー形成用プローブ１とダイマー形成用プローブ２から構成されている。
【００６４】
一方、架橋プローブは、図１３（ｂ）に示したように、上記ｎ＝１の一例の第２の系で用いた架橋プローブの領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋プローブ−１１と架橋プローブ−１２から構成されている。
【００６５】
次に、図１４（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１１と架橋プローブ−１２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−１２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−１２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１４（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、非相補的な塩基配列とは、お互いにハイブリダイズしない塩基配列であれば、いかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。例えば、図１５に示すように、一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列としたダイマー形成用プローブを用いて、上記自己集合体の作製方法に従い、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。ｎ＝１の場合、図１５（ａ）及び（ｂ）に示したように、中央領域をお互いに相補的な配列とし、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブ−１１を一対のダイマー形成用プローブとして用いることができる。この場合、一対の架橋プローブは、図１６（ｂ）に示した如く、同一なオリゴヌクレオチドとなる。図１７に示す如く、上記一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、上記架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１７（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６７】
本発明に係る自己集合体の作製方法において、ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させる時期は、ダイマー形成前のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させても良く、あらかじめダイマー形成用プローブによりダイマーを形成させた後に架橋プローブと反応させても良く、特に限定されないが、あらかじめダイマーを形成させた後、架橋プローブと反応させ、自己集合体を形成させる方がより好適である。
【００６８】
上記ダイマー形成用プローブの構成は、各系のダイマー形成用プローブが１種類のものでもよく、１つの系に中央領域の異なる数種類のダイマー形成用プローブを含んでいてもよく、特に限定されない。更にはお互いに完全に相補性のないダイマー形成用プローブ及び架橋プローブのセットを、２組以上同時におこなってもよい。
【００６９】
上記自己集合体の作製方法で用いられるプローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.）が挙げられる。また、一対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるプローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００７０】
上記プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
【００７１】
上記プローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００７２】
本発明の自己集合体の作製方法において、使用するプローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることにより、塩基の積み重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、より安定した二本鎖の自己集合体を形成させることができる。
【００７３】
図１８の矢印に示したように、互い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の各領域の末端部分の塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）にすることにより、図１９（ａ）に示したように、塩基の積み重ね（stacking of base）によりπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、図１９（ｂ）に示したように安定した２本鎖の自己集合体が形成される。
【００７４】
上記ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い形成される自己集合体は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収度の強度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現する特徴を有する、塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるものである。従って、淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認し、さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認することが可能である。
【００７５】
ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブの互い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の領域はおよそ２０塩基（20 bases）であるが、図１９（ｂ）の円形で示した各領域の末端部分の結合を強固にすることによって、積み重ね効果（stacking effect）が増し、結果的にその末端部分にはさまれている２０塩基の領域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられる。
【００７６】
上記の相補領域末端部分に配置されるＣまたはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であっても差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮して適宜選択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる場合、Ｃ、Ｇの順序は特に限定されず自由に組み合わせることができる。また、下記に記載されるターゲット遺伝子の検出法において、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列をプローブの一領域として採用する場合も、相補領域の端部にＣまたはＧを配置するように選択することが可能である。
【００７７】
本発明のオリゴヌクレオチド自己集合体の作製方法を利用して、試料中のターゲット遺伝子の検出が可能である。
【００７８】
本発明の遺伝子の検出方法におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。
【００７９】
以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いた、遺伝子の検出方法を具体的に示す。下記ライゲーション反応は、Ligase（リガーゼ）酵素を使用する方法と酵素を使わず特殊なオリゴヌクレオチドを使用する方法のいずれにも限定されない方法である。
【００８０】
以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ＝１の場合の一例として述べたプローブを用いた場合のターゲット遺伝子の検出方法の一例について述べる。図２０〜図２３は、一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを用いたライゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図である。
【００８１】
本発明のターゲット遺伝子の検出の一例として、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するオリゴヌクレオチドは、第１の系においては、図２０（ａ）に示したように、ｎ＝１の場合の第１の系で用いたダイマー形成用プローブと同じダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から構成されているが、中央のＢ領域、Ｂ’領域は相補的な塩基配列であると同時にターゲット遺伝子とも相補的な塩基配列である。そして、このＢ領域の中央部分を切断してできた５’側の部分がダイマー形成用プローブ−７、３’側の部分がダイマー形成用プローブ−８である。同様にして、Ｂ’領域の中央部分を切断してできた３’側の部分がダイマー形成用プローブ−９、５’側の部分がダイマー形成用プローブ−１０である。
【００８２】
一方、架橋プローブは、図２０（ｂ）に示したように、ｎ＝１の場合の一例における第２の系と同じ架橋プローブ−１と架橋プローブ−２から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００８３】
次に、図２１（ａ）に示したターゲット遺伝子のＢ領域、Ｂ’領域に対して、図２１（ｂ）に示したダイマー形成用プローブ−７、ダイマー形成用プローブ−８、ダイマー形成用プローブ−９、ダイマー形成用プローブ−１０がハイブリダイズする。
【００８４】
図２１（ｃ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−７とダイマー形成用プローブ−８，ダイマー形成用プローブ−９とダイマー形成用プローブ−１０は、それぞれが隣接してハイブリダイズするために、図２１（ｄ）に示したように、ライゲーション反応によって隣接した部分が連結され、完全な形のダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２が完成する。
【００８５】
解離後、図２２（ｅ）に示した完成したダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２は、図２２（ｆ）に示したように、連結していない未反応なダイマー形成用プローブ−７とダイマー形成用プローブ−８、ダイマー形成用プローブ−９とダイマー形成用プローブ−１０の新しいターゲット遺伝子となるため、図２２（ｇ）のようにハイブリダイズして、図２２（ｈ）に示したように、ライゲーション反応によって隣接した部分が連結され、温度コントロールにより解離とハイブリダイゼーションとライゲーション反応を繰り返すことにより、完全な形のダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２が次々に完成する。
【００８６】
このライゲーション反応でできたダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、図２３（ｉ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図２３（ｊ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００８７】
ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のダイマー形成用プローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のダイマー形成用プローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断したプローブを用いることも可能である。
【００８８】
次に、ｎ＝１の場合のプローブを用いた本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を利用したターゲット遺伝子の検出方法の別の例について述べる。図２４及び図２５は、それぞれ切断される中央領域が異なる２組の一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを用いて、切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図である。
【００８９】
図２４（ａ）〜（ｃ）に示すように、ターゲット遺伝子とそれぞれ相補的な領域（α及びα’領域、β及びβ’領域）を有し、その箇所を切断されたダイマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後（図２４（ｄ）（ｅ））、ライゲーション反応によって連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたままのダイマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたダイマー形成用プローブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。９５℃〜２５℃の範囲の温度コントロールにより、上記ハイブリダイゼーション反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連結させて完全なダイマー形成用プローブを形成させる。
【００９０】
連結したダイマー形成用プローブから形成されたダイマー［図２５（ｆ）（ｇ）］に対して、図２５（ｈ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図２５（ｉ）に示したように、プローブが自己集合して二本鎖の自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００９１】
ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のプローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のプローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断したプローブを用いることも可能である。
【００９２】
上記方法では、ダイマー形成用プローブの中央領域をターゲット遺伝子と相補的となるように構成したが、５’側領域や３’側領域をターゲット遺伝子と相補的な領域とし、その領域をあらかじめ切断しておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。また、ダイマー形成用プローブの代わりに、架橋プローブを、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するように構成し、あらかじめ架橋プローブのターゲット遺伝子と相補的な領域を有する部分を切断し、ライゲーション反応によりターゲット遺伝子を検出することもできる。
【００９３】
上記の方法を応用することにより、１本鎖のターゲット遺伝子や、ＳＮＰｓの検出が可能である。１本鎖のターゲット遺伝子の検出の場合は、ターゲット遺伝子と相補的な領域を一箇所以上切断したプローブを用いること等により検出可能である。ＳＮＰｓの検出の場合は、ＳＮＰｓを含む領域が相補的な領域となるようなプローブを作製し、その箇所を切断したプローブを用いること等により、検出可能である。
【００９４】
ターゲット遺伝子を検出する別の具体的手法としては、たとえば、まず最初に検体試料と少なくとも１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝子と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも一種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次いで、自己集合体を形成する一対のプローブの一方を添加し反応させた後、もう一方のプローブを反応させてターゲット遺伝子・自己集合体複合体を形成させる。次いで、アビジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ該複合体と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体を未反応物質から分離する。最後に、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎＩのようなインターカレーター色素を反応させ、紫外線照射により自己集合体の量を定量することにより、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定する。形成させた自己集合体の分離を容易にするために、磁気ビーズを使用することもできる。
【００９５】
別の手法としては、たとえば、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを固相化したウェルを使用することができる。まず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次いで、上記の方法に準じて、自己集合体を形成するプローブを順次添加することにより、自己集合体が形成され結合することになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗浄することにより容易にでき、自己集合体量を測定することによりターゲット遺伝子を測定できる。
【００９６】
この手法に準じれば、ＤＮＡチップへの応用も可能である。
【００９７】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないことは勿論である。
【００９８】
以下に、実施例１〜実施例１３で使用したダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）：
5’-GTG CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G AAC AGG ATC CTA GAC CTA G ・CA TAG TAC AGT CCG ATG GTG-3’
［２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）：
5’-CCT CAA GAC GCA TGT CTT TC ・C TAG GTC TAG GAT CCT GTT C ・CT AGA ACG GAC TGT ACT TCG-3’
［３］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・C ACC ATC GGA CTG TAC TAT G-3’
［４］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）：
5’-GAA AGA CAT GCG TCT TGA GG ・C GAA GTA CAG TCC GTT CTA G-3’
［５］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）：
5’-GAA AGA CAT GCG TCT TGA GG ・T CGA CT ・ C GAA GTA CAG TCC GTT CTA G-3’
［６］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・T CAG CT ・ C ACC ATC GGA CTG TAC TAT G-3’
【００９９】
以下に、実施例１４で使用したターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［７］ターゲット遺伝子：
5’-GGA TCC TAG ACC TAG ・ TG TTT GAG GGT GGA TAG CAG TAC CTG AGC CAT ・ CTA GGT CTA GGA TCC-3’
［８］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）：
5’-G CTG ACT TAA CCG GAT AC ・ ATG GCT CAG GTA CTG C-3’
［９］ダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）：
(P) 5’-TAT CCA CCC TCA AAC A ・G ATT GGT ACT GCG AGA TA-3’
【０１００】
以下に、実施例１５及び１６で使用したダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［１０］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３）：
5’-GTG CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G ATT ATG GCT CAG GTA CTG C-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３Ｐ）：
(P)5’-TAT CCA CCC TCA AAC AGG TG・GATTGGT ACT GCG AGA TAG G-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４）：
5’-GAC GCT TTC TGC GTG TAT AG ・C ACC TGT TTG AGG GTG GAT A-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１３］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）：
(P)5’-G CAG TAC CTG AGC CAT AAT C ・CT AGA ACG GAT CGT ACT TCG-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１４］架橋プローブ−（Ａ−５）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・C CTA TCT CGC AGT ACC AAT C-3’
［１５］架橋プローブ−（Ａ−６）：
5’-CTA TAC ACG CAG AAA GCG TC ・C GAA GTA CGA TCC GTT CTA G-3’
【０１０１】
（実施例１及び比較例１）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１０２】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させてダイマー溶液を作製した。
【０１０３】
図２６に示したように、このダイマー溶液に５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。対照として、上記ダイマー溶液に５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）のみを１μＬ加えた場合を同様に行った（比較例１）。
【０１０４】
３．結果
図２７のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）に示したように、ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加えたものにおいてのみ、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認できた（実施例１）。ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーの５’側と３’側（ダイマー形成用プローブ−（Ａ−１））とだけに相補的な領域を持つ架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）だけでは、オリゴヌクレオチドの自己集合反応であるＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体は形成されなかった（比較例１）。
【０１０５】
（比較例２〜４）
１．目的
１本のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１０６】
２．方法
比較例２において、図２８に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、Ｈ2Ｏを７μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１０７】
比較例３において、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順及び条件にて反応させた。比較例４において、架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順及び条件にて反応させた。
【０１０８】
３．結果
図２９のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、比較例２〜４のいずれにおいても、自己集合体は検出されず、一本のダイマー形成用プローブに対して、一対の架橋プローブを加えても自己集合反応であるＰＡＬＳＡＲ法によるオリゴヌクレオチドによる自己集合体は形成されなかった。
【０１０９】
（実施例２〜５及び比較例５）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと濃度を変えた一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１１０】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させてダイマー溶液を作製した。
【０１１１】
図３０に示したように、このダイマー溶液に５０ｐｍｏｌ（実施例２）、２５ｐｍｏｌ（実施例３）、５ｐｍｏｌ（実施例４）、０．５ｐｍｏｌ（実施例５）の架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）をそれぞれ１μＬずつ加え、６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。対照として、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）及び架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を添加しない場合についても同様に行った（比較例５）。
【０１１２】
３．結果
図３１のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）に示したように、ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、５ｐｍｏｌ以上の架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加えたものにおいて、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認できた（実施例２〜４）。
【０１１３】
（実施例６）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応温度の違いによる自己集合体の形成。
【０１１４】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図３２（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１１５】
次に、このダイマー溶液に図３２（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１１６】
３．結果
図３３に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図３４に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1002877A等）に比べて、幅広い反応温度で自己集合体を形成できることが確認できた。
【０１１７】
（実施例７）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応時間の違いによる自己集合体の形成。
【０１１８】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマ用ープローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図３５（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１１９】
次に、このダイマー溶液に図３５（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、６４℃で各反応時間（０、１０秒、３０秒、１分、１０分及び３０分）で反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１２０】
３．結果
図３６に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図３７に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1002877A等）に比べて、きわめて短時間に自己集合体を形成することが確認できた。
【０１２１】
（実施例８）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを同時に反応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１２２】
２．方法
図３８に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、Ｈ2Ｏを６μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１２３】
３．結果
図３９に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４０に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、予め一対のダイマー形成用プローブでダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた場合と異なり、６４℃以下の反応温度では未完全に自己集合体を形成することができなかった。
【０１２４】
（実施例９及び１０）
１．目的
予め一対のダイマー形成用プローブを作製した後に一対の架橋プローブを反応させた場合（実施例９）と一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させた場合（実施例１０）のインターカレーター（ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ
Ｉ）の蛍光測定による自己集合体の検出。
【０１２５】
２．方法
（実施例９）：予め一対のダイマー形成用プローブを作製した後に一対の架橋プローブを反応させた場合。
【０１２６】
Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Incubation bufferを２μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１５μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４１（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１２７】
次に、このダイマー溶液に図４１（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した［図４１（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４１（ｃ）の写真の○印の温度）について、反応開始から３０秒、５分、１５分、３０分後にそれぞれＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。
【０１２８】
（実施例１０）：一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させた場合
【０１２９】
図４２（ａ）に示したように、Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Incubation bufferを２μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを２３μＬ（計４０μＬ）の反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した［図４２（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４２（ｃ）の写真の○印の温度）について、反応開始から、３０秒、５分、１５分、３０分秒にＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。
【０１３０】
３．結果
図４３に示したように、予め一対のダイマー形成用プローブでダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた場合（実施例９）は、反応と同時に２本鎖の形成に挿入されたインターカレーターにより強い蛍光強度が認められ、その後は時間の経過とともに減少した。
【０１３１】
また、一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを同時に反応させた場合（実施例１０）は、反応時間による蛍光強度に変化は見られなかった。
【０１３２】
このことから、同時に一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを反応させた場合、規則的な二本鎖の形成ではなく、凝集に似た状態で反応が進行するものと思われる。
【０１３３】
（実施例１１）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各反応温度におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形成。
【０１３４】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４４（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。
【０１３５】
このダイマー溶液に対して、図４４（ｂ）に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ加え、各反応温度各（５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１３６】
３．結果
図４５に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４６に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブの場合、幅広い反応温度域でＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認された。
【０１３７】
（実施例１２）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各反応時間におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形成。
【０１３８】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４７（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。
【０１３９】
このダイマー溶液に対して、図４７（ｂ）に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ加え、６４℃における各反応時間（０、１０秒、３０秒、１分、１０分及び３０分）後に氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４０】
３．結果
図４８に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４９に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブの場合、短時間でＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成か確認された。
【０１４１】
（実施例１３）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを同時に反応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１４２】
２．方法
図５０に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ、Ｈ2Ｏを６μＬ（計２０μＬ）を各反応温度（５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４３】
３．結果
図５１に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図５２に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブを一対のダイマー形成用プローブと同時に反応させた場合、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は阻害された。
【０１４４】
（実施例１４及び比較例６）
１．目的
ターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブによるライゲーション反応の確認。
【０１４５】
２．方法
図５３（ｂ）に示したダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）の１６塩基の領域と相補的な３２塩基の塩基配列を持つ図５３（ａ）に示した１００ｐｍｏｌのターゲット遺伝子を１μＬ、T4 Ligase用の１０×Ligation bufferを２μＬ、T4 Ligaseを１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１４μＬ（計２０μＬ）を３８℃で９０分間、６０分間、３０分間または１５分間反応（図５３（ｃ）（ｄ））させた後、１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。対照として、T4 Ligaseを添加しない場合も同様に行った（比較例６）。
【０１４６】
３．結果
図５４に示した１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、６２塩基のターゲット遺伝子（▲１▼）、未反応な３４塩基のダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）（▲２▼）、ターゲット遺伝子にダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）がハイブリダイゼーションした１３０塩基のバンド（▲３▼）が確認された。
【０１４７】
また、図５５に示したライゲーション反応後に９５℃で１０分間の熱処理をした場合の１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、図５４のバンドに加えて、ターゲット遺伝子にハイブリダイゼーションして、ライゲーション反応により連結されたダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）の６８塩基のバンド（▲４▼）が確認された。
【０１４８】
以上のことから、両端に余分な塩基配列を有するダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）におけるライゲーション反応が確認された。
【０１４９】
（実施例１５及び比較例７）
１．目的
ＭＲＳＡ ＤＮＡとダイマー形成用プローブによるライゲーション反応（第１ステップ）、及び架橋プローブによる重合反応とインターカレーター（ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ）による検出（第２ステップ）。
【０１５０】
２．方法
図５６（ａ）に示したように、第１ステップの系としてＭＲＳＡのＤＮＡ（ｍｅｃＡ）と相補的な塩基配列を有する５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３Ｐ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−４）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）を１μＬ、１０4個のＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを５μＬ、Tsc-Ligase用のTsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Ligation bufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液））を１μＬ、Ｈ2Ｏを１６μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を、図５６（ｂ）に示したように、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、９５℃で３０秒間加熱後、４５℃で９０秒間と９５℃で１０秒間のサーマルサイクリングを４５回行い、９５℃で１０分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させた後、４５℃で３０分間反応させてライゲーション溶液とする。対照には、第１ステップの反応液に用いたＭＲＳＡの代わりに、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた（比較例７）。
【０１５１】
次に、図５７（ａ）に示したように、第２ステップの系として５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、Ｈ2Ｏを１３μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を上記したライゲーション溶液に加え、図５７（ｂ）に示したように、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥ社製）を用いた５８℃の各反応時間（０、５、１５及び３０分）における重合反応の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で測定した。
【０１５２】
また、各反応時間における自己集合体の形成を０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１５３】
３．結果
図５８（ｂ）に示した架橋プローブの添加と同時に重合反応が開始され、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認された（図５８（ａ））。
【０１５４】
また、各反応時間における蛍光強度では、ＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用いた系（実施例１５）においてのみ架橋プローブの添加と同時に高い蛍光強度が得られ、時間の経過とともに蛍光は減少した。一方、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた系（比較例７）では、時間の経過による蛍光強度に変化は認められなかった（図５９（ａ）、（ｂ））。
【０１５５】
（実施例１６及び比較例８）
１．目的
ダイマー形成用プローブによるライゲーション反応、及び架橋プローブによる重合反応とインターカレーター（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）によるＭＲＳＡの検出限界試験。
【０１５６】
２．方法
第１ステップの系として、ターゲット遺伝子に１０１cellｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１０３cellｌｓ／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＭＲＳＡから抽出したＤＮＡ（clinical isolate）を１０μＬ、ダイマー形成用プローブのＡ−３、Ａ−３Ｐ、Ａ−４、Ａ−４Ｐを１μＬずつ、Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Ligation bufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１４μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を９５℃で３０秒間加熱後、実施例１５と同様、４５℃で９０秒間と９５℃で１０秒間のサーマルサイクリングを４５回行い、９５℃で１０分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させた後、４５℃で３０分間反応させライゲーション溶液とする。対照には、第１ステップの反応液に用いたＭＲＳＡの代わりに、１０１cellｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１０３cellｌｓ／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた（比較例８）。
【０１５７】
次に、第２ステップの系として５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、Ｈ2Ｏを１３μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を上記したライゲーション溶液に加え、５８℃で３０秒間、重合反応させた時の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で測定した。
【０１５８】
３．結果
図６０に示したようにＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用いた系（実施例１６）において、ＭＲＳＡの菌量に依存した強い蛍光強度を確認した。また、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた系（比較例８）においては、いずれの菌量においても蛍光の増加は認められなかった。
【０１５９】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法により、核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、効率よくターゲット遺伝子の検出を行うことができる。また、本発明の自己集合体の安定化方法、及びその自己集合体の検出方法は、形成される自己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認することが可能である。さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認できるために、今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出することができるという顕著な効果を奏する。
【０１６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の為の改良したＨＣＰプローブ（ダイマー形成用プローブ）によるライゲーション反応を示す模式図であり、（ａ）は切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は連結された一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマー、及び（ｃ）は切断された一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマーをそれぞれ示す。
【図２】 ＨＣＰプローブによるライゲーション反応を示す模式図であり、（ａ）は切断されたＨＣＰ、（ｂ）は連結されたＨＣＰにより形成されたダイマー、（ｃ）は切断されたＨＣＰにより形成されたダイマー、及び（ｄ）は（ｃ）より形成される複合体である。
【図３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１における架橋プローブの例を示す模式図であり、（ａ）は一対の架橋プローブの一例、（ｂ）は一対の架橋プローブの別の例をそれぞれ示す。
【図６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図８】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマー、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｃ）は第３の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマー、及び（ｄ）は第４の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図９】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１０】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１１】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１２】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ及び形成されるダイマー、（ｂ）はフリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図１４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及びフリーサイト領域を有する一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、一対のダイマー形成用プローブをそれぞれ示す。
【図１６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対の架橋プローブの一例、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図１７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は図１５で示したダイマー形成用プローブから形成されるダイマー及び図１６に示した架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１８】 スタッキング効果を利用した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブの一例を示す模式図である。
【図１９】 ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブより形成される自己集合体におけるスタッキング効果による自己集合体の形成の安定化の原理を示す模式図であり、（ａ）はハイブリダイゼーションの安定化、（ｂ）は自己集合体の安定化をそれぞれ示す。
【図２０】 ターゲット遺伝子の検出に用いるプローブの模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子と相補的な領域が切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図２１】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）はターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図２２】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｅ）は連結されたダイマー形成用プローブ、（ｆ）は切断されたダイマー形成用プローブ、（ｇ）は連結されたダイマー形成用プローブと切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、（ｈ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図２３】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｉ）は一対の架橋プローブ、（ｊ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図２４】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）及び（ｃ）はターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｄ）及び（ｅ）はターゲット遺伝子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応をそれぞれ示す。
【図２５】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｆ）及び（ｇ）は連結されたダイマー形成用プローブより形成されるダイマー、（ｈ）は一対の架橋プローブ、（ｉ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図２６】 実施例１を模式的に示す説明図である。
【図２７】 実施例１及び比較例１の結果を示す写真である。
【図２８】 比較例２を模式的に示す説明図である。
【図２９】 比較例２〜４の結果を示す写真である。
【図３０】 実施例２〜５を模式的に示す説明図である。
【図３１】 実施例２〜５及び比較例５の結果を示す写真である。
【図３２】 実施例６を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図３３】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例６の結果を示す写真である。
【図３４】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例６の結果を示す写真である。
【図３５】 実施例７を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図３６】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例７の結果を示す写真である。
【図３７】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例７の結果を示す写真である。
【図３８】 実施例８を模式的に示す説明図である。
【図３９】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例８の結果を示す写真である。
【図４０】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例８の結果を示す写真である。
【図４１】 実施例９を模式的に示す説明図であり、（ａ）は予め一対のダイマー形成用プローブより作製されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）はアガロースゲル電気泳動法写真をそれぞれ示す。
【図４２】 実施例１０を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブ、（ｂ）はアガロースゲル電気泳動法写真をそれぞれ示す。
【図４３】 実施例９及び実施例１０の結果を示すグラフである。
【図４４】 実施例１１を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図４５】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１１の結果を示す写真である。
【図４６】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１１の結果を示す写真である。
【図４７】 実施例１２を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図４８】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１２の結果を示す写真である。
【図４９】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１２の結果を示す写真である。
【図５０】 実施例１３を模式的に示す説明図である。
【図５１】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１３の結果を示す写真である。
【図５２】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１３の結果を示す写真である。
【図５３】 実施例１４を模式的に示す説明図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は切断されたダイマー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、及び（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図５４】 熱処理を行なわない実施例１４の結果を示す写真である。
【図５５】 熱処理後の実施例１４の結果を示す写真である。
【図５６】 実施例１５の第１ステップ（ライゲーション反応）を模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【図５７】 実施例１５の第２ステップ（重合反応）を模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【図５８】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気泳動法写真（ａ）及び自己集合体形成のグラフ（ｂ）である。
【図５９】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気泳動法写真（ａ）及び蛍光強度のグラフ（ｂ）である。
【図６０】 実施例１６及び比較例８の結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイマーを形成する一対のオリゴヌクレオチドの複数対とそのダイマーを架橋する一対のオリゴヌクレオチドの複数対を使用するオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法、該方法により形成された自己集合体、該自己集合体の検出方法、および該自己集合体の作製方法を利用するターゲット遺伝子の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一対のオリゴヌクレオチドが相補的塩基配列に従って正確に結合するハイブリダイゼーション法（Judy,M.,Geoffrey,W.Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports.Analytical Biochemistry,138,267-284,1984）は、サザンブロット法（Southern,E.M.Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol.Biol.,98,503-517,1975）、ノーザンブロット法（Thomas,P.S.Hybridization of denatured RNA and small DNA fragmenta transferred to nitrocellulose. Proc.Natl.Acad. Sci.USA, 77,5201-5205,1980）、in situ hiblydization法（Jones,K.W.,et al. Chromosomal and nuclear location of mouse satellite DNA in individual cells. Nature. 225,912-915,1970）や近年汎用されているＤＮＡチップ法（Marshall,A., Hodgson,J. DNA chips: an array of possibilities. Nat Biotechnol. 16,27-31,1998）などの遺伝子を解析する基本技術として広く応用されている。
【０００３】
また、ターゲット遺伝子の検出感度を上げるために開発された耐熱性ＤＮＡリガーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＬＣＲ法（United States Patent No.5,792,607）や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼという酵素を使って遺伝子を増幅するＰＣＲ法（Saiki,R.,S.Scharf,F.Faloona,et al.Enzymatic amplification ofβ-globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.230,1350-1354(1985)）などの遺伝子増幅法も、基本的にはこのオリゴヌクレオチドが正確にハイブリダイゼーションすることを利用したものである。
【０００４】
しかし、サザンブロット法、ノーザンブロット法、in situ hiblydization法、ＤＮＡチップ法では、遺伝子を増幅することができないために微量の遺伝子を検出することが困難であり、また、ＬＣＲ法やＰＣＲ法では、その増幅操作に加えて検出するための煩雑な操作が必要なため高コストであった。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の問題点に鑑み、本発明者等は、酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（USP6,261,846、日本特許３２６７５７６号及びEP1002877A）。この方法は、３個所の領域から構成される一対のプローブ（HoneyComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、複数の一対のプローブを反応させた場合、お互いにハイブリダイズし、プローブの自己集合によりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる（Probe alternation link self-assembly reaction、以下、このオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法をＰＡＬＳＡＲ法と称する）。
【０００６】
本発明は、このＰＡＬＳＡＲ法に検討を加え、オリゴヌクレオチドの自己集合による自己集合体の作製において、その二本鎖の規則的な高次構造の形成にかかる反応時間を短縮し、至適反応温度域を広くし、その操作性と応用性を高くするために更なる改良を試みたものである。
【０００７】
本発明は、複数対のダイマー形成用プローブで形成した複数のダイマーに対して、複数対の架橋プローブでそのダイマーを架橋することにより、二本鎖の規則的な高次構造の形成にかかる反応時間を短縮し、また、至適反応温度域を広くし、操作性と応用性を高くすることを可能としたオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法、及び得られた自己集合体の性質を利用した簡便な遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らが報告した酵素を使用しない新規な上記等温核酸増幅法は、３個所の領域から構成される一対のプローブを用いる方法であるが、この第１プローブと第２プローブの各々の３個所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有しているため、両者を反応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする様にそれぞれの領域が競い合うようにして反応するため、ＰＡＬＳＡＲ法では、厳密な反応温度と３０分以上の反応時間が必要であった。
【０００９】
また、本発明者らは上記したＰＡＬＳＡＲ法及びライゲーション反応を用いた方法を既に提案した（特願２０００−２６１６８７）。このライゲーション反応を利用した方法では、図２（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマーの中央領域（Ｙ）を特定のターゲット遺伝子と相補的になるように設定しておき、その相補的な領域をあらかじめ切断した場合、図２（ｂ）に示したように切断された部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応により連結されるが、一方では特定のターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーションと同時に、図２（ｃ）に示したようなダイマーの形成により、図２（ｄ）に示したような複合体を形成するために、ターゲット遺伝子とのハイブリダイゼーション効率が低下するという欠点があった。
【００１０】
上記した課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、一対のダイマー形成用プローブで形成したダイマーに対して、一対の架橋プローブでそのダイマーを架橋することにより、ＰＡＬＳＡＲ法における反応時間を短縮し、また、至適反応温度域を広くすることを見出した。加えて、図１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの複数対で形成されるダイマーの中央領域（Ｂ）を特定のターゲット遺伝子と相補的になるように設定しておき、その相補的な領域をあらかじめ切断した場合、図１（ｂ）に示したように切断された部分は特定のターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応により連結され、一方、図１（ｃ）に示したようなダイマーが形成されてもそれ以上反応しないために複合体が形成されず、ターゲット遺伝子との高いハイブリダイゼーション効率が得られることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とする。
【００１２】
上記自己集合体の作製方法において、ｎ＝１の場合、第１の系のダイマープローブと第２の系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ＝1の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１３】
ｎ＝1の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１４】
上記自己集合体の作製方法において、ｎ≧２の場合、第１、第３、・・、第（２ｎ−１）の系のダイマー形成用プローブと第２、第４、・・、第２ｎの系の架橋プローブの相補的な塩基配列の組み合わせは、２通り存在する。ｎ≧２の場合の１例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１５】
ｎ≧２の場合の別の例として、上記プローブの塩基配列を、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列としたものを用いることができる。
【００１６】
上記ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブ（本明細書において、これらを単にプローブと称す場合がある）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
【００１７】
上記プローブのハイブリダイゼーションは、あらかじめ上記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、上記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることが好ましい。
【００１８】
上記複数対のダイマー形成用プローブとして、上記中央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマー形成用プローブからなるものを用いることができる。
【００１９】
上記架橋プローブが、３’側領域と５’側領域の中央部にダイマー形成用プローブと架橋プローブの各領域の塩基配列とは非相補的な領域（以下、フリーサイト領域（Free site regions）と称す）を有することが好適である。
【００２０】
上記フリーサイト領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びオリゴヌクレオチドと結合できるペプチド、ポリマー性粒子、磁性体粒子、またはその他の化合物から構成されるものを用いることができる。
【００２１】
上記一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列とすることも可能である。
【００２２】
上記プローブの相補的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることが可能となる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体（以下、単に自己集合体と称すことがある。）は、上記方法で形成されたものである。
【００２４】
本発明の自己集合体の検出方法の第1の態様は、上記自己集合体を、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することを特徴とする。
【００２５】
本発明の自己集合体の検出方法の第２の態様は、上記自己集合体を、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することを特徴とする。
【００２６】
本発明の自己集合体の検出方法の第３の態様は、上記自己集合体を、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することを特徴とする。
【００２７】
本発明の遺伝子の検出方法は、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いる遺伝子の検出方法であり、上記ダイマー形成用プローブ及び／又は架橋プローブのオリゴヌクレオチドを、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むように構成し、ターゲット遺伝子と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、温度制御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反応及び解離反応をさせ、該切断されたプローブを連結させて完全なプローブを形成させ、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いて自己集合体を作製させ、該自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することを特徴とする。
【００２８】
上記ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとして、上記ダイマー形成用プローブを用いて、ダイマー形成用プローブのオリゴヌクレオチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する領域となるように構成し、ターゲット遺伝子と相補的なダイマー形成用プローブの各オリゴヌクレオチドの中央領域の片側、または両側の一箇所、または複数箇所をあらかじめ切断しておくことが好ましい。
【００２９】
上記遺伝子の検出方法は、さらに具体的には以下の通りである。上記ライゲーション反応において、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有し、その箇所を切断されたプローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたままのプローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたプローブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。温度制御により、上記ハイブリダイゼーション反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連結させて完全なプローブを形成させる。連結したプローブは上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法により、二本鎖の自己集合体を形成する。ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたプローブは連結されず、切断されたプローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成の有無により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。
【００３０】
自己集合体の形成は、ターゲット遺伝子の量に依存しており、形成された自己集合体の量を測定することにより、ターゲット遺伝子の量を測定することが可能である。
【００３１】
上記自己集合体は、第一に、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することができる。
【００３２】
上記自己集合体は、第二に、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することが可能である。
【００３３】
上記自己集合体は、第三に、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することができる。
【００３４】
上記ライゲーション反応を、リガーゼ酵素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオートライゲーションを用いて行うことが好ましい。
【００３５】
上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることができる。
【００３６】
上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることが可能である。
【００３７】
上記あらかじめ切断されたオリゴヌクレオチドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と相補的になるようにデザインされることができる。
【００３８】
上記方法においては、反応温度を制御する機器を使用することが好適である。
【００３９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術の技術思想から逸脱しない限り種種の変形が可能なことはいうまでもない。
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法は、３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧１）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
３’側領域及び５’側領域の２つの領域からなり、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
該架橋プローブを、該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させるようにしたことを特徴とする。
【００４１】
本発明は、複数対のダイマー形成用プローブで形成された複数のダイマーに対して、複数対の架橋プローブを等温で酵素不在の条件下で反応させることによりオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させるものである。使用するプローブの本数は特に限定されない。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐＨも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜９．０の範囲のものが使用できる。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５５〜７０℃である。これら条件は特に限定されない。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ＝１、即ち、一組のダイマー形成用プローブ及び一組の架橋プローブを用いる場合について例示する。一例として、第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、図３（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００４３】
一方、第２の系においては、図３（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−２）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００４４】
次に、図４（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図４（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法におけるｎ＝１の場合の別の例として、図５（ａ）に示した一対の架橋プローブにおける３’側領域、及び５’側領域の２つの領域は、図５（ｂ）に示したように、領域の入れ替えが可能である。
【００４６】
第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、図６（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００４７】
一方、第２の系においては、図６（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がないＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−４）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００４８】
次に、図７（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−３と架橋プローブ−４を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−３の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−４の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−４の３側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−３の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図７（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ≧２、即ち、二組以上のダイマー形成用プローブ及び二組以上の架橋プローブを用いる場合について例示する。一例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにおける複数対のダイマー形成用プローブから形成される複数のダイマーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることが可能である。
【００５０】
図８及び図９は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図である。二組のダイマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用いた場合は、一組のダイマー形成用プローブは、図８（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５１】
もう一組のダイマー形成用プローブは、図８（ｃ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５２】
一方、二組の架橋プローブは、図８（ｂ）、図８（ｄ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−７）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−８）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００５３】
次に、図９（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４から形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−５とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−７、架橋プローブ−８を加えると、
ダイマー形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−７の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−８の３’側領域（Ｌ）、ダイマー形成用プローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマー形成用プローブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プローブ−５の３’側領域（Ｈ）と架橋プローブ−７の３’側領域（Ｈ’）、ダイマー形成用プローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ−８の５’側領域（Ｊ）、ダイマー形成用プローブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域（Ｅ）、
が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図９（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００５４】
図１０は、本発明の自己集合体の作製方法におけるｎ＝４の場合の一例を示す模式図である。図１０（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を有し、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ’）、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ’）、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ）、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ）、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ’）、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ’）、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、
第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ）、
がそれぞれ相補的な塩基配列であるため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１０（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成される。
【００５５】
図１０（ｂ）に示したように、ダイマー形成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プローブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマー形成用プローブの第７の系と第１の系を架橋プローブの第８の系が、それぞれ架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、自己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・・・７，８，１，２，３，４，５，６，７，８，１，２，・・・７，８，１，・・・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ，１，２，・・・２ｋ−１，２ｋ，１，・・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成する。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法におけるｎ≧２の場合の別の例として、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系までの順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにおける複数対のダイマー形成用プローブから形成されるダイマーに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な自己集合体を形成させることが可能である。
【００５７】
図１１は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の別の例を示す模式図である。二組のダイマー形成用プローブと二組の架橋プローブを用いた場合は、一組のダイマー形成用プローブは、図１１（ａ）に示したように、上記したｎ＝２の場合の一例と同様、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５８】
もう一組のダイマー形成用プローブは、図１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマー形成用プローブ−６）から構成されていることから、Ｇ領域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成することができる。ただし、その他の領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。
【００５９】
一方、二組の架橋プローブは、図１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられているが、いずれもの領域においても互いに相補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−９）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ−１０）から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００６０】
次に、図１１（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−３とダイマー形成用プローブ−４から形成されたダイマーと、ダイマー形成用プローブ−５とダイマー形成用プローブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−９、架橋プローブ−１０を加えると、
ダイマー形成用プローブ−３の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１０の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−４の３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−１０の３’側領域（Ｌ）、ダイマー形成用プローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマー形成用プローブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側領域（Ｆ’）、ダイマー形成用プローブ−５の３’側領域（Ｈ）と架橋プローブ−９の３’側領域（Ｈ’）、ダイマー形成用プローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ−９の５’側領域（Ｊ）、ダイマー形成用プローブ−６の３’側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域（Ｅ）、
が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１１（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成されるＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６１】
図１２は、本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の別の例を示す模式図である。図１２（ａ）に示したように、第１の系、第３の系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含有系を有し、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｃ’）、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｅ’）、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ’）、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｊ）、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｌ）、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ）、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｑ’）、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｔ’）、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ’）、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ａ）、
がそれぞれ相補的な塩基配列であるため、一対のダイマー形成用プローブで形成された二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１２（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合してオリゴヌクレオチドによる自己集合体が形成されるＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６２】
図１２（ｂ）に示したように、ダイマー形成用プローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系が、ダイマー形成用プローブの第３の系と第５の系を架橋プローブの第４の系が、ダイマー形成用プローブの第５の系と第７の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマー形成用プローブの第１の系同士を架橋プローブの第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドが、ダイマー形成用プローブの第７の系同士を架橋プローブの第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドが、それぞれ架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、自己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・・・７，８のＮｏ．１（８1），７，６，５，４，３，２，１，８のＮｏ．１（８2），１，２，３，４，５，６，７，８1，７・・・〉の繰り返しとなり、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ1，２ｋ−１，２ｋ−２・・・３，２，１，２ｋ2，１，２，３・・・２ｋ−２，２ｋ−１，２ｋ1，２ｋ−１，２ｋ−２・・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成する。
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法においては、図１３に示すように、架橋プローブにおける２領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋プローブを用いて、上記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法に従い、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。例えば、ｎ＝１の場合、一組のダイマー形成用プローブは、図１３（ａ）に示したように、上記ｎ＝１の第１の系で用いたダイマー形成用プローブと同じダイマー形成用プローブ１とダイマー形成用プローブ２から構成されている。
【００６４】
一方、架橋プローブは、図１３（ｂ）に示したように、上記ｎ＝１の一例の第２の系で用いた架橋プローブの領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋プローブ−１１と架橋プローブ−１２から構成されている。
【００６５】
次に、図１４（ａ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−１１と架橋プローブ−１２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−１２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−１２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１４（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、非相補的な塩基配列とは、お互いにハイブリダイズしない塩基配列であれば、いかなるものでもよく、同一な塩基配列も非相補的な塩基配列に含まれるものである。例えば、図１５に示すように、一対のダイマー形成用プローブの３’側領域及び／又は５’側領域を互いに同一な塩基配列としたダイマー形成用プローブを用いて、上記自己集合体の作製方法に従い、オリゴヌクレオチドによる自己集合体を形成させることができる。ｎ＝１の場合、図１５（ａ）及び（ｂ）に示したように、中央領域をお互いに相補的な配列とし、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、ダイマー形成用プローブ−１及びダイマー形成用プローブ−１１を一対のダイマー形成用プローブとして用いることができる。この場合、一対の架橋プローブは、図１６（ｂ）に示した如く、同一なオリゴヌクレオチドとなる。図１７に示す如く、上記一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、上記架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図１７（ｂ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００６７】
本発明に係る自己集合体の作製方法において、ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させる時期は、ダイマー形成前のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させても良く、あらかじめダイマー形成用プローブによりダイマーを形成させた後に架橋プローブと反応させても良く、特に限定されないが、あらかじめダイマーを形成させた後、架橋プローブと反応させ、自己集合体を形成させる方がより好適である。
【００６８】
上記ダイマー形成用プローブの構成は、各系のダイマー形成用プローブが１種類のものでもよく、１つの系に中央領域の異なる数種類のダイマー形成用プローブを含んでいてもよく、特に限定されない。更にはお互いに完全に相補性のないダイマー形成用プローブ及び架橋プローブのセットを、２組以上同時におこなってもよい。
【００６９】
上記自己集合体の作製方法で用いられるプローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）やLocked Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al. PNAS. 2000.97,5633-5638.）が挙げられる。また、一対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるプローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
【００７０】
上記プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。
【００７１】
上記プローブは公知の方法により合成することができる。たとえばＤＮＡプローブの場合、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイド法により合成することができる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであってもよい。
【００７２】
本発明の自己集合体の作製方法において、使用するプローブの相補的塩基配列領域の端部に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることにより、塩基の積み重ね（stacking of base）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、より安定した二本鎖の自己集合体を形成させることができる。
【００７３】
図１８の矢印に示したように、互い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の各領域の末端部分の塩基配列をＧ（グアニン）とＣ（シトシン）にすることにより、図１９（ａ）に示したように、塩基の積み重ね（stacking of base）によりπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、図１９（ｂ）に示したように安定した２本鎖の自己集合体が形成される。
【００７４】
上記ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い形成される自己集合体は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの２６０ｎｍにおける紫外部の吸収度の強度が減ずる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現する特徴を有する、塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるものである。従って、淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認し、さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認することが可能である。
【００７５】
ＰＡＬＳＡＲ法で使用する一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブの互い違いに交差してハイブリダイゼーションする時の領域はおよそ２０塩基（20 bases）であるが、図１９（ｂ）の円形で示した各領域の末端部分の結合を強固にすることによって、積み重ね効果（stacking effect）が増し、結果的にその末端部分にはさまれている２０塩基の領域のハイブリダイゼーションが安定すると考えられる。
【００７６】
上記の相補領域末端部分に配置されるＣまたはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であっても差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮して適宜選択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる場合、Ｃ、Ｇの順序は特に限定されず自由に組み合わせることができる。また、下記に記載されるターゲット遺伝子の検出法において、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列をプローブの一領域として採用する場合も、相補領域の端部にＣまたはＧを配置するように選択することが可能である。
【００７７】
本発明のオリゴヌクレオチド自己集合体の作製方法を利用して、試料中のターゲット遺伝子の検出が可能である。
【００７８】
本発明の遺伝子の検出方法におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用できる。
【００７９】
以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いた、遺伝子の検出方法を具体的に示す。下記ライゲーション反応は、Ligase（リガーゼ）酵素を使用する方法と酵素を使わず特殊なオリゴヌクレオチドを使用する方法のいずれにも限定されない方法である。
【００８０】
以下に本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法において、ｎ＝１の場合の一例として述べたプローブを用いた場合のターゲット遺伝子の検出方法の一例について述べる。図２０〜図２３は、一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを用いたライゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図である。
【００８１】
本発明のターゲット遺伝子の検出の一例として、ＰＡＬＳＡＲ法で使用するオリゴヌクレオチドは、第１の系においては、図２０（ａ）に示したように、ｎ＝１の場合の第１の系で用いたダイマー形成用プローブと同じダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から構成されているが、中央のＢ領域、Ｂ’領域は相補的な塩基配列であると同時にターゲット遺伝子とも相補的な塩基配列である。そして、このＢ領域の中央部分を切断してできた５’側の部分がダイマー形成用プローブ−７、３’側の部分がダイマー形成用プローブ−８である。同様にして、Ｂ’領域の中央部分を切断してできた３’側の部分がダイマー形成用プローブ−９、５’側の部分がダイマー形成用プローブ−１０である。
【００８２】
一方、架橋プローブは、図２０（ｂ）に示したように、ｎ＝１の場合の一例における第２の系と同じ架橋プローブ−１と架橋プローブ−２から構成されているために、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。
【００８３】
次に、図２１（ａ）に示したターゲット遺伝子のＢ領域、Ｂ’領域に対して、図２１（ｂ）に示したダイマー形成用プローブ−７、ダイマー形成用プローブ−８、ダイマー形成用プローブ−９、ダイマー形成用プローブ−１０がハイブリダイズする。
【００８４】
図２１（ｃ）に示したように、ダイマー形成用プローブ−７とダイマー形成用プローブ−８，ダイマー形成用プローブ−９とダイマー形成用プローブ−１０は、それぞれが隣接してハイブリダイズするために、図２１（ｄ）に示したように、ライゲーション反応によって隣接した部分が連結され、完全な形のダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２が完成する。
【００８５】
解離後、図２２（ｅ）に示した完成したダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２は、図２２（ｆ）に示したように、連結していない未反応なダイマー形成用プローブ−７とダイマー形成用プローブ−８、ダイマー形成用プローブ−９とダイマー形成用プローブ−１０の新しいターゲット遺伝子となるため、図２２（ｇ）のようにハイブリダイズして、図２２（ｈ）に示したように、ライゲーション反応によって隣接した部分が連結され、温度コントロールにより解離とハイブリダイゼーションとライゲーション反応を繰り返すことにより、完全な形のダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２が次々に完成する。
【００８６】
このライゲーション反応でできたダイマー形成用プローブ−１とダイマー形成用プローブ−２から形成されたダイマーに対して、図２３（ｉ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダイマー形成用プローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマー形成用プローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域（Ａ’）、ダイマー形成用プローブ−２の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマー形成用プローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図２３（ｊ）に示したように、オリゴヌクレオチドが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００８７】
ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のダイマー形成用プローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のダイマー形成用プローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断したプローブを用いることも可能である。
【００８８】
次に、ｎ＝１の場合のプローブを用いた本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を利用したターゲット遺伝子の検出方法の別の例について述べる。図２４及び図２５は、それぞれ切断される中央領域が異なる２組の一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブを用いて、切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図である。
【００８９】
図２４（ａ）〜（ｃ）に示すように、ターゲット遺伝子とそれぞれ相補的な領域（α及びα’領域、β及びβ’領域）を有し、その箇所を切断されたダイマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後（図２４（ｄ）（ｅ））、ライゲーション反応によって連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたままのダイマー形成用プローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたダイマー形成用プローブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション反応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。９５℃〜２５℃の範囲の温度コントロールにより、上記ハイブリダイゼーション反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連結させて完全なダイマー形成用プローブを形成させる。
【００９０】
連結したダイマー形成用プローブから形成されたダイマー［図２５（ｆ）（ｇ）］に対して、図２５（ｈ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、一対のダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーションすることにより、図２５（ｉ）に示したように、プローブが自己集合して二本鎖の自己集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。
【００９１】
ターゲット遺伝子が存在しない場合には、切断されたダイマー形成用プローブは連結されず、切断されたダイマー形成用プローブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のプローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のプローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断したプローブを用いることも可能である。
【００９２】
上記方法では、ダイマー形成用プローブの中央領域をターゲット遺伝子と相補的となるように構成したが、５’側領域や３’側領域をターゲット遺伝子と相補的な領域とし、その領域をあらかじめ切断しておき、ターゲット遺伝子を検出することも可能である。また、ダイマー形成用プローブの代わりに、架橋プローブを、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有するように構成し、あらかじめ架橋プローブのターゲット遺伝子と相補的な領域を有する部分を切断し、ライゲーション反応によりターゲット遺伝子を検出することもできる。
【００９３】
上記の方法を応用することにより、１本鎖のターゲット遺伝子や、ＳＮＰｓの検出が可能である。１本鎖のターゲット遺伝子の検出の場合は、ターゲット遺伝子と相補的な領域を一箇所以上切断したプローブを用いること等により検出可能である。ＳＮＰｓの検出の場合は、ＳＮＰｓを含む領域が相補的な領域となるようなプローブを作製し、その箇所を切断したプローブを用いること等により、検出可能である。
【００９４】
ターゲット遺伝子を検出する別の具体的手法としては、たとえば、まず最初に検体試料と少なくとも１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝子と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも一種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次いで、自己集合体を形成する一対のプローブの一方を添加し反応させた後、もう一方のプローブを反応させてターゲット遺伝子・自己集合体複合体を形成させる。次いで、アビジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ該複合体と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体を未反応物質から分離する。最後に、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎＩのようなインターカレーター色素を反応させ、紫外線照射により自己集合体の量を定量することにより、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定する。形成させた自己集合体の分離を容易にするために、磁気ビーズを使用することもできる。
【００９５】
別の手法としては、たとえば、ターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを固相化したウェルを使用することができる。まず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次いで、上記の方法に準じて、自己集合体を形成するプローブを順次添加することにより、自己集合体が形成され結合することになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗浄することにより容易にでき、自己集合体量を測定することによりターゲット遺伝子を測定できる。
【００９６】
この手法に準じれば、ＤＮＡチップへの応用も可能である。
【００９７】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を挙げて説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないことは勿論である。
【００９８】
以下に、実施例１〜実施例１３で使用したダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）：
5’-GTG CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G AAC AGG ATC CTA GAC CTA G ・CA TAG TAC AGT CCG ATG GTG-3’
［２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）：
5’-CCT CAA GAC GCA TGT CTT TC ・C TAG GTC TAG GAT CCT GTT C ・CT AGA ACG GAC TGT ACT TCG-3’
［３］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・C ACC ATC GGA CTG TAC TAT G-3’
［４］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）：
5’-GAA AGA CAT GCG TCT TGA GG ・C GAA GTA CAG TCC GTT CTA G-3’
［５］架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）：
5’-GAA AGA CAT GCG TCT TGA GG ・T CGA CT ・ C GAA GTA CAG TCC GTT CTA G-3’
［６］架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・T CAG CT ・ C ACC ATC GGA CTG TAC TAT G-3’
【００９９】
以下に、実施例１４で使用したターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［７］ターゲット遺伝子：
5’-GGA TCC TAG ACC TAG ・ TG TTT GAG GGT GGA TAG CAG TAC CTG AGC CAT ・ CTA GGT CTA GGA TCC-3’
［８］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）：
5’-G CTG ACT TAA CCG GAT AC ・ ATG GCT CAG GTA CTG C-3’
［９］ダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）：
(P) 5’-TAT CCA CCC TCA AAC A ・G ATT GGT ACT GCG AGA TA-3’
【０１００】
以下に、実施例１５及び１６で使用したダイマー形成用プローブと架橋プローブの塩基配列を記す。
［１０］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３）：
5’-GTG CTG ACT TAA CCG GAT AC ・G ATT ATG GCT CAG GTA CTG C-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１１］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−３Ｐ）：
(P)5’-TAT CCA CCC TCA AAC AGG TG・GATTGGT ACT GCG AGA TAG G-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１２］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４）：
5’-GAC GCT TTC TGC GTG TAT AG ・C ACC TGT TTG AGG GTG GAT A-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１３］ダイマー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）：
(P)5’-G CAG TAC CTG AGC CAT AAT C ・CT AGA ACG GAT CGT ACT TCG-3’
（下線部分は、ＭＲＳＡのｍｅｃＡと相補的な塩基配列）
［１４］架橋プローブ−（Ａ−５）：
5’-GTA TCC GGT TAA GTC AGC AC ・C CTA TCT CGC AGT ACC AAT C-3’
［１５］架橋プローブ−（Ａ−６）：
5’-CTA TAC ACG CAG AAA GCG TC ・C GAA GTA CGA TCC GTT CTA G-3’
【０１０１】
（実施例１及び比較例１）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１０２】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させてダイマー溶液を作製した。
【０１０３】
図２６に示したように、このダイマー溶液に５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。対照として、上記ダイマー溶液に５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）のみを１μＬ加えた場合を同様に行った（比較例１）。
【０１０４】
３．結果
図２７のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）に示したように、ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加えたものにおいてのみ、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認できた（実施例１）。ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーの５’側と３’側（ダイマー形成用プローブ−（Ａ−１））とだけに相補的な領域を持つ架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）だけでは、オリゴヌクレオチドの自己集合反応であるＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体は形成されなかった（比較例１）。
【０１０５】
（比較例２〜４）
１．目的
１本のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１０６】
２．方法
比較例２において、図２８に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、Ｈ2Ｏを７μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１０７】
比較例３において、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順及び条件にて反応させた。比較例４において、架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を添加しない以外は比較例２と同様の手順及び条件にて反応させた。
【０１０８】
３．結果
図２９のアガロースゲル電気泳動の写真に示したように、比較例２〜４のいずれにおいても、自己集合体は検出されず、一本のダイマー形成用プローブに対して、一対の架橋プローブを加えても自己集合反応であるＰＡＬＳＡＲ法によるオリゴヌクレオチドによる自己集合体は形成されなかった。
【０１０９】
（実施例２〜５及び比較例５）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと濃度を変えた一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１１０】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させてダイマー溶液を作製した。
【０１１１】
図３０に示したように、このダイマー溶液に５０ｐｍｏｌ（実施例２）、２５ｐｍｏｌ（実施例３）、５ｐｍｏｌ（実施例４）、０．５ｐｍｏｌ（実施例５）の架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）をそれぞれ１μＬずつ加え、６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。対照として、架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）及び架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を添加しない場合についても同様に行った（比較例５）。
【０１１２】
３．結果
図３１のアガロースゲル電気泳動の写真（矢印の部分）に示したように、ダイマー形成用プローブで形成されたダイマーに対して、５ｐｍｏｌ以上の架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）と架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）の両方を加えたものにおいて、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認できた（実施例２〜４）。
【０１１３】
（実施例６）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応温度の違いによる自己集合体の形成。
【０１１４】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に６４℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図３２（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１１５】
次に、このダイマー溶液に図３２（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１１６】
３．結果
図３３に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図３４に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1002877A等）に比べて、幅広い反応温度で自己集合体を形成できることが確認できた。
【０１１７】
（実施例７）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法の反応時間の違いによる自己集合体の形成。
【０１１８】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマ用ープローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図３５（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１１９】
次に、このダイマー溶液に図３５（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ加え、６４℃で各反応時間（０、１０秒、３０秒、１分、１０分及び３０分）で反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１２０】
３．結果
図３６に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図３７に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、ダイマー形成用プローブと架橋プローブを用いたＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は、一対のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（EP 1002877A等）に比べて、きわめて短時間に自己集合体を形成することが確認できた。
【０１２１】
（実施例８）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを同時に反応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１２２】
２．方法
図３８に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、Ｈ2Ｏを６μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１２３】
３．結果
図３９に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４０に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、予め一対のダイマー形成用プローブでダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた場合と異なり、６４℃以下の反応温度では未完全に自己集合体を形成することができなかった。
【０１２４】
（実施例９及び１０）
１．目的
予め一対のダイマー形成用プローブを作製した後に一対の架橋プローブを反応させた場合（実施例９）と一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させた場合（実施例１０）のインターカレーター（ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ
Ｉ）の蛍光測定による自己集合体の検出。
【０１２５】
２．方法
（実施例９）：予め一対のダイマー形成用プローブを作製した後に一対の架橋プローブを反応させた場合。
【０１２６】
Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Incubation bufferを２μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１５μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４１（ａ）に示したように、ダイマー溶液を作製した。
【０１２７】
次に、このダイマー溶液に図４１（ｂ）に示した５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した［図４１（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４１（ｃ）の写真の○印の温度）について、反応開始から３０秒、５分、１５分、３０分後にそれぞれＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。
【０１２８】
（実施例１０）：一対のダイマー形成用プローブと架橋プローブを同時に反応させた場合
【０１２９】
図４２（ａ）に示したように、Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Incubation bufferを２μＬ、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを２３μＬ（計４０μＬ）の反応溶液を各反応温度（５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した［図４２（ｃ）］。更に、反応温度５６℃の場合（図４２（ｃ）の写真の○印の温度）について、反応開始から、３０秒、５分、１５分、３０分秒にＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で蛍光強度を測定した。
【０１３０】
３．結果
図４３に示したように、予め一対のダイマー形成用プローブでダイマーを形成させた後に架橋プローブを加えた場合（実施例９）は、反応と同時に２本鎖の形成に挿入されたインターカレーターにより強い蛍光強度が認められ、その後は時間の経過とともに減少した。
【０１３１】
また、一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを同時に反応させた場合（実施例１０）は、反応時間による蛍光強度に変化は見られなかった。
【０１３２】
このことから、同時に一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブを反応させた場合、規則的な二本鎖の形成ではなく、凝集に似た状態で反応が進行するものと思われる。
【０１３３】
（実施例１１）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各反応温度におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形成。
【０１３４】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４４（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。
【０１３５】
このダイマー溶液に対して、図４４（ｂ）に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ加え、各反応温度各（５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１３６】
３．結果
図４５に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４６に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブの場合、幅広い反応温度域でＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認された。
【０１３７】
（実施例１２）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを用いた各反応時間におけるＰＡＬＳＡＲによる自己集合体の形成。
【０１３８】
２．方法
２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、Ｈ2Ｏを８μＬ（計２０μＬ）の反応溶液を、９４℃で３０秒加熱後に４８℃で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて図４７（ａ）に示したダイマー溶液を作製した。
【０１３９】
このダイマー溶液に対して、図４７（ｂ）に示した２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ加え、６４℃における各反応時間（０、１０秒、３０秒、１分、１０分及び３０分）後に氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４０】
３．結果
図４８に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図４９に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブの場合、短時間でＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成か確認された。
【０１４１】
（実施例１３）
１．目的
一対のダイマー形成用プローブと２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された一対の架橋プローブを同時に反応させた場合のＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成。
【０１４２】
２．方法
図５０に示したように、２０×ＳＳＣを１０μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−１）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−２）を１μＬ、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＸＢ−ｔｔ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−ＡＺ−ｔｔ）を１μＬ、Ｈ2Ｏを６μＬ（計２０μＬ）を各反応温度（５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８及び７０℃）で３０分反応させ、反応終了後氷上で急冷させて、０．５％と２．０％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４３】
３．結果
図５１に示した０．５％のアガロースゲル電気泳動の写真と図５２に示した２．０％のアガロースゲル電気泳動の写真結果から、２領域の中央にフリーサイト領域が挿入された架橋プローブを一対のダイマー形成用プローブと同時に反応させた場合、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成は阻害された。
【０１４４】
（実施例１４及び比較例６）
１．目的
ターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブによるライゲーション反応の確認。
【０１４５】
２．方法
図５３（ｂ）に示したダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）の１６塩基の領域と相補的な３２塩基の塩基配列を持つ図５３（ａ）に示した１００ｐｍｏｌのターゲット遺伝子を１μＬ、T4 Ligase用の１０×Ligation bufferを２μＬ、T4 Ligaseを１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１４μＬ（計２０μＬ）を３８℃で９０分間、６０分間、３０分間または１５分間反応（図５３（ｃ）（ｄ））させた後、１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。対照として、T4 Ligaseを添加しない場合も同様に行った（比較例６）。
【０１４６】
３．結果
図５４に示した１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、６２塩基のターゲット遺伝子（▲１▼）、未反応な３４塩基のダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）（▲２▼）、ターゲット遺伝子にダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）がハイブリダイゼーションした１３０塩基のバンド（▲３▼）が確認された。
【０１４７】
また、図５５に示したライゲーション反応後に９５℃で１０分間の熱処理をした場合の１２％のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果から、図５４のバンドに加えて、ターゲット遺伝子にハイブリダイゼーションして、ライゲーション反応により連結されたダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）の６８塩基のバンド（▲４▼）が確認された。
【０１４８】
以上のことから、両端に余分な塩基配列を有するダイマー形成用プローブ−（Ｂ−３４）とダイマー形成用プローブ−（Ａ−３４）におけるライゲーション反応が確認された。
【０１４９】
（実施例１５及び比較例７）
１．目的
ＭＲＳＡ ＤＮＡとダイマー形成用プローブによるライゲーション反応（第１ステップ）、及び架橋プローブによる重合反応とインターカレーター（ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ）による検出（第２ステップ）。
【０１５０】
２．方法
図５６（ａ）に示したように、第１ステップの系としてＭＲＳＡのＤＮＡ（ｍｅｃＡ）と相補的な塩基配列を有する５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−３Ｐ）を１μＬ、５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−４）を１μＬと５０ｐｍｏｌのダイマー形成用プローブ−（Ａ−４Ｐ）を１μＬ、１０4個のＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを５μＬ、Tsc-Ligase用のTsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Ligation bufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液））を１μＬ、Ｈ2Ｏを１６μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を、図５６（ｂ）に示したように、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、９５℃で３０秒間加熱後、４５℃で９０秒間と９５℃で１０秒間のサーマルサイクリングを４５回行い、９５℃で１０分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させた後、４５℃で３０分間反応させてライゲーション溶液とする。対照には、第１ステップの反応液に用いたＭＲＳＡの代わりに、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた（比較例７）。
【０１５１】
次に、図５７（ａ）に示したように、第２ステップの系として５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、Ｈ2Ｏを１３μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を上記したライゲーション溶液に加え、図５７（ｂ）に示したように、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（ＰＥ社製）を用いた５８℃の各反応時間（０、５、１５及び３０分）における重合反応の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で測定した。
【０１５２】
また、各反応時間における自己集合体の形成を０．５％のアガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１５３】
３．結果
図５８（ｂ）に示した架橋プローブの添加と同時に重合反応が開始され、ＰＡＬＳＡＲ法による自己集合体の形成が確認された（図５８（ａ））。
【０１５４】
また、各反応時間における蛍光強度では、ＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用いた系（実施例１５）においてのみ架橋プローブの添加と同時に高い蛍光強度が得られ、時間の経過とともに蛍光は減少した。一方、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた系（比較例７）では、時間の経過による蛍光強度に変化は認められなかった（図５９（ａ）、（ｂ））。
【０１５５】
（実施例１６及び比較例８）
１．目的
ダイマー形成用プローブによるライゲーション反応、及び架橋プローブによる重合反応とインターカレーター（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）によるＭＲＳＡの検出限界試験。
【０１５６】
２．方法
第１ステップの系として、ターゲット遺伝子に１０１cellｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１０３cellｌｓ／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＭＲＳＡから抽出したＤＮＡ（clinical isolate）を１０μＬ、ダイマー形成用プローブのＡ−３、Ａ−３Ｐ、Ａ−４、Ａ−４Ｐを１μＬずつ、Tsc Ligase（日本ロシュ）に添付の１０×Ligation bufferを３μＬ、Tsc-Ligase（日本ロシュ社）を１μＬ、ＳＹＢＲTMＧｒｅｅｎ Ｉ（FMC BioProducts，ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液で１００００倍に希釈した溶液）を１μＬ、Ｈ2Ｏを１４μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を９５℃で３０秒間加熱後、実施例１５と同様、４５℃で９０秒間と９５℃で１０秒間のサーマルサイクリングを４５回行い、９５℃で１０分間の熱処理によりTsc-Ligaseを失活させた後、４５℃で３０分間反応させライゲーション溶液とする。対照には、第１ステップの反応液に用いたＭＲＳＡの代わりに、１０１cellｌｓ／ｍＬ、１０２cellｌｓ／ｍＬ、１０３cellｌｓ／ｍＬ、１０４cellｌｓ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた（比較例８）。
【０１５７】
次に、第２ステップの系として５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−５）を１μＬと５０ｐｍｏｌの架橋プローブ−（Ａ−６）を１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、Ｈ2Ｏを１３μＬ（計３０μＬ）の反応溶液を上記したライゲーション溶液に加え、５８℃で３０秒間、重合反応させた時の蛍光強度をＡＲＶＯ−ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社）で測定した。
【０１５８】
３．結果
図６０に示したようにＭＲＳＡから抽出したＤＮＡを用いた系（実施例１６）において、ＭＲＳＡの菌量に依存した強い蛍光強度を確認した。また、Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したＤＮＡを用いた系（比較例８）においては、いずれの菌量においても蛍光の増加は認められなかった。
【０１５９】
【発明の効果】
本発明のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法により、核酸合成酵素や枝分かれしたＤＮＡを用いずに、効率よくターゲット遺伝子の検出を行うことができる。また、本発明の自己集合体の安定化方法、及びその自己集合体の検出方法は、形成される自己集合体の塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとることから、２６０ｎｍにおける紫外部の吸収帯の強度が減じる「ハイポクロミズム」という淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認することが可能である。さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に安価な蛍光物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体の状態を確認できるために、今までになく低コストでしかも簡便に遺伝子を検出することができるという顕著な効果を奏する。
【０１６０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の為の改良したＨＣＰプローブ（ダイマー形成用プローブ）によるライゲーション反応を示す模式図であり、（ａ）は切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は連結された一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマー、及び（ｃ）は切断された一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマーをそれぞれ示す。
【図２】 ＨＣＰプローブによるライゲーション反応を示す模式図であり、（ａ）は切断されたＨＣＰ、（ｂ）は連結されたＨＣＰにより形成されたダイマー、（ｃ）は切断されたＨＣＰにより形成されたダイマー、及び（ｄ）は（ｃ）より形成される複合体である。
【図３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１における架橋プローブの例を示す模式図であり、（ａ）は一対の架橋プローブの一例、（ｂ）は一対の架橋プローブの別の例をそれぞれ示す。
【図６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及び一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図８】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマー、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｃ）は第３の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成されるダイマー、及び（ｄ）は第４の系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。
【図９】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１０】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の一例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１１】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝２の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２及び第４の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１２】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝４の場合の別の例を示す模式図であり、（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー並びに第２、第４、第６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１３】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ及び形成されるダイマー、（ｂ）はフリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図１４】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、フリーサイト領域を有する架橋プローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されるダイマー及びフリーサイト領域を有する一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１５】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、一対のダイマー形成用プローブをそれぞれ示す。
【図１６】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）はｎ＝１における一対の架橋プローブの一例、（ｂ）は３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列（Ｃ領域＝Ｆ’領域、Ａ領域＝Ｄ’領域）とした、一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図１７】 本発明の自己集合体の作製方法のｎ＝１の場合において、３’側領域及び５’側領域をそれぞれ互いに同一な塩基配列としたプローブを用いた例を示す模式図であり、（ａ）は図１５で示したダイマー形成用プローブから形成されるダイマー及び図１６に示した架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図１８】 スタッキング効果を利用した一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブの一例を示す模式図である。
【図１９】 ダイマー形成用プローブ及び架橋プローブより形成される自己集合体におけるスタッキング効果による自己集合体の形成の安定化の原理を示す模式図であり、（ａ）はハイブリダイゼーションの安定化、（ｂ）は自己集合体の安定化をそれぞれ示す。
【図２０】 ターゲット遺伝子の検出に用いるプローブの模式図であり、（ａ）はターゲット遺伝子と相補的な領域が切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図２１】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）はターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図２２】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｅ）は連結されたダイマー形成用プローブ、（ｆ）は切断されたダイマー形成用プローブ、（ｇ）は連結されたダイマー形成用プローブと切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、（ｈ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図２３】 一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｉ）は一対の架橋プローブ、（ｊ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図２４】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）及び（ｃ）はターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一対のダイマー形成用プローブ、（ｄ）及び（ｅ）はターゲット遺伝子と切断されたダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応をそれぞれ示す。
【図２５】 中央領域の異なる２組の一対のダイマー形成用プローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であり、（ｆ）及び（ｇ）は連結されたダイマー形成用プローブより形成されるダイマー、（ｈ）は一対の架橋プローブ、（ｉ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。
【図２６】 実施例１を模式的に示す説明図である。
【図２７】 実施例１及び比較例１の結果を示す写真である。
【図２８】 比較例２を模式的に示す説明図である。
【図２９】 比較例２〜４の結果を示す写真である。
【図３０】 実施例２〜５を模式的に示す説明図である。
【図３１】 実施例２〜５及び比較例５の結果を示す写真である。
【図３２】 実施例６を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図３３】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例６の結果を示す写真である。
【図３４】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例６の結果を示す写真である。
【図３５】 実施例７を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図３６】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例７の結果を示す写真である。
【図３７】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例７の結果を示す写真である。
【図３８】 実施例８を模式的に示す説明図である。
【図３９】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例８の結果を示す写真である。
【図４０】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例８の結果を示す写真である。
【図４１】 実施例９を模式的に示す説明図であり、（ａ）は予め一対のダイマー形成用プローブより作製されたダイマー、（ｂ）は一対の架橋プローブ、（ｃ）はアガロースゲル電気泳動法写真をそれぞれ示す。
【図４２】 実施例１０を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブ及び一対の架橋プローブ、（ｂ）はアガロースゲル電気泳動法写真をそれぞれ示す。
【図４３】 実施例９及び実施例１０の結果を示すグラフである。
【図４４】 実施例１１を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図４５】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１１の結果を示す写真である。
【図４６】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１１の結果を示す写真である。
【図４７】 実施例１２を模式的に示す説明図であり、（ａ）は一対のダイマー形成用プローブより形成されたダイマー、（ｂ）フリーサイト領域を有する一対の架橋プローブをそれぞれ示す。
【図４８】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１２の結果を示す写真である。
【図４９】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１２の結果を示す写真である。
【図５０】 実施例１３を模式的に示す説明図である。
【図５１】 ０．５％アガロースゲルを用いた実施例１３の結果を示す写真である。
【図５２】 ２．０％アガロースゲルを用いた実施例１３の結果を示す写真である。
【図５３】 実施例１４を模式的に示す説明図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は切断されたダイマー形成用プローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子とダイマー形成用プローブのハイブリダイゼーション反応、及び（ｄ）は切断されたダイマー形成用プローブのライゲーション反応をそれぞれ示す。
【図５４】 熱処理を行なわない実施例１４の結果を示す写真である。
【図５５】 熱処理後の実施例１４の結果を示す写真である。
【図５６】 実施例１５の第１ステップ（ライゲーション反応）を模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【図５７】 実施例１５の第２ステップ（重合反応）を模式的に示す説明図（ａ）及びグラフ（ｂ）である。
【図５８】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気泳動法写真（ａ）及び自己集合体形成のグラフ（ｂ）である。
【図５９】 実施例１５及び比較例７の結果を示す電気泳動法写真（ａ）及び蛍光強度のグラフ（ｂ）である。
【図６０】 実施例１６及び比較例８の結果を示すグラフである。
Claims (30)
- Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３'側領域、中央領域、及び５'側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３'側領域及び５'側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１の系のダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３'側領域及び５'側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３'側領域及び５'側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブを含む第２の系の架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブを含む第１の系のダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブを含む第２の系の架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系及び第３の系の２個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系及び第４の系の２個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域、
をそれぞれ相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系、第３の系及び第５の系の３個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系、第４の系、及び第６の系の３個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌ クレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第６のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系、第３の系、第５の系及び第７の系の４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系、第４の系、第６の系、第８の系の４個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧３）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩 基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系及び第３の系の２個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系及び第４の系の２個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系、第３の系及び第５の系の３個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系、第４の系及び第６の系の３個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系、第３の系、第５の系及び第７の系の４個の系を形成するダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２の系、第４の系、第６の系及び第８の系の４個の系を形成する架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第５の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第６の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第７の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌ クレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域、中央領域、及び５ ' 側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列とし、３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対のダイマー形成用プローブをそれぞれ含む第１の系から第（２ｎ−１）番目（ｎ≧３）の系まで順番にｎ個形成されたダイマー形成用プローブ含有系と、
Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３ ' 側領域及び５ ' 側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域及び５ ' 側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番にｎ個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域と第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５ ' 側領域を相補的な塩基配列とし、
以下同様に順次作成し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
ダイマー形成用プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３'側領域を相補的な塩基配列とし、
架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５'側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５'側領域を相補的な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の規則的な高次構造を形成させることを特徴とするオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。 - 前記プローブのハイブリダイゼーションが、あらかじめ前記ダイマー形成用プローブからダイマーを形成させた後、前記架橋プローブと該ダイマーをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記複数対のダイマー形成用プローブが、前記中央領域の異なる複数種のダイマー形成用プローブからなることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記架橋プローブが、３'側領域と５'側領域の中央部にダイマー形成用プローブと架橋プローブの各領域の塩基配列とは非相補的なフリーサイト領域を有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記フリーサイト領域が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びオリゴヌクレオチドと結合できるペプチド、ポリマー性粒子、磁性体粒子、またはその他の化合物であることを特徴とする請求項１３記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記一対のダイマー形成用プローブの３'側領域及び／又は５'側領域を互いに同一な塩基配列とすることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 前記プローブの相補的塩基配列領域の分岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成させることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法で形成された自己集合体。
- 請求項１８記載の自己集合体をオリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することを特徴とする自己集合体の検出方法。
- 請求項１８記載の自己集合体を、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することを特徴とする自己集合体の検出方法。
- 請求項１８記載の自己集合体を、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することを特徴とする自己集合体の検出方法。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いる遺伝子の検出方法であり、前記ダイマー形成用プローブ及び／又は架橋プローブのオリゴヌクレオチドを、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むように構成し、ターゲット遺伝子と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、温度制御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反応及び解離反応をさせ、該切断されたプローブを連結させて完全なプローブを形成させ、前記オリゴヌクレオチドによる自己集合体の作製方法を用いて自己集合体を作製させ、該自己集合体を検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
- 前記ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、前記ダイマー形成用プローブであり、該ダイマー形成用プローブのオリゴヌクレオチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する領域となるように構成し、ターゲット遺伝子と相補的なダイマー形成用プローブの各オリゴヌクレオチドの中央領域の片側、または両側の一箇所、または複数箇所をあらかじめ切断しておくことを特徴とする請求項２２記載の遺伝子の検出方法。
- 前記ライゲーション反応をリガーゼ酵素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオートライゲーションを用いて行うことを特徴とする請求項２２又は２３記載の遺伝子の検出方法。
- 前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
- 前記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項２２〜２４のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
- 前記あらかじめ切断されたオリゴヌクレオチドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と相補的になるようにデザインされることを特徴とする請求項２２〜２６のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
- 前記自己集合体を、オリゴヌクレオチドの二本鎖に挿入して蛍光を発するインターカレーターを用いて検出することを特徴とする請求項２２〜２７のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
- 前記自己集合体を、該自己集合体に蛍光物質を結合させ、発光により検出することを特徴とする請求項２２〜２７のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
- 前記自己集合体を、紫外線に対する光学的な吸収の変化を利用して検出することを特徴とする請求項２２〜２７のいずれか１項記載の遺伝子の検出方法。
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