JP2003164299A - オリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法及び遺伝子の定量分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】煩雑な操作を用いずに簡便にオリゴヌクレオチ
ドの自己集合により形成された自己集合体を確認する方
法、及びその方法を利用してＢ／Ｆ分離なしに簡便に標
的遺伝子の検出及び定量分析を行う方法を提供する。 【解決手段】オリゴヌクレオチドの自己集合反応により
形成された自己集合体を、自己集合体の融解曲線を解析
することにより検出する。更に該自己集合体を形成する
自己集合反応を利用して、プローブを、ターゲット遺伝
子の一部と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを含むように構成し、該プローブのターゲット遺伝子
と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、
温度制御により、ハイブリダイゼーション反応、ライゲ
ーション反応及び解離反応をさせ、該切断されたプロー
ブを連結させて完全なプローブを形成させ、自己集合体
を形成させて、該自己集合体の融解曲線を解析すること
により、ターゲット遺伝子の量を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ドの自己集合により形成された自己集合体の融解曲線解
析による検出方法及び遺伝子の定量分析方法に関する。

【０００２】

【関連技術】現在市販されている遺伝子診断キットにお
ける遺伝子の検出法では、遺伝子増幅法であるＰＣＲ法
（ＵＳＰ４，６８３，１９５、ＵＳＰ４，６８３，２０
２）やＬＣＲ法（ＵＳＰ５，７９２，６０７）は、遺伝
子の増幅産物をＥＩＡ（エンザイム・イムノ・アッセ
イ）による発色・発光を使用し、また、シグナル増幅法
であるブランチ（分岐）ＤＮＡアッセイやＲＣＡ（ロー
リング・サイクル・アンプリフィケーション）も同様に
ＥＩＡを使用して標的遺伝子を検出していた。

【０００３】しかし、ＥＩＡを用いた測定では、特殊な
機械と試薬が必要であり、操作も煩雑で判定するまでに
１時間以上の時間を要していた。

【０００４】一方、本出願人は、酵素を使用しない新規
な等温核酸増幅法（プローブ自己集合体の形成方法）を
既に提案した（ＵＳＰ６，２６１，８４６、特開２００
０−２０１６８７号及びＥＰ１，００２，８７７Ａ）。
この方法は、３個所の領域から構成される一対のプロー
ブ（HoneyComb Probe、以下ＨＣＰと称する）を用いる
方法であり、第１プローブと第２プローブの各々の３個
所の領域はお互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反
応させた場合、領域の１個所のみとハイブリダイズする
様に各領域の塩基配列を工夫したものである。この工夫
により、複数の一対のプローブを反応させた場合、お互
いにハイブリダイズしプローブの自己集合体を形成させ
ることができる（Probe alternation link self-assemb
ly reaction、以下、ＰＡＬＳＡＲ法と称する）。

【０００５】さらに本出願人は、上記ＰＡＬＳＡＲ法を
利用した新規な遺伝子の検出方法を提案した（特願２０
００−２６１６８７号）。この検出方法においては、切
断されたＨＣＰが自己集合体を形成しないことに着眼
し、標的遺伝子の存在とリガーゼ酵素によって連結され
るＨＣＰと、その連結されたＨＣＰのＰＡＬＳＡＲ法に
よる自己集合体の形成状態をアガロースゲル電気泳動、
およびインターカレーターの挿入による蛍光測定で確認
していた。

【０００６】しかし、アガロースゲル電気泳動やインタ
ーカレーターの挿入による蛍光測定では、特殊な機械が
必要であり、操作も煩雑で判定するまでに３０分以上の
時間を要していた。

【０００７】さらに、上記検出方法では、標的遺伝子の
存在はできたが、その定量分析までは至っていなかっ
た。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に
鑑みてなされたもので、アガロースゲル電気泳動のよう
な煩雑な操作を用いずに簡便にオリゴヌクレオチドの自
己集合により形成された自己集合体を確認する方法、及
びその方法を利用してＢ／Ｆ分離なしに簡便に標的遺伝
子の検出及び定量分析を行う方法を提供することを目的
とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記問題を解決するた
め、本発明者らは、この自己集合体を簡便に検出及び定
量できることを目的に鋭意研究を重ねてきた。その結
果、驚くべきことに、この自己集合体が、融解曲線分析
において、自己集合する前のオリゴヌクレオチドとはま
ったく異なる融解曲線及びＴｍ値を示し、更には、形成
された自己集合体の量に対応して融解曲線が変化してい
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】本発明のオリゴヌクレオチド自己集合体の
検出方法は、オリゴヌクレオチドの自己集合反応により
形成された自己集合体を、該自己集合体の融解曲線を解
析することにより、検出することを特徴とする。

【００１１】上記自己集合体の第１の態様は、お互いに
相補的な塩基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成
される一対のプローブの複数対を用いて、互い違いに交
差するようにハイブリダイゼーションさせることによ
り、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集
合体を形成させる自己集合体の形成方法を用いて形成さ
れた自己集合体である。

【００１２】上記一対のプローブ（以下、ＨＣＰと称す
る場合がある）の構成は、１対１でハイブリダイゼーシ
ョンする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所の相補的な部分の中
で、１カ所ずつが特異的にハイブリダイゼーションする
ように構成される。

【００１３】上記一対のプローブの複数対は、該塩基配
列領域が少なくとも１カ所異なるｍ（ｍ≧２）種の一対
のプローブの複数対を用いることができる。

【００１４】上記自己集合体の第２の態様は、Ｎｏ．１
及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌ
クレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の
３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を
互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成
するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相
補的な塩基配列とした複数のダイマープローブを含む第
１の系と、Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレ
オチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側
領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’
側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とし
た複数対の架橋プローブを含む第２の系とを有し、第１
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領
域、第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側
領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’
側領域、第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの
５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列とし、第１
の系のダイマープローブに対して、第２の系の架橋プロ
ーブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の
自己集合体を形成させる自己集合体の形成方法を用いて
形成された自己集合体である。

【００１５】上記自己集合体の第３の態様は、Ｎｏ．１
及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌ
クレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の
３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を
互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成
するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相
補的な塩基配列とした複数のダイマープローブを含む第
１の系と、Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレ
オチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側
領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’
側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とし
た複数対の架橋プローブを含む第２の系とを有し、第１
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第
２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領
域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側
領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’
側領域、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチド
の５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列とし、第１
の系のダイマープローブに対して、第２の系の架橋プロ
ーブが架橋するようにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の
自己集合体を形成させる自己集合体の形成方法を用いて
形成された自己集合体である。

【００１６】上記自己集合体の第４の態様は、Ｎｏ．１
及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴ
ヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の
３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を
互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成
するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相
補的な塩基配列としたそれぞれ複数のダイマープローブ
をそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目
（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成された
ダイマープローブ含有系と、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各
一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを
３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非
相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞ
れ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで順番に複数
個形成された架橋プローブ含有系とを有し、第（２ｎ−
３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側
領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−
２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側
領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−
２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側
領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域、ダイマープローブの最後の系の
Ｎｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プロ
ーブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域、ダイマープローブの最後の系のＮｏ．２−オリ
ゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系
のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プ
ローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チドの３’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．１
−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ
相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第（２ｎ−
１）番目の系までにおける複数のダイマープローブに対
して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複
数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼー
ションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集
合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合体の形
成方法を用いて形成された自己集合体である。

【００１７】上記自己集合体の第５の態様は、Ｎｏ．１
及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴ
ヌクレオチドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の
３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を
互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成
するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相
補的な塩基配列としたそれぞれ複数のダイマープローブ
をそれぞれ含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目
（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数個形成された
ダイマープローブ含有系と、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各
一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを
３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非
相補的な塩基配列とした複数対の架橋プローブをそれぞ
れ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系までの順番に複
数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、第（２ｎ
−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌ
クレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第（２ｎ−
２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側
領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−
２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側
領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域、ダイマープローブの最後の系の
Ｎｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と架橋プロ
ーブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’
側領域、ダイマープローブの最後の系のＮｏ．２−オリ
ゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系
のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、架橋プ
ローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チドの３’側領域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２
−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、をそれぞれ
相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第（２ｎ−
１）番目の系までにおける複数のダイマープローブに対
して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までにおける複
数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリダイゼー
ションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集
合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合体の形
成方法を用いて形成された自己集合体である。

【００１８】上記複数のダイマープローブは、上記中央
領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマープローブを用い
ることができる。

【００１９】上記架橋プローブは、３’側領域と５’側
領域の中央部にダイマープローブと架橋プローブの各領
域の塩基配列とは非相補的な領域（以下、フリーサイト
領域（Free site regions）と称す）を有する構成とす
ることが好ましい。

【００２０】上記フリーサイト領域は、ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，ＰＮＡ，ＬＮＡ，及びオリゴヌクレオチドと結合で
きるペプチド、自己集合体性粒子、磁性体粒子、または
その他の化合物から構成される。

【００２１】上記自己集合体の第６の態様は、Ｎｏ．１
及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌ
クレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の
３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を
互いに相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側
領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー
プローブを含む系を第１の系及び第２の系まで形成し、
第１の系の各オリゴヌクレオチドの３’側領域が、第２
の系の各オリゴヌクレオチドの３’側領域のいずれか一
方とそれぞれ相補的な塩基配列であり、且つ、第１の系
の各オリゴヌクレオチドの５’側領域が、第２の系の各
オリゴヌクレオチドの５’側領域のいずれか一方とそれ
ぞれ相補的な塩基配列であるようにし、第１の系及び第
２の系までの複数対のダイマープローブをハイブリダイ
ゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自
己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合体
の形成方法を用いて形成された自己集合体である。

【００２２】上記自己集合体の検出方法は、第一に、上
記自己集合体を、核酸と結合する性質を有する蛍光物質
を添加させ、蛍光を用いて自己集合体の融解曲線を解析
することにより、自己集合体を検出することを特徴とす
る。

【００２３】上記自己集合体の検出方法は、第二に、上
記自己集合体を、自己集合体の紫外線に対する光化学的
な吸収の変化を利用して、自己集合体の融解曲線を解析
することにより、自己集合体を検出することを特徴とす
る。

【００２４】上記ＨＣＰ、ダイマープローブ及び架橋プ
ローブのような自己集合体形成反応に用いられるオリゴ
ヌクレオチド・プローブ（以下、単にプローブと称す場
合がある）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡの
いずれかから選ばれる塩基から構成される。

【００２５】上記プローブの相補的塩基配列領域の分岐
点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シト
シン）を配置させ、プローブがハイブリダイズした際に
少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端
部に形成させることにより、安定した二本鎖の自己集合
体を形成させることが可能となる。

【００２６】本発明の遺伝子の定量分析方法は、自己集
合体を形成するプローブを、ターゲット遺伝子の一部と
相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むよ
うに構成し、該プローブのターゲット遺伝子と相補的な
領域を少なくとも１箇所予め切断しておき、温度制御に
より、ハイブリダイゼーション反応、ライゲーション反
応及び解離反応をさせ、該切断されたプローブを連結さ
せて完全なプローブを形成させ、自己集合体を形成さ
せ、該自己集合体の融解曲線を解析することにより、タ
ーゲット遺伝子の量を測定することを特徴とする。

【００２７】上記ターゲット遺伝子の定量分析方法は、
第一に、上記プローブとしてＨＣＰの複数対を用い、該
ＨＣＰのうち、いずれか一方のプローブの一つ以上の相
補的な領域を、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基
配列を有する領域となるように構成し、該ＨＣＰのター
ゲット遺伝子に相補的な領域の片側、または両側の一箇
所、または複数箇所をあらかじめ切断しておくことを特
徴とする。

【００２８】上記一対のＨＣＰの複数対の構成は、１種
のＨＣＰの複数対でもよく、１箇所以上領域の異なる数
種類のＨＣＰの複数対でもよく、更に、完全に異なる２
組以上の一対のＨＣＰの複数対でもよく、特に限定され
ない。

【００２９】上記遺伝子の定量分析方法は、第二に、上
記プローブとしてダイマープローブのみ又はダイマープ
ローブ及び架橋プローブを用いることを特徴とする。こ
の際、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドとして、上記ダイマープローブ
及び／又は架橋プローブを用いる。

【００３０】ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドとして、上記ダイマープ
ローブを用いて、ダイマープローブのオリゴヌクレオチ
ドのうち、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの中央
領域を、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有する
領域となるように構成し、ターゲット遺伝子と相補的な
ダイマープローブの各オリゴヌクレオチドの中央領域の
片側、または両側の一箇所、または複数箇所をあらかじ
め切断しておくことが好ましい。

【００３１】上記複数のダイマープローブの構成は、各
系のダイマープローブが１種類のものでもよく、１つの
系に中央領域の異なる数種類のダイマープローブを含ん
でいてもよく、特に限定されない。更にはお互いに完全
に相補性のないダイマープローブ及び架橋プローブのセ
ットを、２組以上同時におこなってもよい。

【００３２】また、上記第一、第２の方法を組み合わせ
て遺伝子の定量分析を行うこともできる。

【００３３】上記遺伝子の定量分析方法は、さらに具体
的には以下の通りである。上記ライゲーション反応にお
いて、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有し、その箇
所を切断されたプローブは、ターゲット遺伝子が存在す
る場合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションし
た後、ライゲーション反応によって連結され、その後、
熱により二本鎖を解離させる。次に、未だ切断されたま
まのプローブは、ターゲット遺伝子又は連結されたプロ
ーブとハイブリダイゼーションした後、ライゲーション
反応によって連結され、熱により二本鎖が解離される。
温度制御により、上記ハイブリダイゼーション反応→ラ
イゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連
結させて完全なプローブを形成させる。連結したプロー
ブは上記自己集合体の形成方法により、二本鎖の自己集
合体を形成する。ターゲット遺伝子が存在しない場合に
は、切断されたプローブは連結されず、切断されたプロ
ーブでは自己集合体は形成されない。故に、自己集合体
の形成により、ターゲット遺伝子を検出することが可能
である。

【００３４】自己集合体の形成は、ターゲット遺伝子の
量に依存しており、自己集合体は、自己集合体の量に応
じた融解曲線を示すため、形成された自己集合体の融解
曲線を解析することにより、ターゲット遺伝子の量を測
定することが可能である。

【００３５】上記ライゲーション反応をＤＮＡリガーゼ
酵素、耐熱性のＤＮＡリガーゼ酵素、又は酵素を使用し
ないオートライゲーションを用いて行うことが好まし
い。

【００３６】上記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮＡ及
び／またはＲＮＡを用いることができる。

【００３７】上記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮＡ及
び／またはＲＮＡを用いることができる。

【００３８】上記あらかじめ切断されたプローブの部分
が一塩基多形（single nucleotidepolymorphisms：以下
ＳＮＰｓと称す）と相補的になるようにデザインされる
ことが好ましい。

【００３９】上記方法においては、反応温度を制御する
機器を使用することが好適である。

【００４０】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を添付
図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示
的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない
限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。

【００４１】本発明は、お互いに相補的な部分をｎカ所
（ｎ≧３）有する一対のプローブであるＨＣＰや、ダイ
マーを形成する複数のダイマープローブ及びダイマープ
ローブに架橋する複数対の架橋プローブのような自己集
合体を形成する複数のプローブを使用し、両者を等温で
酵素不在の条件下で反応させることにより二本鎖の自己
集合体を形成させ、形成された自己集合体の融解曲線を
解析することにより、形成された自己集合体を検出する
ものである。

【００４２】使用するプローブの本数は、特に限定され
ない。反応緩衝液の組成、濃度は特に限定されず、核酸
増幅に常用される通常の緩衝液が好適に使用できる。ｐ
Ｈも常用の範囲で好適であり、好ましくはｐＨ７．０〜
ｐＨ９．０の範囲のものが使用できる。これら条件は特
に限定されない。

【００４３】以下に本発明において用いた自己集合体の
形成方法を具体的に述べる。

【００４４】本発明において用いた自己集合体の形成方
法の第１の態様は、お互いに相補的な塩基配列領域がｎ
（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のプローブ（Ｈ
ＣＰ）の複数対を用いて、互い違いに交差するようにハ
イブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレ
オチドが自己集合し、二本鎖の巨視的な自己集合体を形
成させることを特徴とする。上記一対のプローブの構成
は、１対１でハイブリダイゼーションする時に必ずｎ
（ｎ≧３）カ所の相補的な部分の中で、１カ所ずつが特
異的にハイブリダイゼーションするように構成されるも
のである。

【００４５】ＨＣＰをさらに具体的な例でいえば、一本
のプローブの中でお互いに相補的な部分の長さ（塩基の
数）は、同一であっても異なってもよく特に限定されな
い。

【００４６】図１は、相補的な領域が３箇所からなる一
対のＨＣＰ（Ｎｏ．１プローブ及びＮｏ．２プローブ）
より形成された自己集合体の検出方法の一例を示す。同
図において、Ｎｏ．１プローブは、Ｘ₁領域、Ｘ₂領域及
びＸ₃領域を有し、Ｎｏ．２プローブは、Ｘ’₁領域、
Ｘ’₂領域及びＸ’₃領域を有している［図１（ａ）］。
このＮｏ．１プローブとＮｏ．２プローブは、両者をハ
イブリダイゼーションさせたとき、Ｘ₁領域はＸ’₁領域
とだけ結合し、Ｘ₂領域はＸ’₂領域とだけ結合し、Ｘ₃
領域はＸ’₃領域とだけ結合するような構成とされてお
り、３つの結合パターンで一対のプローブが互い違いに
ハイブリダイゼーションする。［図１（ｂ）］。

【００４７】３つの結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図１
（ｃ）に模式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法
の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、
二本鎖の自己集合体を形成させることができる。

【００４８】図２はお互いに相補的な部分が４カ所の数
から構成される一対のＨＣＰの一例を示す模式図であ
る。同図において、Ｎｏ．３プローブは、Ｘ₁領域、Ｘ₂
領域、Ｘ₃領域及びＸ₄領域を有し、Ｎｏ．４プローブ
は、Ｘ’₁領域、Ｘ’₂領域、Ｘ’ ₃領域及びＸ’₄領域を
有している。このＮｏ．３プローブとＮｏ．４プローブ
は、両者をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ₁領
域はＸ’₁領域とだけ結合し、Ｘ₂領域はＸ’₂領域とだ
け結合し、Ｘ₃領域はＸ’₃領域とだけ結合し、Ｘ₄領域
はＸ’₄領域とだけ結合するような構成とされており、
４つの結合パターンで一対のプローブが互い違いにハイ
ブリダイゼーションする。

【００４９】４つの結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、図３に模
式的な一例を示したように、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従
い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の自
己集合体を形成させることができる。

【００５０】図１〜図３に示したように、一対のＨＣＰ
の相補的な部分が３ヵ所及び４ヵ所の数から構成される
一対のプローブをハイブリダイゼーションさせる方法を
もってすれば、理論的にはそれ以上の相補的塩基配列領
域を増すことが可能である。

【００５１】図４はお互いに相補的な部分がｎカ所（ｎ
≧３）の数から構成される一対のＨＣＰのさらに別の例
を示す模式図である。同図において、Ｎｏ．５プローブ
は、Ｘ₁領域、Ｘ₂領域、Ｘ₃領域……Ｘ_n-1領域、Ｘ_n領
域を有し、Ｎｏ．６プローブは、Ｘ’₁領域、Ｘ’₂領
域、Ｘ’₃領域……Ｘ’_n-1領域、Ｘ’_n領域を有してい
る。このＮｏ．５プローブとＮｏ．６プローブは、両者
をハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ₁領域はＸ’₁
領域とだけ結合し、Ｘ₂領域はＸ’₂領域とだけ結合し、
Ｘ₃領域はＸ’₃領域とだけ結合し、Ｘ_n-1領域はＸ’_n-1
とだけ結合し、Ｘ _n領域はＸ’_n領域とだけ結合するよう
な構成とされており、ｎ個の結合パターンで一対のプロ
ーブが互い違いにハイブリダイゼーションする。

【００５２】ｎ個の結合パターンで互い違いにハイブリ
ダイゼーションした一対のＨＣＰの複数対は、ＰＡＬＳ
ＡＲ法の原理に従い、オリゴヌクレオチドの自己集合に
より、二本鎖の自己集合体を形成させることができる。

【００５３】上記自己集合体の形成方法において、異な
る相補的領域を有する２種以上のＨＣＰを用いることも
できる。図５は、相補的な領域が３箇所からなる２種の
一対のＨＣＰ（Ｎｏ．７及びＮｏ．８プローブ、Ｎｏ．
９及びＮｏ．１０プローブ）より形成された自己集合体
の検出方法の一例を示す。同図において、Ｎｏ．７プロ
ーブは、Ｘ領域、α領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．８プ
ローブは、Ｘ’領域、α’領域及びＺ’領域を有してい
る（図５（ａ））。また、Ｎｏ．９プローブは、Ｘ領
域、β領域及びＺ領域を有し、Ｎｏ．１０プローブは、
Ｘ’領域、β’領域及びＺ’領域を有している（図５
（ｂ））。図５に示すように、２組のＨＣＰは、相補領
域が１箇所異なるＨＣＰである。各プローブは、両者を
ハイブリダイゼーションさせたとき、Ｘ領域はＸ’領域
とだけ結合し、Ｚ領域はＸ’領域とだけ結合し、α領域
はα’領域とだけ結合し、β領域はβ’領域とだけ結合
するような構成とされている。２組のＨＣＰはそれぞ
れ、α領域とα’領域もしくはβ領域とβ’領域がハイ
ブリダイズし、ダイマーを形成することができ、これら
ダイマー［図５（ｃ）］よりＰＡＬＳＡ法の原理に従
い、オリゴヌクレオチドの自己集合により、二本鎖の自
己集合体を形成させることができる（図５（ｄ））。

【００５４】本発明において用いた自己集合体の形成方
法の第２の態様としては、第１の系の一対のオリゴヌク
レオチドは、図６（ａ）に示したように、一対のオリゴ
ヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域
の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけが
互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされてい
るＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−
１）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマープロー
ブ−２）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領
域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを
形成することができる。ただし、その他の領域について
は、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないた
め、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００５５】一方、第２の系の一対のオリゴヌクレオチ
ドは、図６（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレ
オチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分
けられているが、いずれもの領域においても互いに相補
性がないＮｏ．３−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ
−１）とＮｏ．４−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ
−２）から構成されているために、ハイブリダイゼーシ
ョンにより結合することなく２本のオリゴヌクレオチド
のままである。

【００５６】次に、図７（ａ）に示したように、ダイマ
ープローブ−１とダイマープローブ−２から形成された
ダイマーに対して、架橋プローブ−１と架橋プローブ−
２を加えると、ダイマープローブ−１の３’側領域
（Ｃ）と架橋プローブ−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイ
マープローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−
１の５’側領域（Ａ’）、ダイマープローブ−２の３’
側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−２の３’側領域
（Ｆ）、ダイマープローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と
架橋プローブ−２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であ
るために、一対のダイマープローブで形成されたダイマ
ーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイ
ブリダイゼーションすることにより、図７（ｂ）に示し
たように、プローブが自己集合して自己集合体を形成す
るＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００５７】本発明の自己集合体の形成方法の第３の態
様としては、ダイマープローブと架橋プローブについ
て、図８（ａ）に示した一対の架橋プローブにおける
３’側領域、及び５’側領域の２つの領域は、図８
（ｂ）に示したように、領域の入れ替えが可能である。

【００５８】第１の系の一対のオリゴヌクレオチドは、
図９（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチド
の３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域
に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的
な塩基配列を持つようにデザインされているＮｏ．１−
オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−１）とＮｏ．
２−オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−２）から
構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領域だけがハイ
ブリダイゼーションするためにダイマーを形成すること
ができる。ただし、その他の領域については、そのオリ
ゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反応はダイ
マーの形成だけで終了する。

【００５９】一方、第２の系の一対のオリゴヌクレオチ
ドは、図９（ｂ）に示したように、一対のオリゴヌクレ
オチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分
けられているが、いずれもの領域においても互いに相補
性がないＮｏ．３−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ
−３）とＮｏ．４−オリゴヌクレオチド（架橋プローブ
−４）から構成されているために、ハイブリダイゼーシ
ョンにより結合することなく２本のオリゴヌクレオチド
のままである。

【００６０】次に、図１０（ａ）に示したように、ダイ
マープローブ−１とダイマープローブ−２から形成され
たダイマーに対して、架橋プローブ−３と架橋プローブ
−４を加えると、ダイマープローブ−１の３’側領域
（Ｃ）と架橋プローブ−３の３’側領域（Ｃ’）、ダイ
マープローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−
４の５’側領域（Ａ’）、ダイマープローブ−２の３’
側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−４の３’側領域
（Ｆ）、ダイマープローブ−２の５’側領域（Ｄ’）と
架橋プローブ−３の５’側領域（Ｄ）が相補的領域であ
るために、一対のダイマープローブで形成されたダイマ
ーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイ
ブリダイゼーションすることにより、図１０（ｂ）に示
したように、プローブが自己集合して自己集合体を形成
するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６１】本発明の自己集合体の形成方法の第４の態
様は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオ
チドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及
び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチ
ドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマー
プローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領
域を互いに非相補的な塩基配列としたそれぞれ複数のダ
イマープローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２
ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数
個形成されたダイマープローブ含有系と、Ｎｏ．１及び
Ｎｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌク
レオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分
け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域
を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プロー
ブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで
順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第
（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の
系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第
（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマープローブの最
後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域、ダイマープローブの最後の系のＮｏ．
２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの
最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領
域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチドの３’側領域、架橋プローブの最後の系の
Ｎｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、を
それぞれ相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第
（２ｎ−１）番目の系までにおける複数のダイマープロ
ーブに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までに
おける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリ
ダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチド
が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させることを
特徴とする。

【００６２】図１１及び図１２は、本発明の自己集合体
の形成方法の第４の態様におけるｎ＝２の場合の例を示
す模式図である。二組のダイマープローブと二組の架橋
プローブを用いた場合は、一組のダイマープローブは、
図１１（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチ
ドの３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領
域に分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補
的な塩基配列を持つようにデザインされている第１の系
のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−
３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマープロー
ブ−４）から構成されていることから、Ｂ領域とＢ’領
域だけがハイブリダイゼーションするためにダイマーを
形成することができる。ただし、その他の領域について
は、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないた
め、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００６３】もう一組のダイマープローブは、図１１
（ｃ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの
３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に
分けられた領域のうち、中央領域だけが互いに相補的な
塩基配列を持つようにデザインされている第３の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−５）
とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダイマープローブ−
６）から構成されていることから、Ｇ領域とＧ’領域だ
けがハイブリダイゼーションするためにダイマーを形成
することができる。ただし、その他の領域については、
そのオリゴヌクレオチドどうしに相補性がないため、反
応はダイマーの形成だけで終了する。

【００６４】一方、一組の架橋プローブは、図１１
（ｂ）、図１１（ｄ）に示したように、一対のオリゴヌ
クレオチドの３’側領域、及び５’側領域の２つの領域
に分けられているが、いずれもの領域においても互いに
相補性がない第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
（架橋プローブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチド（架橋プローブ−５）とＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチド（架橋プローブ−６）から構成されて
いるために、ハイブリダイゼーションにより結合するこ
となく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００６５】次に、図１２（ａ）に示したように、ダイ
マープローブ−３とダイマープローブ−４から形成され
たダイマーと、ダイマープローブ−５とダイマープロー
ブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ
−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−７、架橋プロ
ーブ−８を加えると、ダイマープローブ−３の３’側領
域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、ダ
イマープローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プローブ
−７の５’側領域（Ａ’）、ダイマープローブ−４の
３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−８の３側領域
（Ｌ）、ダイマープローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と
架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマープロー
ブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側
領域（Ｆ’）、ダイマープローブ−５の３’側領域
（Ｈ）と架橋プローブ−７の３’側領域（Ｈ’）、ダイ
マープローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ
−８の５’側領域（Ｊ）、ダイマープローブ−６の３’
側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域
（Ｅ）、がそれぞれ相補的領域であるために、一対のダ
イマープローブで形成された二組のダイマーに対して、
二組の架橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダ
イゼーションすることにより、図１２（ｂ）に示したよ
うに、プローブが自己集合して自己集合体を形成するＰ
ＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６６】図１３は、本発明の自己集合体の形成方法
の第４の態様におけるｎ＝４の場合の例を示す模式図で
ある。図１３（ａ）に示したように、第１の系、第３の
系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイ
マープローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の
系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含
有系を有し、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域（Ｃ’）、第１の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系の
Ｎｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、第
２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｅ’）、第２の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、第３の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｈ’）、第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｊ）、第４の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、第
４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｌ）、第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、第５の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第
６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｐ）、第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｑ’）、第６の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、第７
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｔ’）、第７の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、第８の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｘ’）、第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ａ）、がそれぞれ相補的な塩基
配列であるため、一対のダイマープローブで形成された
二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋す
るようにハイブリダイゼーションすることにより、図１
３（ｂ）に示したように、プローブが自己集合して自己
集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００６７】図１３（ｂ）に示したように、ダイマープ
ローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系
が、ダイマープローブの第３の系と第５の系を架橋プロ
ーブの第４の系が、ダイマープローブの第５の系と第７
の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマープローブの
第７の系と第１の系を架橋プローブの第８の系が、それ
ぞれ架橋するようにハイブリダイゼーションすることに
より、自己集合体が形成され、重合の系の並びは、〈・
・・７，８，１，２，３，４，５，６，７，８，１，
２，・・・７，８，１，・・・〉の繰り返しとなり、ｎ
＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ，１，２，・
・・２ｋ−１，２ｋ，１，・・・〉の並びを繰り返しな
がら自己集合体を形成する。

【００６８】本発明の自己集合体の形成方法の第５の態
様は、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオ
チドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域及
び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチ
ドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマー
プローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領
域を互いに非相補的な塩基配列としたそれぞれ複数のダ
イマープローブをそれぞれ含む第１番目の系から第（２
ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順番に複数
個形成されたダイマープローブ含有系と、Ｎｏ．１及び
Ｎｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌク
レオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分
け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域
を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の架橋プロー
ブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ番目の系まで
順番に複数個形成された架橋プローブ含有系とを有し、
第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの３’側領域、第（２ｎ−３）番目
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第
（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチド
の５’側領域、第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の
系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第
（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域、ダイマープローブの最
後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と
架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
ドの３’側領域、ダイマープローブの最後の系のＮｏ．
２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と架橋プローブの
最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領
域、架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴ
ヌクレオチドの３’側領域、架橋プローブの最後の系の
Ｎｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１番目
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域、を
それぞれ相補的な塩基配列とし、第１番目の系から第
（２ｎ−１）番目の系までにおける複数のダイマープロ
ーブに対して、第２番目の系から第２ｎ番目の系までに
おける複数対の架橋プローブが架橋するようにハイブリ
ダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチド
が自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させることを
特徴とする。

【００６９】図１４は、本発明の自己集合体の形成方法
の第５の態様におけるｎ＝２の場合の例を示す模式図で
ある。二組のダイマープローブと二組の架橋プローブを
用いた場合は、一組のダイマープローブは、図１４
（ａ）に示したように、第４の態様と同様、一対のオリ
ゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領
域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけ
が互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされて
いる第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマ
ープローブ−３）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダ
イマープローブ−４）から構成されていることから、Ｂ
領域とＢ’領域だけがハイブリダイゼーションするため
にダイマーを形成することができる。ただし、その他の
領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補
性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００７０】もう一組のダイマープローブは、図１４
（ａ）に示したように、第４の態様と同様、一対のオリ
ゴヌクレオチドの３’側領域、中央領域、及び５’側領
域の３つの領域に分けられた領域のうち、中央領域だけ
が互いに相補的な塩基配列を持つようにデザインされて
いる第３の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（ダイマ
ープローブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（ダ
イマープローブ−６）から構成されていることから、Ｇ
領域とＧ’領域だけがハイブリダイゼーションするため
にダイマーを形成することができる。ただし、その他の
領域については、そのオリゴヌクレオチドどうしに相補
性がないため、反応はダイマーの形成だけで終了する。

【００７１】一方、一組の架橋プローブは、図１４
（ａ）に示したように、一対のオリゴヌクレオチドの
３’側領域、及び５’側領域の２つの領域に分けられて
いるが、いずれもの領域においても互いに相補性がない
第２の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド（架橋プロー
ブ−５）とＮｏ．２−オリゴヌクレオチド（架橋プロー
ブ−６）、および第４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
チド（架橋プローブ−９）とＮｏ．２−オリゴヌクレオ
チド（架橋プローブ−１０）から構成されているため
に、ハイブリダイゼーションにより結合することなく二
本のオリゴヌクレオチドのままである。

【００７２】次に、図１４（ａ）に示したように、ダイ
マープローブ−３とダイマープローブ−４から形成され
たダイマーと、ダイマープローブ−５とダイマープロー
ブ−６から形成されたダイマーに対して、架橋プローブ
−５、架橋プローブ−６、架橋プローブ−９、架橋プロ
ーブ−１０を加えると、ダイマープローブ−３の３’側
領域（Ｃ）と架橋プローブ−５の３’側領域（Ｃ’）、
ダイマープローブ−３の５’側領域（Ａ）と架橋プロー
ブ−１０の５’側領域（Ａ’）、ダイマープローブ−４
の３’側領域（Ｌ’）と架橋プローブ−１０の３側領域
（Ｌ）、ダイマープローブ−４の５’側領域（Ｄ’）と
架橋プローブ−６の５’側領域（Ｄ）、ダイマープロー
ブ−５の５’側領域（Ｆ）と架橋プローブ−５の５’側
領域（Ｆ’）、ダイマープローブ−５の３’側領域
（Ｈ）と架橋プローブ−９の３’側領域（Ｈ’）、ダイ
マープローブ−６の５’側領域（Ｊ’）と架橋プローブ
−９の５’側領域（Ｊ）、ダイマープローブ−６の３’
側領域（Ｅ’）と架橋プローブ−６の３’側領域
（Ｅ）、が相補的領域であるために、一対のダイマープ
ローブで形成された二組のダイマーに対して、二組の架
橋プローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーシ
ョンすることにより、図１４（ｂ）に示したように、プ
ローブが自己集合して自己集合体を形成するＰＡＬＳＡ
Ｒ法が行われる。

【００７３】図１５は、本発明の自己集合体の形成方法
の第５の態様におけるｎ＝４の場合の例を示す模式図で
ある。図１５（ａ）に示したように、第１の系、第３の
系、第５の系、第７の系という４個の系を形成するダイ
マープローブ含有系と、第２の系、第４の系、第６の
系、第８の系という４個の系を形成する架橋プローブ含
有系を有し、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチド
の３’側領域（Ｃ）と第２の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの３’側領域（Ｃ’）、第１の系のＮｏ．２−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ’）と第２の系の
Ｎｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｄ）、第
２の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｅ）と第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｅ’）、第２の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｆ’）と第３の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｆ）、第３の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｈ）と第４
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｈ’）、第３の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｊ’）と第４の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｊ）、第４の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ）と第５の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｋ’）、第
４の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｌ’）と第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ｌ）、第５の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｎ）と第６の系のＮｏ．１−オリ
ゴヌクレオチドの３’側領域（Ｎ’）、第５の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｐ’）と第
６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
（Ｐ）、第６の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｑ）と第７の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
オチドの３’側領域（Ｑ’）、第６の系のＮｏ．１−オ
リゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ’）と第７の系のＮ
ｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｒ）、第７
の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｔ）と第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの
３’側領域（Ｔ’）、第７の系のＮｏ．２−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ｕ’）と第８の系のＮｏ．１−
オリゴヌクレオチドの５’側領域（Ｕ）、第８の系のＮ
ｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域（Ｘ）と第１
の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
（Ｘ’）、第８の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの
５’側領域（Ａ’）と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌク
レオチドの５’側領域（Ａ）、がそれぞれ相補的な塩基
配列であるため、一対のダイマープローブで形成された
二組のダイマーに対して、架橋プローブが次々に架橋す
るようにハイブリダイゼーションすることにより、図１
５（ｂ）に示したように、プローブが自己集合して自己
集合体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００７４】図１５（ｂ）に示したように、ダイマープ
ローブの第１の系と第３の系を架橋プローブの第２の系
が、ダイマープローブの第３の系と第５の系を架橋プロ
ーブの第４の系が、ダイマープローブの第５の系と第７
の系を架橋プローブの第６の系が、ダイマープローブの
第１の系同士を架橋プローブの第８の系のＮｏ．２−オ
リゴヌクレオチドが、ダイマープローブの第７の系同士
を架橋プローブの第８の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオ
チドが、それぞれ架橋するようにハイブリダイゼーショ
ンすることにより、自己集合体が形成され、重合の系の
並びは、〈・・・７，８のＮｏ．１（８₁），７，６，
５，４，３，２，１，８のＮｏ．１（８₂），１，２，
３，４，５，６，７，８₁，７・・・〉の繰り返しとな
り、ｎ＝ｋの場合では、〈・・・２ｋ−１，２ｋ₁，２
ｋ−１，２ｋ−２・・・３，２，１，２ｋ₂，１，２，
３・・・２ｋ−２，２ｋ−１，２ｋ₁，２ｋ−１，２ｋ
−２・・・〉の並びを繰り返しながら自己集合体を形成
する。

【００７５】本発明の自己集合体の形成方法において
は、図１６に示すように、架橋プローブにおける２領域
の中央にフリーサイト領域を有する架橋プローブを用い
て、ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い、自己集合体を形成さ
せるこができる。一組のダイマープローブは、図１６
（ａ）に示したように、第２の態様の第１の系で用いた
ダイマープローブと同じダイマープローブ−１とダイマ
ープローブ−２から構成されている。

【００７６】一方、架橋プローブは、図１６（ａ）に示
したように、第２の態様の第２の系で用いた架橋プロー
ブの領域の中央にフリーサイト領域を有する架橋プロー
ブ−１１と架橋プローブ−１２から構成されている。

【００７７】次に、図１６（ａ）に示したように、ダイ
マープローブ−１とダイマープローブ−２から形成され
たダイマーに対して、架橋プローブ−１１と架橋プロー
ブ−１２を加えると、ダイマープローブ−１の３’側領
域（Ｃ）と架橋プローブ−１１の３’側領域（Ｃ’）、
ダイマープローブ−１の５’側領域（Ａ）と架橋プロー
ブ−１１の５’側領域（Ａ’）、ダイマープローブ−２
の３’側領域（Ｆ’）と架橋プローブ−１２の３’側領
域（Ｆ）、ダイマープローブ−２の５’側領域（Ｄ’）
と架橋プローブ−１２の５’側領域（Ｄ）が相補的領域
であるために、一対のダイマープローブで形成されたダ
イマーに対して、架橋プローブが次々に架橋するように
ハイブリダイゼーションすることにより、図１６（ｂ）
に示したように、プローブが自己集合して自己集合体を
形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【００７８】上記自己集合体の形成方法で用いるプロー
ブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成され
るが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例
えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、WO 92/20702）やLocked
Nucleic Acid（ＬＮＡ、Koshkin AA et al. Tetrahedro
n 1998.54,3607-3630., Koshkin AA et al. J. Am. Che
m. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C et al.
PNAS. 2000.97,5633-5638.）が挙げられる。また、一
対のプローブは、通常、同じ種類の核酸で構成される
が、たとえばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対に
なっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類は
ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体（たとえばＰＮＡやＬ
ＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプロー
ブ内での核酸組成は一種類、たとえばＤＮＡのみから構
成される必要はなく、必要に応じて、たとえば、ＤＮＡ
とＲＮＡから構成されるプローブ（キメラプローブ）を
使用することも可能であり、本発明に含まれる。

【００７９】上記プローブの各相補的塩基配列領域の長
さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好まし
くは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜３０塩
基である。

【００８０】上記自己集合体の形成方法で使用するプロ
ーブの前記プローブの相補的塩基配列領域の端部に、少
なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ（シトシン）を
配置させ、プローブがハイブリダイズした際に少なくと
も１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領域の端部に形成
させることにより、塩基の積み重ね（stacking of bas
e）により塩基のπ電子の特殊な相互作用を生じさせ、
より安定した二本鎖の自己集合体を形成させることがで
きる。

【００８１】図１７及び図１８に示したように、プロー
ブの互い違いに交差する円形で示した部分の結合をＧと
Ｃにし、円形で示した分岐点の結合を強固にすることに
よって、積み重ね効果（stacking effect、スタッキン
グ効果と称すこともある）が増し、結果的にその分岐点
にはさまれている領域のハイブリダイゼーションが安定
すると考えられる。

【００８２】上記の相補的領域の端部に配置されるＣま
たはＧの数は少なくとも１塩基であり、複数個であって
も差し支えない。各相補領域の塩基配列を考慮し適宜選
択することができる。複数個のＣまたはＧを配置させる
場合、Ｃ、Ｇの順序は特に限定されず自由に組み合わせ
ることができる。

【００８３】上記ＰＡＬＳＡＲ法の原理に従い形成され
る自己集合体は、ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドの２６
０ｎｍにおける紫外部の吸収度の強度が減ずる「ハイポ
クロミズム」という淡色効果を発現する特徴を有する、
塩基の積み重ねが規則的な高次構造をとるものである。
従って、淡色効果を発現させて自己集合体の状態を確認
し、さらには、自己集合体の塩基の積み重ねの間に蛍光
物質を挿入させて、その蛍光強度の変化から自己集合体
の状態を確認することが可能である。

【００８４】上記自己集合体の形成方法を用いて形成さ
れた自己集合体は、形成された自己集合体の融解曲線を
解析することにより、検出することが可能である。

【００８５】核酸やタンパク質のような生体高分子は、
加熱していくとある温度で立体構造に極端な変化が生
じ、この時の温度を融解温度（melting temperature；
Ｔｍ値）という。例えば、ＤＮＡの場合、薄い中性の塩
溶液の中で二重らせん構造をとっているＤＮＡの溶液の
温度を上昇させながら溶液の紫外線吸収を測定すると、
ＤＮＡのらせん構造がほどけるに伴って２６０ｎｍの極
大吸収が増大する。この吸光度の増加、すなわち核酸分
子の変性は、温度が上昇するに従って徐々に起こるので
はなく、ある温度に達すると急激に起こり、かなり狭い
温度幅で最大値に達し、再び一定になる。ちょうど吸光
度が最終増加高の半分まで増加した、変化の起こった中
間の温度である温度を、Ｔｍ値と呼んでいる。

【００８６】Ｔｍ値は、溶媒の条件によって変わるが、
一定の条件下ではＤＮＡ中のＧＣ含量に比例し、ＧＣ含
量が多いものほど高い。具体的には、Ｔｍ値は、「細胞
工学別冊 バイオ実験イラストレイテッド（株）秀潤
社（著者：中山広樹）」に記載の方法に従い、以下の数
式（Ｉ）にて求めることも可能である。

【００８７】

【数１】 Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６×ｌｏｇ₁₀［Ｓ］ ＋０．４１×（％ＧＣ）−（５００／ｎ） ・・・（Ｉ）

【００８８】（上記数式（Ｉ）において、［Ｓ］は塩の
モル濃度（Ｍ）を、（％ＧＣ）はオリゴヌクレオチド中
のＧＣ含量（％）を、ｎはオリゴヌクレオチドの長さ
（ｂｐ）をそれぞれ示す。）

【００８９】上記自己集合体の形成方法において用いる
自己集合体形成前の上記プローブは、融解温度の解析に
おいて、通常の融解曲線を示すものである。さらに、測
定されたＴｍ値も上記数式にて算出される値と一致す
る。しかしながら、上記プローブから形成された自己集
合体は、まったく異なる融解曲線及びＴｍ値を示すもの
であり、更に、この融解曲線は、形成された自己集合体
の量に応じて変化するものであるため、融解温度の解析
において融解曲線を解析することにより、自己集合体の
検出及び定量分析が可能である。

【００９０】自己集合体の融解曲線は、図１９に示した
如く、急激な変化ではなく、徐々に変化するものであ
り、この融解曲線は自己集合体の量が増加するにつれ緩
やかな傾きとなり、Ｔｍ値も変化するものである。従っ
て、形成された自己集合体の融解曲線の傾き及びＴｍ値
を分析することにより、簡単に自己集合体の検出及び定
量分析を行うことができる。なお、融解曲線を微分分析
すること等により、より好ましく定量分析を行うことが
できる。

【００９１】本発明に係る自己集合体の検出方法におけ
る融解温度の解析方法は、特に限定されず、上記紫外線
吸収によるものだけでなく、例えば、旋光分散（又は円
二色性）や赤外線吸収などでも解析可能である。また、
本発明に係る自己集合体の検出方法は、核酸と結合する
性質を有する蛍光物質を添加させ、蛍光を用いて自己集
合体の融解温度及び融解曲線を解析することが好まし
い。

【００９２】蛍光を用いたＤＮＡ融解曲線解析において
は、チューブ内の温度をゆっくりと上昇させることによ
りｄｓＤＮＡに結合した蛍光物質がｄｓＤＮＡの変性の
ため遊離する。その蛍光を連続的に測定することによ
り、それぞれの核酸の正確なＴｍ値を提供するものであ
る。図１９に示した如く、自己集合体形成前のプローブ
は、一般的な核酸と同様、非常に狭い範囲で急激な蛍光
の減少が起こり、測定されるＴｍ値も上記数式にて算出
される値と一致する。しかしながら、自己集合体の融解
曲線は、図に示した如く、急激な減少ではなく、徐々に
減少するものであり、この融解曲線は自己集合体の量が
増加するにつれ緩やかな傾きとなる。また、Ｔｍ値も自
己集合体の形成量に応じて変化するものである。従っ
て、形成された自己集合体の融解曲線の傾き及びＴｍ値
を分析することにより、簡単に自己集合体の検出及び定
量分析を行うことができる。なお、融解曲線を積分分析
すること等により、より好ましく定量分析を行うことが
できる。

【００９３】核酸と結合する性質を有する蛍光物質は、
特に限定されないが、例えば、SYBRGreen I stain、SYB
R Green II stain、SYBR Green Gold stain、Vistra Gr
eenstain、Gelstar stain、Radlant Red stain、PicoGr
een、RiboGreen、OllGreen、Hoechst 33258(Bis-Benzimi
de)、Propidium lodide、YO-PRO-1 lodide、YO-PRO-3 l
odide （以上、Molecular Probes社製）、臭化エチジウ
ム、Distamycin A、TOTO、Psoralen、アクリニジウムオ
レンジ（Acridine Orange)、AOAO（homodimer）等が好
適に用いられる。

【００９４】また、使用する蛍光物資の濃度は、特に限
定されないが、１ｐｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度
が好適であり、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃
度がさらに好適である。

【００９５】蛍光物質を添加する時期は、特に限定され
ず、自己集合体の形成の前でもよく、形成後でもよい。

【００９６】融解温度の測定に用いる条件は、特に限定
されないが、融解温度を測定可能な装置を用いて、通常
の条件により測定することができる。例えば、Ｓｍａｒ
ｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、６０
℃から９５℃の範囲の温度に対して、１秒間に０．２℃
ずつ温度を上昇させて、融解温度及び融解曲線を求める
ことにより、自己集合体の検出及び定量分析を好適に行
うことができる。上記の方法により、非常に簡便かつ短
時間で自己集合体の定量分析を行なうことができる。

【００９７】上記自己集合体の形成方法により形成され
た自己集合体の検出方法を利用して、試料中のターゲッ
ト遺伝子の検出及び定量分析が可能である。

【００９８】本発明におけるターゲット遺伝子（ＤＮＡ
またはＲＮＡ）測定用試料は、該核酸を含む可能性のあ
るあらゆる試料が適用できる。ターゲット遺伝子は試料
より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定さ
れない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、
組織液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細
菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が
挙げられる。また、試料中のターゲット遺伝子を公知の
方法で増幅したＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸も使用でき
る。

【００９９】以下に上記自己集合体の検出方法を利用し
た、試料中のターゲット遺伝子の検出及び定量分析を示
す。下記ライゲーション反応は、Ligase（リガーゼ）酵
素を使用する方法と酵素を使わず特殊なオリゴヌクレオ
チドを使用する方法のいずれにも限定されない方法であ
る。

【０１００】１．一対のＨＣＰによるターゲット遺伝子
の検出 図２０〜図２２までは、１箇所が切断されているＰＡＬ
ＳＡＲ法で使用する一対のプローブであるＨＣＰのライ
ゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出
の一例を示す模式図である。

【０１０１】図２０（ａ）（ｂ）に示すように、ターゲ
ット遺伝子と相補的な領域を有し、その箇所を切断され
たプローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、ター
ゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後（図２０
（ｃ））、ライゲーション反応によって連結され（図２
０（ｄ））、その後、熱により二本鎖を解離させる（図
２０（ｅ））。次に、未だ切断されたままのプローブ
（図２１（ｆ））は、ターゲット遺伝子又は連結された
プローブとハイブリダイゼーションした後（図２１
（ｇ））、ライゲーション反応によって連結され、熱に
より二本鎖が解離される。９５℃〜２５℃の範囲の温度
コントロールにより、上記ハイブリダイゼーション反応
→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブ
を連結させて完全なプローブを形成させる（図２１
（ｈ））。連結したプローブはＰＡＬＳＡＲ法により二
本鎖の自己集合体を形成する（図２１（ｉ））。ターゲ
ット遺伝子が存在しない場合には、切断されたプローブ
は連結されず、切断されたプローブでは自己集合体は形
成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲッ
ト遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のプ
ローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、
ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のプ
ローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺
伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそ
れぞれ切断したプローブを用いることも可能である。

【０１０２】２．複数対のＨＣＰによるターゲット遺伝
子の検出 図２３及び図２４は、それぞれ切断する１領域が異なる
２種の一対のＨＣＰを用いて、切断されたＨＣＰのライ
ゲーション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出
の一例を示す模式図である。

【０１０３】図２３（ａ）（ｂ）に示すように、ターゲ
ット遺伝子とそれぞれ相補的な領域を有し、その箇所を
切断されたプローブは、ターゲット遺伝子が存在する場
合、ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後
（図２３（ｃ）（ｄ））、ライゲーション反応によって
連結され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次
に、未だ切断されたままのプローブは、ターゲット遺伝
子又は連結されたプローブとハイブリダイゼーションし
た後、ライゲーション反応によって連結され、熱により
二本鎖が解離される。９５℃〜２５℃の範囲の温度コン
トロールにより、上記ハイブリダイゼーション反応→ラ
イゲーション反応→解離反応を繰り返し、プローブを連
結させて完全なプローブを形成させる（図２４
（ｅ））。連結したプローブはＰＡＬＳＡＲ法により二
本鎖の自己集合体を形成する（図２４（ｆ））。ターゲ
ット遺伝子が存在しない場合には、切断されたプローブ
は連結されず、切断されたプローブでは自己集合体は形
成されない。故に、自己集合体の形成により、ターゲッ
ト遺伝子を検出することが可能である。なお、一対のプ
ローブの一方のみを相補領域で切断したものを使用し、
ライゲーション反応後に切断されていないもう一方のプ
ローブを加えることも可能である。また、ターゲット遺
伝子に相補的な領域を２箇所以上作製し、その箇所をそ
れぞれ切断したプローブを用いることも可能である。

【０１０４】３．ダイマープローブと架橋プローブによ
るターゲット遺伝子の検出 図２５及び図２６は、一対のダイマープローブ及び一対
の架橋プローブを用いたライゲーション反応による２本
鎖のターゲット遺伝子の検出の一例を示す模式図であ
る。

【０１０５】ダイマープローブと架橋プローブによるタ
ーゲット遺伝子の検出の第１の例として、ＰＡＬＳＡＲ
法で使用するオリゴヌクレオチドは、第１の系において
は、図２５（ａ）（ｂ）に示したように、自己集合体形
成方法の第２の態様の第１の系で用いたダイマープロー
ブと同じダイマープローブ−１とダイマープローブ−２
から構成されているが、中央のＢ領域、Ｂ’領域は相補
的な塩基配列であると同時にターゲット遺伝子とも相補
的な塩基配列である。あらかじめこのＢ領域及びＢ’領
域をそれぞれ切断し、切断により生じたＢ領域、Ｂ’領
域の５’末端をリン酸基で修飾しておく。

【０１０６】一方、架橋プローブは、図２６（ｆ）に示
したように、自己集合体形成方法の第２の態様の第２の
系と同じ架橋プローブ−１と架橋プローブ−２から構成
されているために、ハイブリダイゼーションにより結合
することなく二本のオリゴヌクレオチドのままである。

【０１０７】次に、図２５（ｃ）に示したように、ター
ゲット遺伝子のＢ領域、Ｂ’領域に対して、切断された
ダイマープローブがそれぞれハイブリダイズする。

【０１０８】図２５（ｃ）に示したように、切断された
ダイマープローブは、それぞれが隣接してハイブリダイ
ズするために、図２５（ｄ）に示したように、ライゲー
ション反応によって隣接した部分が連結され、完全な形
のダイマープローブ−１とダイマープローブ−２が完成
する。

【０１０９】解離後、完成したダイマープローブ−１と
ダイマープローブ−２は、連結していない未反応な切断
されたままのダイマープローブの新しいターゲット遺伝
子となるため、図２５（ｃ）と同様、切断されたダイマ
ープローブはターゲット遺伝子又は連結されたダイマー
プローブとハイブリダイズして、ライゲーション反応に
よって隣接した部分が連結され、９５℃〜２５℃の範囲
の温度コントロールにより、上記ハイブリダイゼーショ
ン反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返すこと
により、完全な形のダイマープローブ−１とダイマープ
ローブ−２が次々に完成する。

【０１１０】このライゲーション反応でできたダイマー
プローブ−１とダイマープローブ−２から形成されたダ
イマー［図２６（ｅ）］に対して、図２６（ｆ）に示し
た架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を加えると、ダ
イマープローブ−１の３’側領域（Ｃ）と架橋プローブ
−１の３’側領域（Ｃ’）、ダイマープローブ−１の
５’側領域（Ａ）と架橋プローブ−１の５’側領域
（Ａ’）、ダイマープローブ−２の３’側領域（Ｆ’）
と架橋プローブ−２の３’側領域（Ｆ）、ダイマープロ
ーブ−２の５’側領域（Ｄ’）と架橋プローブ−２の
５’側領域（Ｄ）が相補的領域であるために、一対のダ
イマープローブで形成されたダイマーに対して、架橋プ
ローブが次々に架橋するようにハイブリダイゼーション
することにより、図２６（ｇ）に示したように、プロー
ブが自己集合して二本鎖の自己集合体を形成するＰＡＬ
ＳＡＲ法が行われる。

【０１１１】ターゲット遺伝子が存在しない場合には、
切断されたダイマープローブは連結されず、切断された
ダイマープローブでは自己集合体は形成されない。故
に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出
することが可能である。なお、一対のプローブの一方の
みを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション
反応後に切断されていないもう一方のプローブを加える
ことも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な
領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断した
プローブを用いることも可能である。

【０１１２】４．複数のダイマープローブ及び一対の架
橋プローブによるターゲット遺伝子の検出 図２７及び図２８は、それぞれ切断される中央領域が異
なる２組の一対のダイマープローブ及び一対の架橋プロ
ーブを用いて、切断されたダイマープローブのライゲー
ション反応による２本鎖のターゲット遺伝子の検出の一
例を示す模式図である。

【０１１３】図２７（ａ）〜（ｃ）に示すように、ター
ゲット遺伝子とそれぞれ相補的な領域（α及びα’領
域、β及びβ’領域）を有し、その箇所を切断されたダ
イマープローブは、ターゲット遺伝子が存在する場合、
ターゲット遺伝子とハイブリダイゼーションした後（図
２７（ｄ）（ｅ））、ライゲーション反応によって連結
され、その後、熱により二本鎖を解離させる。次に、未
だ切断されたままのダイマープローブは、ターゲット遺
伝子又は連結されたダイマープローブとハイブリダイゼ
ーションした後、ライゲーション反応によって連結さ
れ、熱により二本鎖が解離される。９５℃〜２５℃の範
囲の温度コントロールにより、上記ハイブリダイゼーシ
ョン反応→ライゲーション反応→解離反応を繰り返し、
プローブを連結させて完全なダイマープローブを形成さ
せる。

【０１１４】連結したダイマープローブから形成された
ダイマー［図２８（ｆ）（ｇ）］に対して、図２８
（ｈ）に示した架橋プローブ−１と架橋プローブ−２を
加えると、一対のダイマープローブで形成されたダイマ
ーに対して、架橋プローブが次々に架橋するようにハイ
ブリダイゼーションすることにより、図２８（ｉ）に示
したように、プローブが自己集合して二本鎖の自己集合
体を形成するＰＡＬＳＡＲ法が行われる。

【０１１５】ターゲット遺伝子が存在しない場合には、
切断されたダイマープローブは連結されず、切断された
ダイマープローブでは自己集合体は形成されない。故
に、自己集合体の形成により、ターゲット遺伝子を検出
することが可能である。なお、一対のプローブの一方の
みを相補領域で切断したものを使用し、ライゲーション
反応後に切断されていないもう一方のプローブを加える
ことも可能である。また、ターゲット遺伝子に相補的な
領域を２箇所以上作製し、その箇所をそれぞれ切断した
プローブを用いることも可能である。

【０１１６】上記方法では、ダイマープローブの中央領
域をターゲット遺伝子と相補的となるように構成した
が、５’側領域や３’側領域をターゲット遺伝子と相補
的な領域とし、その領域をあらかじめ切断しておき、タ
ーゲット遺伝子を検出することも可能である。また、ダ
イマープローブの代わりに、架橋プローブを、ターゲッ
ト遺伝子と相補的な領域を有するように構成し、あらか
じめ架橋プローブのターゲット遺伝子と相補的な領域を
有する部分を切断し、ライゲーション反応によりターゲ
ット遺伝子を検出することもできる。

【０１１７】自己集合体の第６の態様のダイマープロー
ブを用いてターゲット遺伝子を検出することもできる。
これは、ターゲット遺伝子と相補的な領域を有し、その
箇所を切断されたダイマープローブを用いるものであ
る。

【０１１８】自己集合体の形成される量は、ターゲット
遺伝子の量に依存する。よって、上記自己集合体の検出
方法を用いて、形成された自己集合体の定量分析を行う
ことにより、ターゲット遺伝子の定量分析が可能であ
る。

【０１１９】上記の方法を応用することにより、１本鎖
のターゲット遺伝子や、ＳＮＰｓの検出が可能である。
１本鎖のターゲット遺伝子の検出の場合は、ターゲット
遺伝子と相補的な領域を一箇所以上切断したプローブを
用いること等により検出可能である。ＳＮＰｓの検出の
場合は、ＳＮＰｓを含む領域が相補的な領域となるよう
なプローブを作製し、その箇所を切断したプローブを用
いること等により、検出可能である。

【０１２０】ターゲット遺伝子を検出する別の具体的手
法としては、たとえば、まず最初に検体試料と少なくと
も１種類の捕捉用プローブを反応させ、ターゲット遺伝
子と捕捉用プローブを結合させる。この際、少なくとも
一種類のビオチン化捕捉用プローブを使用する。次い
で、自己集合体を形成する一対のプローブの一方を添加
し反応させた後、もう一方のプローブを反応させてター
ゲット遺伝子・自己集合体複合体を形成させる。次い
で、アビジン化磁性体粒子（磁性体ビーズ）を反応させ
該複合体と結合させ、ビーズの性質を利用して該複合体
を未反応物質から分離する。最後に、ＳＹＢＲ^TMＧｒｅ
ｅｎＩのようなインターカレーター色素を反応させ、融
解曲線解析により自己集合体の量を定量することによ
り、検体試料中のターゲット遺伝子量を測定する。形成
させた自己集合体の分離を容易にするために、磁気ビー
ズを使用することもできる。

【０１２１】別の手法としては、たとえば、ターゲット
遺伝子の一部と相補的塩基配列を含有するオリゴヌクレ
オチドを固相化したウェルを使用することができる。ま
ず検体試料をウェルに添加し試料中のターゲット遺伝子
と、固相化したターゲット遺伝子の一部と相補的塩基配
列を含有するオリゴヌクレオチドを結合させる。次い
で、上記の方法に準じて、自己集合体を形成するプロー
ブを順次添加することにより、自己集合体が形成され結
合することになる。未反応物質との分離は、ウェルを洗
浄することにより容易にでき、最後に融解曲線解析を用
いて自己集合体量を測定することによりターゲット遺伝
子を測定できる。

【０１２２】この手法に準じれば、ＤＮＡチップへの応
用も可能である。

【０１２３】

【実施例】以下に、本発明の実施例を挙げて説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものでないこ
とは勿論である。

【０１２４】以下に実施例において用いたオリゴヌクレ
オチド・プローブを示す。 ［１］ターゲット遺伝子−１；ＭＲＳＡ−Ｔ１ 5'−aacatgaaaaat gattatggctcaggta ctgctatccaccctca
aacagg tg aattattagcacttgtaagcacaccttc−3' ［２］ターゲット遺伝子−２；ＭＲＳＡ−Ｔ２ 5'−gaaggtgtgcttacaagtgctaataatt ca cctgtttgagggtg
gatagcag tacctgagccataatc atttttcatgtt−3' ［３］ターゲット遺伝子−３；ＭＲＳＡ−Ｔ３ 5'−tagaccgaaacaatgtggaatt ggccaatacaggaacacatatga
gattaggcatcgttcc aaagaatgtatctaaaa−3' ［４］ターゲット遺伝子−４；ＭＲＳＡ−Ｔ４ 5'−ttttagatacattcttt ggaacgatgcctaatctcatatgtgttc
ctgtattggcc aattccacattgtttcggtcta−3' ［５］ＨＣＰ−１；ＭＲＳＡ−Ａ１ 5'−catatgtcggacttagcgtc ctgctatccac cctcaaacagg g
attggtagaggcagattgg−3' ［６］ＨＣＰ−２；ＭＲＳＡ−Ａ２ 5'−gacgctaagtccgacatatg cctgtttgagg gtggatagcag c
caatctgcctctaccaatc3' ［７］ＨＣＰ−３；ＭＲＳＡ−Ａ１−１ 5'−catatgtcggacttagcgtc ctgctatccac−3' ［８］ＨＣＰ−４；ＭＲＳＡ−Ａ１−２ 5'（リン酸化）−cctcaaacagg gattggtagaggcagattgg−
3' ［９］ＨＣＰ−５；ＭＲＳＡ−Ａ２−１ 5'−gacgctaagtccgacatatg cctgtttgagg−3' ［１０］ＨＣＰ−６；ＭＲＳＡ−Ａ２−１ 5'（リン酸化）−gtggatagcag ccaatctgcctctaccaatc−
3' ［１１］ＨＣＰ−７；ＭＲＳＡ−Ｂ１ 5'−catatgtcggacttagcgtc gattatggctcaggtactgc tatc
caccctcaaacaggtg gtagtgtagaggcagagttg−3' ［１２］ＨＣＰ−８；ＭＲＳＡ−Ｂ２ 5'−gacgctaagtccgacatatg cacctgtttgagggtggata gca
gtacctgagccataatc caactctgcctctacactac−3' ［１３］ＨＣＰ−９；ＭＲＳＡ−Ｂ１−１ 5'−catatgtcggacttagcgtc gattatggctcaggtactgc−3' ［１４］ＨＣＰ−１０；ＭＲＳＡ−Ｂ１−２ 5'（リン酸化）−tatccaccctcaaacaggtg gtagtgtagaggc
agagttg−3' ［１５］ＨＣＰ−１１；ＭＲＳＡ−Ｂ２−１ 5'−gacgctaagtccgacatatg cacctgtttgagggtggata−3' ［１６］ＨＣＰ−１２；ＭＲＳＡ−Ｂ２―２ 5'（リン酸化）−gcagtacctgagccataatc caactctgcctct
acactac−3' ［１７］ＨＣＰ−１３；ＭＲＳＡ−Ｂ３ 5'−gtattcacgcagaaagcgtc ggccaatacaggaacacata tgag
attaggcatcgttcc gacgcttactgcgtgtatag−3' ［１８］ＨＣＰ−１４；ＭＲＳＡ−Ｂ４ 5'−gacgctttctgcgtgaatac ggaacgatgcctaatctca tatgt
gttcctgtattggcc ctatacacgcagtaagcgtc−3' ［１９］ＨＣＰ−１５；ＭＲＳＡ−Ｂ３−１ 5'−gtattcacgcagaaagcgtc ggccaatacaggaacacata−3' ［２０］ＨＣＰ−１６；ＭＲＳＡ−Ｂ３−２ 5'（リン酸化）−tgagattaggcatcgttcc gacgcttactgcgt
gtatag−3' ［２１］ＨＣＰ−１７；ＭＲＳＡ−Ｂ４−１ 5'−gacgctttctgcgtgaatac ggaacgatgcctaatctca−3' ［２２］ＨＣＰ−１８；ＭＲＳＡ−Ｂ４−２ 5'（リン酸化）−tatgtgttcctgtattggcc ctatacacgcagt
aagcgtc−3' ［２３］ダイマープローブ−１；ＭＲＳＡ−１ 5'−gtgctgacttaaccggatac gattatggctcaggtactgc tatc
caccctcaaacaggtg gattggtactgcgagatagg−3' ［２４］ダイマープローブ−２；ＭＲＳＡ−２ 5'−gacgctttctgcgtgtatag cacctgtttgagggtggata gcag
tacctgagccataatc ctagaacggatcgtacttcg−3' ［２５］ダイマープローブ−３；ＭＲＳＡ−１−１ 5'−gtgctgacttaaccggatac gattatggctcaggtactgc−3' ［２６］ダイマープローブ−４；ＭＲＳＡ−１−２ 5'（リン酸化）−tatccaccctcaaacaggtg gattggtactgcg
agatagg−3' ［２７］ダイマープローブ−５；ＭＲＳＡ−２−１ 5'−gacgctttctgcgtgtatag cacctgtttgagggtggata−3' ［２８］ダイマープローブ−６；ＭＲＳＡ−２−２ 5'（リン酸化）−gcagtacctgagccataatc ctagaacggatcg
tacttcg3' ［２９］ダイマープローブ−７；ＭＲＳＡ−３ 5'−gtgctgacttaaccggatac ggccaatacaggaacacata tgag
attaggcatcgttcc gattggtactgcgagatagg−3' ［３０］ダイマープローブ−８；ＭＲＳＡ−４ 5'−gacgctttctgcgtgtatag ggaacgatgcctaatctca tatgt
gttcctgtattggcc ctagaacggatcgtacttcg−3' ［３１］ダイマープローブ−９；ＭＲＳＡ−３−１ 5'−gtgctgacttaaccggatac ggccaatacaggaacacata−3' ［３２］ダイマープローブ−１０；ＭＲＳＡ−３−２ 5'（リン酸化）−tgagattaggcatcgttcc gattggtactgcga
gatagg−3' ［３３］ダイマープローブ−１１；ＭＲＳＡ−Ｂ２−１ 5'−gacgctttctgcgtgtatag ggaacgatgcctaatctca−3' ［３４］ダイマープローブ−１２；ＭＲＳＡ−Ｂ２−２ 5'（リン酸化）−tatgtgttcctgtattggcc ctagaacggatcg
tacttcg−3' ［３５］架橋プローブ−１ 5'−ctatacacgcagaaagcgtc cgaagtacgatccgttctag−3' ［３６］架橋プローブ−２ 5'−gtatccggttaagtcagcac cctatctcgcagtaccaatc−3' ［３７］非ターゲット遺伝子−１；ＨＣＶ−１ 5'−ttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagagtgcttgcg
agtgccccgggaggtc−3' ［３８］非ターゲット遺伝子−２；ＨＣＶ−２ 5'−ttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgccttatagggtgcttgcg
agtgccccgggaggtc−3'

【０１２５】（実施例１〜５及び比較例１） １．目的 一対のＨＣＰより形成される自己集合体の検出、及び自
己集合体形成反応によるターゲット遺伝子の検出とし
て、ライゲーション反応を用いて完全な一対のＨＣＰを
作製し、融解曲線解析をすることにより、ターゲット遺
伝子の検出を行った。

【０１２６】２．材料 １）ＭＲＳＡのＰＢＰgene由来の８０塩基の合成オリゴ
ヌクレオチドＭＲＳＡ−Ｔ１（ターゲット遺伝子−１）
及びＭＲＳＡ−Ｔ２（ターゲット遺伝子−２）をターゲ
ット遺伝子とした。ＭＲＳＡ−Ｔ１とＭＲＳＡ−Ｔ２は
相補的である。各ターゲット遺伝子はそれぞれ１００ｐ
ｍｏｌ／ｕＬ（実施例１）、５０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施
例２）、１０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例３）、及び１ｐｍ
ｏｌ／ｕＬ（実施例４）に調整した。

【０１２７】２）ターゲット遺伝子１及び２にそれぞれ
相補的な塩基配列をもつ一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１及び
ＨＣＰ−２）を作製し、それぞれ各ＨＣＰのターゲット
遺伝子と相補的領域を１箇所切断したプローブ（ＨＣＰ
−３及びＨＣＰ−４、ＨＣＰ−５及びＨＣＰ−６）を検
出プローブとして用いた。各ＨＣＰはそれぞれ１００ｐ
ｍｏｌ／ｕＬに調整した。

【０１２８】３）ライゲーション反応には、耐熱性リガ
ーゼ酵素TscDNAligase thermostable(Roche Molecular
Biochemicals社製)と添付の10×Incubation bufferを使
用した。

【０１２９】４）緩衝液として、２０×ＳＳＣ（３Ｍ−
ＮａＣｌ，０．３Ｍ−Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ，ｐＨ
７．０）を使用した。

【０１３０】３．方法 ａ）反応液の調製 実施例１〜４では、０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチュ
ーブに、ターゲット遺伝子−１及びターゲット遺伝子−
２を各１μＬ、ＨＣＰ−３、ＨＣＰ−４、ＨＣＰ−５及
びＨＣＰ−６を各１μＬ、TscDNAligase thermostable
（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×Incubation bufferを２
μＬ加えて、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの反応溶液とし
た。

【０１３１】実施例５では、０．２ｍＬの滅菌済みマイ
クロチューブに、ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を各１μ
Ｌ、TscDNAligase thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μ
Ｌ、10×Incubation bufferを２μＬ加えて、Ｈ₂Ｏを加
えて計２０μＬの反応溶液とした。

【０１３２】比較例１では、０．２ｍＬの滅菌済みマイ
クロチューブに、ＨＣＰ−３、ＨＣＰ−４、ＨＣＰ−５
及びＨＣＰ−６を各１μＬ、TscDNAligase thermostabl
e（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×Incubation bufferを２
μＬ加えて、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの反応溶液とし
た。

【０１３３】ｂ）ライゲーション反応 上記反応溶液をサーマルサイクラー（パーキンエルマー
社製）で、９２℃／４分→６６℃／３分を１サイクル、
９２℃／２０秒→６６℃／２０秒を８０サイクル反応さ
せることによりライゲーション反応を行い、９９℃１０
分で酵素反応を停止させた。

【０１３４】ｃ）自己集合体形成反応 上記ライゲーション反応溶液を１０μＬ、２０×ＳＳＣ
を１２．５μＬ、１０００倍希釈したＳＹＢＲ^TMＧｒｅ
ｅｎＩ（FMC BioProducts社製）を２μＬ、Ｈ₂Ｏを０．
５μＬの計２５μＬを滅菌済みスマートサイクラーチュ
ーブに加え、スマートサイクラーにて、まず９５℃／３
０秒で反応させ、その後６６℃／１時間にて反応させる
ことにより、自己集合体を形成させた。

【０１３５】ｄ）融解曲線解析 自己集合体を形成させた後、続いてスマートサイクラー
にて融解曲線解析を行なった。融解曲線解析は、６０℃
〜９５℃で０．２℃／１秒ごとに解析を行なった。実施
例１〜４及び比較例１については、測定された融解曲線
の微分解析も行った。自己集合体及びターゲット遺伝子
の検出の判定は、自己集合体の形成されない対照として
用いた比較例に対して、５℃以上のＴｍ値が測定された
場合を自己集合体が形成されたものとみなし、＋判定と
し、それに満たない場合を自己集合体未形成とみなし、
−判定とした。

【０１３６】４．結果 実施例５の結果を図３０に、比較例１の結果を図３１に
それぞれ示す。実施例５及び比較例１の融解曲線解析に
おいて測定されたＴｍ値及び自己集合体検出の判定を表
１に示す。図３０及び図３１に示すように、プローブが
切断されているため、自己集合体を形成しない比較例１
（図３１）と、自己集合体を形成する実施例５（図３
０）では、明らかに異なる融解曲線及びＴｍ値が測定さ
れた。融解曲線解析により、自己集合体の検出が可能で
あることが示された。

【０１３７】

【表１】

【０１３８】実施例１〜４及び比較例１の結果を図２９
及び表２に示す。図２９（ａ）及び表２に示したよう
に、融解曲線解析により１００ｐｍｏｌ（実施例１）、
５０ｐｍｏｌ（実施例２）のターゲット遺伝子を検出し
た。自己集合体形成反応を用いた検出において、融解曲
線を解析をすることにより、ターゲット遺伝子の検出が
可能であることがわかった。また、その検出カーブは、
ターゲット遺伝子の濃度に対応して形成される自己集合
体濃度に依存しており、融解曲線解析により、ターゲッ
ト遺伝子の定量分析が可能である。微分解析においても
同様な結果となった（図２９（ｂ））。

【０１３９】

【表２】

【０１４０】（実施例６〜１９及び比較例２〜４） １．目的 ２組の一対のＨＣＰを用いて、融解曲線解析により、タ
ーゲット遺伝子の検出を行った。

【０１４１】２．材料 １）実施例１〜４において用いたターゲット遺伝子１、
２に加え、ＭＲＳＡのＰＢＰgene由来、８０塩基の合成
オリゴヌクレオチドＭＲＳＡ−Ｔ３（ターゲット遺伝子
−３）及びＭＲＳＡ−Ｔ４（ターゲット遺伝子−４）を
ターゲット遺伝子として用いた。ＭＲＳＡ−Ｔ３とＭＲ
ＳＡ−Ｔ４は相補的である。各ターゲット遺伝子はそれ
ぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例６、１０及び１
４）、５０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例７、１１及び１
５）、１０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例８、１２及び１
６）、及び１ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例９、１３及び１
７）に調整した。

【０１４２】２）ターゲット遺伝子−１及び２にそれぞ
れ相補的な塩基配列をもつ一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−７及
びＨＣＰ−８）を作製し、それぞれ各ＨＣＰのターゲッ
ト遺伝子と相補的領域を１箇所切断したプローブ（ＨＣ
Ｐ−９及びＨＣＰ−１０、ＨＣＰ−１１及びＨＣＰ−１
２）を検出プローブとして用いた。同様に、ターゲット
遺伝子−３及び４にそれぞれ相補的な塩基配列をもつ一
対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１３及びＨＣＰ−１４）を作製
し、それぞれ各ＨＣＰのターゲット遺伝子と相補的領域
を１箇所切断したプローブ（ＨＣＰ−１５及びＨＣＰ−
１６、ＨＣＰ−１７及びＨＣＰ−１８）を検出プローブ
として用いた。各ＨＣＰはそれぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕ
Ｌに調整した。

【０１４３】３．方法 ａ）反応液の調製 実施例６〜９では、０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチュ
ーブに、ターゲット遺伝子−１〜４を各１μＬ、ＨＣＰ
−９〜１２及び１５〜１８を各１μＬ、TscDNAligase t
hermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×Incubation
bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの反応
溶液とした。この反応系をＡとした。また、反応系Ａに
おいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏを加えた反
応溶液を調製した（比較例２）。

【０１４４】実施例１０〜１３では、０．２ｍＬの滅菌
済みマイクロチューブに、ターゲット遺伝子−１〜４を
各１μＬ、ＨＣＰ−９〜１２を各２μＬ、TscDNAligase
thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、１０×Incubat
ion bufferを２μＬ加え、Ｈ ₂Ｏを加えて計２０μＬの
反応溶液とした。この反応系をＢとした。また、反応系
Ｂにおいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏを加え
た反応溶液を調製した（比較例３）。

【０１４５】実施例１４〜１７では、０．２ｍＬの滅菌
済みマイクロチューブに、ターゲット遺伝子−１〜４を
各１μＬ、ＨＣＰ−９〜１２を各１μＬ、TscDNAligase
thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、１０×Incubat
ion bufferを２μＬ加え、Ｈ ₂Ｏを加えて計２０μＬの
反応溶液とした。この反応系をＣとした。また、反応系
Ｃにおいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏを加え
た反応溶液を調製した（比較例４）。

【０１４６】実施例１８では、０．２ｍＬの滅菌済みマ
イクロチューブに、ＨＣＰ−７及び８を各１μＬ、TscD
NAligase thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、１０
×Incubation bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２
０μＬの反応溶液とした。

【０１４７】実施例１９では、０．２ｍＬの滅菌済みマ
イクロチューブに、ＨＣＰ−１３及び１４を各１μＬ、
TscDNAligase thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、
１０×Incubation bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて
計２０μＬの反応溶液とした。

【０１４８】ｂ）ライゲーション反応 実施例１〜５と同様の手順及び条件にてライゲーション
反応を行った。

【０１４９】ｃ）自己集合体形成反応 実施例１〜５と同様の手順及び条件にて自己集合体形成
反応を行った。

【０１５０】ｄ）融解曲線解析 実施例１〜４と同様の手順及び条件にて融解曲線解析を
行った。

【０１５１】４．結果 実施例６、１０、１４、１８、１９及び比較例３の結果
を図３２及び表３に示す。実施例７〜９及び比較例２の
結果を図３３及び表４に示す。実施例１１〜１３及び比
較例３の結果を図３４及び表５に示す。実施例１５〜１
７及び比較例４の結果を図３５及び表６に示す。図３２
に示したように、実施例１８及び１９の２種のＨＣＰは
それぞれ、ともに自己集合体の形成が融解曲線解析によ
り、確認された［（１）（２）］。図３２に示したよう
に、Ａ、Ｂ、Ｃの系ともに、１００ｐｍｏｌのターゲッ
ト遺伝子は検出した［（３）〜（５）］。さらに２種の
検出プローブを用いたＡの系では、５０ｐｍｏｌのター
ゲット遺伝子を検出した（図３３（１））。Ａの系で
は、２種の検出プローブを設定することにより、検出感
度が向上した。

【０１５２】

【表３】

【０１５３】

【表４】

【０１５４】

【表５】

【０１５５】

【表６】

【０１５６】（実施例２０〜２３） １．目的 １組のダイマープローブと一対の架橋プローブより形成
される自己集合体を、融解曲線解析を用いて検出した。

【０１５７】２．材料 一対のダイマー形成用プローブ（ダイマープローブ−１
及びダイマープローブ−２）とダイマー形成用プローブ
に架橋する一対の架橋プローブ（架橋プローブ−１及び
架橋プローブ−２）を作製した。ダイマープローブ１及
び２は、それぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例２
０）、５０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例２１）、１０ｐｍｏ
ｌ／ｕＬ（実施例２２）及び１ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例
２３）の濃度に調製した。架橋プローブ−１及び２は、
それぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕＬに調製したものを用い
た。

【０１５８】３．方法 ａ）反応液の調製 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、ダイマープ
ローブ１及び２を各１μＬ、２０×ＳＳＣを１５μＬ、
Ｈ₂Ｏを２μＬ加えて計２１μＬの反応溶液を調製し
た。

【０１５９】ｂ）ダイマー形成反応 ダイマー形成のため、９５℃／３０秒→５０℃／６０分
反応させた。

【０１６０】ｃ）自己集合体形成反応 上記ダイマー反応溶液２１μＬ、架橋プローブ−１及び
架橋プローブ−２を各１μＬ、１０００倍希釈したＳＹ
ＢＲ^TMＧｒｅｅｎＩ（FMC BioProducts社製）を２μ
Ｌ、計２５μＬを滅菌済みスマートサイクラーチューブ
に加え、スマートサイクラーにて６４℃／８０分間にて
反応させることにより自己集合体を形成させた。

【０１６１】ｄ）融解曲線解析 実施例１〜４と同様の手順及び条件にて融解曲線解析を
行った。

【０１６２】４．結果 実施例２０〜２３の結果を図３６及び表７に示す。図３
６に示したように、ダイマー形成用プローブの濃度依存
的に、融解曲線及びＴｍ値が変化しており、融解曲線の
解析による自己集合体の検出及び定量分析が可能なこと
が示された。

【０１６３】

【表７】

【０１６４】（実施例２４〜２７及び比較例５） １．目的 １組のダイマープローブと一対の架橋プローブの自己集
合体形成反応による検出として、ライゲ−ション反応に
よりダイマープローブを作製、ブリッジプローブにより
自己集合体を形成した後、融解曲線解析によりターゲッ
ト遺伝子の検出を行った。

【０１６５】２．材料 １）実施例１〜４において用いたターゲット遺伝子−１
及び２をターゲット遺伝子として用いた。各ターゲット
遺伝子はそれぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例２
４）、５０ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施例２５）、１０ｐｍｏ
ｌ／ｕＬ（実施例２６）、及び１ｐｍｏｌ／ｕＬ（実施
例２７）に調整した。

【０１６６】２）ターゲット遺伝子−１及び２にそれぞ
れ相補的な塩基配列をもつ一対のダイマー形成用プロー
ブ（ダイマープローブ−１及びダイマープローブ−２）
を作製し、それぞれ各ダイマー形成用プローブのターゲ
ット遺伝子と相補的領域を１箇所切断したプローブ（ダ
イマープローブ−３及びダイマープローブ−４、ダイマ
ープローブ−５及びダイマープローブ−６）を用意し
た。架橋プローブとして、架橋プローブ−１及び架橋プ
ローブ−２を用いた。

【０１６７】３．方法 ａ）反応液の調製 実施例２４〜２７では、０．２ｍＬの滅菌済みマイクロ
チューブに、ターゲット遺伝子−１及び２を各１μＬ、
１００ｐｍｏｌ／ｕＬに調製したダイマープローブ３〜
６を各１μＬ、TscDNAligase thermostable（５Ｕ／μ
Ｌ）を１μＬ、１０×Incubation bufferを２μＬ加
え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの反応溶液を調製した。
対象としてターゲット遺伝子−１及び２の変わりにＨ₂
Ｏを加えたものを用意した（比較例５）。

【０１６８】ｂ）ライゲーション反応 上記反応液をサーマルサイクラー（パーキンエルマー社
製）で、９２℃／４分→６３℃／３分を１サイクル、９
２℃／２０秒→６３℃／２０秒を８０サイクル反応させ
ることによりライゲーション反応を行い、９９℃１０分
で酵素反応を停止させた。

【０１６９】ｃ）ダイマー形成反応 続いてダイマー形成のため、９４℃／３０秒→６４℃／
３０分反応させた。

【０１７０】ｄ）自己集合体形成反応 上記ダイマー反応溶液１０μＬ、それぞれ１００ｐｍｏ
ｌ／ｕＬに調製した架橋プローブ−１及び架橋プローブ
−２を各１μＬ、２０×ＳＳＣを１１μＬ、１０００倍
希釈したＳＹＢＲ^TMＧｒｅｅｎＩ（FMC BioProducts社
製）を２μＬ、計２５μＬを滅菌済みスマートサイクラ
ーチューブに加え、スマートサイクラーにて６４℃／１
時間にて反応させることにより自己集合体を形成させ
た。

【０１７１】ｅ）融解曲線解析 実施例１〜４と同様の手順及び条件にて融解曲線解析を
行った。

【０１７２】４．結果 実施例２４〜２７及び比較例５の結果を図３７及び表８
に示す。図３７に示したように、１００ｐｍｏｌ（実施
例２４）、５０ｐｍｏｌ（実施例２５）のターゲット遺
伝子は検出した。この検出システムはダイマープローブ
及び架橋プローブの自己集合体形成反応においても融解
曲線によるターゲット遺伝子の検出が可能であることが
わかった。

【０１７３】

【表８】

【０１７４】（実施例２８、比較例６及び７） １．目的 ダイマープローブ及び架橋プローブによる自己集合体形
成反応による融解曲線解析を用いたターゲット遺伝子の
検出において、ターゲット遺伝子以外のＤＮＡの影響を
検討した。

【０１７５】２．材料 １）実施例２８ではターゲット遺伝子として、実施例１
〜４で用いたターゲット遺伝子−１及び２を用いた。比
較例６では、対象としてＭＲＳＡ以外のＤＮＡとしてＨ
ＣＶ由来の合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ、ＨＣＶ−１
（非ターゲット遺伝子−１）、ＨＣＶ−２（非ターゲッ
ト遺伝子−２）を用意した。ターゲット遺伝子−１、２
及び非ターゲット遺伝子−１、２は、それぞれ１００ｐ
ｍｏｌ／ｕＬに調製して用いた。

【０１７６】２）ダイマープローブ及び架橋プローブ
は、実施例２４〜２７において用いたダイマープローブ
−３〜６及び架橋プローブ−１、２を用いた。

【０１７７】３．方法 ａ）反応液の調製 ０．２ｍＬの滅菌済みマイクロチューブに、ターゲット
遺伝子−１及び２（実施例２８）、又は非ターゲット遺
伝子−１及び２（比較例６）を各１μＬ、ダイマープロ
ーブ−３〜６を各１μＬ、TscDNAligase thermostable
（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×Incubation bufferを２
μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの反応溶液とし
た。対照として、ターゲット遺伝子や非ターゲット遺伝
子の代わりにＨ₂Ｏを加えた反応溶液を作製した（比較
例７）。

【０１７８】ｂ）ライゲーション反応 実施例２４〜２７と同様の手順及び条件にてライゲーシ
ョン反応を行った。

【０１７９】ｃ）ダイマー形成反応 実施例２４〜２７と同様の手順及び条件にてダイマー形
成反応を行った。

【０１８０】ｄ）自己集合体形成反応 実施例２４〜２７と同様の手順及び条件にて自己集合体
形成反応を行った。

【０１８１】ｅ）融解曲線解析 実施例５と同様の手順及び条件にて融解曲線解析を行っ
た。

【０１８２】４．結果 実施例２８及び比較例７の結果を図３８及び表９に示
す。比較例６及び７の結果を図３９及び表１０に示す。
図３８及び図３９に示したように、融解曲線解析により
ターゲット遺伝子であるターゲット遺伝子−１及び２は
検出したが（図３８（１））、非ターゲット遺伝子−１
及び２は、比較例７と同様に検出されなかった（図３９
（１））。ダイマープローブ及び架橋プローブの自己集
合体形成反応によるこの検出システムは、ターゲット遺
伝子以外のＤＮＡの影響は受けないことがわかった。

【０１８３】

【表９】

【０１８４】

【表１０】

【０１８５】（実施例２９〜３７及び比較例８〜１０） １．目的 ２組の一対のダイマープローブ及び一対の架橋プローブ
を用いて、融解曲線解析により、ターゲット遺伝子の検
出を行った。

【０１８６】２．材料 １）ターゲット遺伝子として、ターゲット遺伝子−１〜
４を用いた。ターゲット遺伝子は、それぞれ５０ｐｍｏ
ｌ／ｕＬ（実施例２９、３２及び３５）、１０ｐｍｏｌ
／ｕＬ（実施例３０、３３及び３６）、１ｐｍｏｌ／ｕ
Ｌ（実施例３１、３４及び３７）に調製した。

【０１８７】２）１組目のダイマープローブとして、ダ
イマープローブ−３〜６を用いた。２組目のダイマープ
ローブとして、ターゲット遺伝子−３及び４にそれぞれ
相補的な塩基配列をもつ一対のダイマー形成用プローブ
（ダイマープローブ−７及び８）を作製し、各ダイマー
プローブのそれぞれターゲット遺伝子と相補的領域を１
箇所切断したプローブ（ダイマープローブ−９〜１２）
を用意した。架橋プローブとして、架橋プローブ−１及
び２を用いた。ダイマープローブ及び架橋プローブはそ
れぞれ１００ｐｍｏｌ／ｕＬに調製した。

【０１８８】３．方法 ａ）反応液の調製 実施例２９〜３１では、０．２ｍＬの滅菌済みマイクロ
チューブに、ターゲット遺伝子を各１μＬ、ダイマープ
ローブ−３〜６及び９〜１２を各１μＬ、TscDNAligase
thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、１０×Incubat
ion bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０μＬの
反応溶液とした。この反応系をＡとした。また、反応系
Ａにおいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏを加え
た反応溶液を調製した（比較例８）。

【０１８９】実施例３２〜３４では、０．２ｍＬの滅菌
済みマイクロチューブに、ターゲット遺伝子−１〜４を
各１μＬ、ダイマープローブ−３〜６を各２μＬ、TscD
NAligase thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×I
ncubation bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０
μＬの反応溶液とした。この反応系をＢとした。また、
反応系Ｂにおいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏ
を加えた反応溶液を調製した（比較例９）。

【０１９０】実施例３５〜３７では、０．２ｍＬの滅菌
済みマイクロチューブに、ターゲット遺伝子−１〜４を
各１μＬ、ダイマープローブ−３〜６を各１μＬ、TscD
NAligase thermostable（５Ｕ／μＬ）を１μＬ、10×I
ncubation bufferを２μＬ加え、Ｈ₂Ｏを加えて計２０
μＬの反応溶液とした。この反応系をＣとした。また、
反応系Ｃにおいて、ターゲット遺伝子の代わりにＨ₂Ｏ
を加えた反応溶液を調製した（比較例１０）。

【０１９１】ｂ）ライゲーション反応 上記反応液をサーマルサイクラー（パーキンエルマー社
製）で、９２℃／４分→６５℃／３分を１サイクル、９
２℃／２０秒→６５℃／２０秒を８０サイクル反応させ
ることによりライゲーション反応を行い、９９℃１０分
で酵素反応を停止させた。

【０１９２】ｃ）ダイマー形成反応 続いてダイマー形成のため、９４℃／３０秒→６５℃／
３０分反応させた。

【０１９３】ｄ）自己集合体形成反応 上記ダイマー反応溶液１０μＬ、架橋プローブ−１及び
２を各１μＬ、２０×ＳＳＣを１１μＬ、１０００倍希
釈したＳＹＢＲ^TMＧｒｅｅｎＩ（FMC BioProducts社
製）を２μＬ、計２５μＬを滅菌済みスマートサイクラ
ーチューブに加え、スマートサイクラーにて、６８℃／
１時間反応させて自己集合体を形成させた。

【０１９４】ｅ）融解曲線解析 実施例１〜４と同様の手順及び条件にて融解曲線解析を
行った。

【０１９５】４．結果 実施例２９〜３１及び比較例８の結果の結果を図４０及
び表１１に示す。実施例３２〜３４及び比較例９の結果
の結果を図４１及び表１２に示す。実施例３５〜３７及
び比較例１０の結果の結果を図４２及び表１３に示す。
図４０〜図４２に示したように、Ａ、Ｂ、Ｃの系とも
に、５０ｐｍｏｌ［各（１）］のターゲット遺伝子は検
出した。この検出において、Ａ、Ｂ、Ｃの反応系の差は
見られなかった。２組のダイマープローブ及び一対の架
橋プローブによる自己集合体形成反応においても融解曲
線による検出は可能であった。

【０１９６】

【表１１】

【０１９７】

【表１２】

【０１９８】

【表１３】

【０１９９】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明のオリゴヌクレ
オチドの自己集合体の検出方法により、アガロースゲル
電気泳動のような煩雑な操作を用いずに、低コストで簡
便かつ短時間に、オリゴヌクレオチドの自己集合により
形成された自己集合体を確認することができ、また、そ
れを利用した遺伝子の定量分析方法により、Ｂ／Ｆ分離
なしに低コストで簡便かつ短時間に標的遺伝子の検出及
び定量分析を行うことができる。

【０２００】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sanko Junyaku Co., Ltd. <120> Method For Detecting Self-Assembled Oligonucleotides And Method Fo r Gene Quantitative Analysis <130> 76205-P <160> 38 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target gene-1 <400> 1 aacatgaaaa atgattatgg ctcaggtact gctatccacc ctcaaacagg tgaattatta 60 gcacttgtaa gcacaccttc 80 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target gene-2 <400> 2 gaaggtgtgc ttacaagtgc taataattca cctgtttgag ggtggatagc agtacctgag 60 ccataatcat ttttcatgtt 80 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target gene-3 <400> 3 tagaccgaaa caatgtggaa ttggccaata caggaacaca tatgagatta ggcatcgttc 60 caaagaatgt atctaaaa 78 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: target gene-4 <400> 4 ttttagatac attctttgga acgatgccta atctcatatg tgttcctgta ttggccaatt 60 ccacattgtt tcggtcta 78 <210> 5 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-1 <400> 5 catatgtcgg acttagcgtc ctgctatcca ccctcaaaca gggattggta gaggcagatt 60 gg 62 <210> 6 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-2 <400> 6 gacgctaagt ccgacatatg cctgtttgag ggtggatagc agccaatctg cctctaccaa 60 tc 62 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-3 <400> 7 catatgtcgg acttagcgtc ctgctatcca c 31 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-4 <400> 8 cctcaaacag ggattggtag aggcagattg g 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-5 <400> 9 gacgctaagt ccgacatatg cctgtttgag g 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-6 <400> 10 gtggatagca gccaatctgc ctctaccaat c 31 <210> 11 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-7 <400> 11 catatgtcgg acttagcgtc gattatggct caggtactgc tatccaccct caaacaggtg 60 gtagtgtaga ggcagagttg 80 <210> 12 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-8 <400> 12 gacgctaagt ccgacatatg cacctgtttg agggtggata gcagtacctg agccataatc 60 caactctgcc tctacactac 80 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-9 <400> 13 catatgtcgg acttagcgtc gattatggct caggtactgc 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-10 <400> 14 tatccaccct caaacaggtg gtagtgtaga ggcagagttg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-11 <400> 15 gacgctaagt ccgacatatg cacctgtttg agggtggata 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-12 <400> 16 gcagtacctg agccataatc caactctgcc tctacactac 40 <210> 17 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-13 <400> 17 gtattcacgc agaaagcgtc ggccaataca ggaacacata tgagattagg catcgttccg 60 acgcttactg cgtgtatag 79 <210> 18 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-14 <400> 18 gacgctttct gcgtgaatac ggaacgatgc ctaatctcat atgtgttcct gtattggccc 60 tatacacgca gtaagcgtc 79 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-15 <400> 19 gtattcacgc agaaagcgtc ggccaataca ggaacacata 40 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-16 <400> 20 tgagattagg catcgttccg acgcttactg cgtgtatag 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-17 <400> 21 gacgctttct gcgtgaatac ggaacgatgc ctaatctca 39 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: HCP-18 <400> 22 tatgtgttcc tgtattggcc ctatacacgc agtaagcgtc 40 <210> 23 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-1 <400> 23 gtgctgactt aaccggatac gattatggct caggtactgc tatccaccct caaacaggtg 60 gattggtact gcgagatagg 80 <210> 24 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-2 <400> 24 gacgctttct gcgtgtatag cacctgtttg agggtggata gcagtacctg agccataatc 60 ctagaacgga tcgtacttcg 80 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-3 <400> 25 gtgctgactt aaccggatac gattatggct caggtactgc 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-4 <400> 26 tatccaccct caaacaggtg gattggtact gcgagatagg 40 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-5 <400> 27 gacgctttct gcgtgtatag cacctgtttg agggtggata 40 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-6 <400> 28 gcagtacctg agccataatc ctagaacgga tcgtacttcg 40 <210> 29 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-7 <400> 29 gtgctgactt aaccggatac ggccaataca ggaacacata tgagattagg catcgttccg 60 attggtactg cgagatagg 79 <210> 30 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-8 <400> 30 gacgctttct gcgtgtatag ggaacgatgc ctaatctcat atgtgttcct gtattggccc 60 tagaacggat cgtacttcg 79 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-9 <400> 31 gtgctgactt aaccggatac ggccaataca ggaacacata 40 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-10 <400> 32 tgagattagg catcgttccg attggtactg cgagatagg 40 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-11 <400> 33 gacgctttct gcgtgtatag ggaacgatgc ctaatctca 39 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at the 5' end <220> <223> Description of Artificial Sequence: dimmer probe-12 <400> 34 tatgtgttcc tgtattggcc ctagaacgga tcgtacttcg 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: bridge probe-1 <400> 35 ctatacacgc agaaagcgtc cgaagtacga tccgttctag 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: bridge probe-2 <400> 36 gtatccggtt aagtcagcac cctatctcgc agtaccaatc 40 <210> 37 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: untargeted gene-1 <400> 37 ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc tgatagagtg cttgcgagtg ccccgggagg 60 tc 62 <210> 38 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: untargeted gene-2 <400> 38 ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc ttatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg 60 tc 62

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第１の態様のｎ＝３の一例を示す模式図であり、
（ａ）は一対のＨＣＰ、（ｂ）はＨＣＰの結合態様の一
例、（ｃ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図２】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第１の態様のｎ＝４の例を示す模式図である。

【図３】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第１の態様のｎ＝４の例を示す模式図である。

【図４】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第１の態様における相補的な領域がｎ箇所から構
成される一対のＨＣＰの例を示す模式図である。

【図５】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第１の態様のｎ＝３の別の例を示す模式図であ
り、（ａ）（ｂ）はそれぞれ相補的領域が１箇所異なる
一対のＨＣＰ、（ｃ）は上記ＨＣＰより形成されるダイ
マー、（ｄ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図６】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第２の態様の一例を示す模式図であり、（ａ）は
第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の
系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

【図７】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第２の態様の一例を示す模式図であり、（ａ）は
一対のダイマープローブより形成されるダイマー及び一
対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞ
れ示す。

【図８】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第２の態様及び第３の態様における架橋プローブ
の１例を示す模式図であり、（ａ）は第２の態様におけ
る一対の架橋プローブ、（ｂ）は第３の態様における一
対の架橋プローブをそれぞれ示す。

【図９】 本発明において検出される自己集合体の形成
方法の第３の態様の１例を示す模式図であり、（ａ）は
第１の系の一対のオリゴヌクレオチド、（ｂ）は第２の
系の一対のオリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

【図１０】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第３の態様の例を示す模式図であり、（ａ）は
一対のダイマープローブより形成されるダイマー及び一
対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞ
れ示す。

【図１１】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第４の態様のｎ＝２の例を示す模式図であり、
（ａ）は第１の系の一対のオリゴヌクレオチド及び形成
されるダイマー、（ｂ）は第２の系の一対のオリゴヌク
レオチド、（ｃ）は第３の系の一対のオリゴヌクレオチ
ド及び形成されるダイマー、（ｄ）は第４の系の一対の
オリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

【図１２】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第４の態様のｎ＝２の例を示す模式図であり、
（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマープローブよ
り形成されるダイマー及び第２及び第４の系の一対の架
橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示
す。

【図１３】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第４の態様のｎ＝４の例を示す模式図であり、
（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマ
ープローブより形成されるダイマー及び第２、第４、第
６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集
合体の形成をそれぞれ示す。

【図１４】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第５の態様のｎ＝２の例を示す模式図であり、
（ａ）は第１及び第３の系の一対のダイマープローブよ
り形成されるダイマー及び第２及び第４の系の一対の架
橋プローブ、（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示
す。

【図１５】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第５の態様のｎ＝４の例を示す模式図であり、
（ａ）は第１、第３、第５及び第７の系の一対のダイマ
ープローブより形成されるダイマー及び第２、第４、第
６及び第８の系の一対の架橋プローブ、（ｂ）は自己集
合体の形成をそれぞれ示す。

【図１６】 本発明において検出される自己集合体の形
成方法の第２の態様の別の例を示す模式図であり、
（ａ）は一対のダイマープローブより形成されるダイマ
ー及びフリーサイト領域を有する一対の架橋プローブ、
（ｂ）は自己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図１７】 ＨＣＰより形成される自己集合体における
スタッキング効果による自己集合体の形成の安定化の原
理を示す模式図であり、（ａ）はハイブリダイゼーショ
ンの安定化、（ｂ）は自己集合体の安定化をそれぞれ示
す。

【図１８】 ダイマープローブ及び架橋プローブより形
成される自己集合体におけるスタッキング効果による自
己集合体の形成の安定化の原理を示す模式図であり、
（ａ）はハイブリダイゼーションの安定化、（ｂ）は自
己集合体の安定化をそれぞれ示す。

【図１９】 本発明に係る融解曲線解析において測定さ
れる融解曲線を示す模式図である。

【図２０】 一対のＨＣＰによるターゲット遺伝子の検
出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット遺
伝子、（ｂ）はターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇
所切断された一対のＨＣＰ、（ｃ）はターゲット遺伝子
と切断されたＨＣＰのハイブリダイゼーション反応、
（ｄ）は切断されたＨＣＰのライゲーション反応をそれ
ぞれ示す。

【図２１】 一対のＨＣＰによるターゲット遺伝子の検
出を示す模式図であり、（ｅ）は連結された一対のＨＣ
Ｐ、（ｆ）は切断されたままのＨＣＰ、（ｇ）は連結さ
れたＨＣＰと切断されたＨＣＰのハイブリダイゼーショ
ン反応をそれぞれ示す。

【図２２】 一対のＨＣＰによるターゲット遺伝子の検
出を示す模式図であり、（ｈ）は連結された一対のＨＣ
Ｐの複数対、（ｉ）は自己集合体の形成をそれぞれ示
す。

【図２３】 相補的領域が１箇所異なる２組の一対のＨ
ＣＰによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であ
り、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）はそれ
ぞれターゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断され
た２組の一対のＨＣＰ、（ｃ）及び（ｄ）はターゲット
遺伝子と切断されたＨＣＰのハイブリダイゼーション反
応をそれぞれ示す。

【図２４】 相補的領域が１箇所異なる２組の一対のＨ
ＣＰによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であ
り、（ｅ）は連結された一対のＨＣＰ、（ｆ）は自己集
合体の形成をそれぞれ示す。

【図２５】 一対のダイマープローブと一対の架橋プロ
ーブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であ
り、（ａ）は二本鎖のターゲット遺伝子、（ｂ）はター
ゲット遺伝子と相補的な領域を１箇所切断された一対の
ダイマープローブ、（ｃ）はターゲット遺伝子と切断さ
れたダイマープローブのハイブリダイゼーション反応、
（ｄ）は切断されたダイマープローブのライゲーション
反応をそれぞれ示す。

【図２６】 一対のダイマープローブと一対の架橋プロ
ーブによるターゲット遺伝子の検出を示す模式図であ
り、（ｅ）は連結されたダイマープローブより形成され
るダイマー、（ｆ）は一対の架橋プローブ、（ｇ）は自
己集合体の形成をそれぞれ示す。

【図２７】 中央領域の異なる２組の一対のダイマープ
ローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の
検出を示す模式図であり、（ａ）は二本鎖のターゲット
遺伝子、（ｂ）及び（ｃ）はターゲット遺伝子と相補的
な領域を１箇所切断された一対のダイマープローブ、
（ｄ）及び（ｅ）はターゲット遺伝子と切断されたダイ
マープローブのハイブリダイゼーション反応をそれぞれ
示す。

【図２８】 中央領域の異なる２組の一対のダイマープ
ローブと一対の架橋プローブによるターゲット遺伝子の
検出を示す模式図であり、（ｆ）及び（ｇ）は連結され
たダイマープローブより形成されるダイマー、（ｈ）は
一対の架橋プローブ、（ｉ）は自己集合体の形成をそれ
ぞれ示す。

【図２９】 実施例１〜４及び比較例１の結果を示すグ
ラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）は融
解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図３０】 実施例５の結果を示すグラフである。

【図３１】 比較例１の結果を示すグラフである。

【図３２】 実施例６、１０、１４、１８、１９及び比
較例３の結果を示すグラフであり、（ａ）は通常の融解
曲線解析、（ｂ）は融解曲線の微分解析をそれぞれ示
す。

【図３３】 実施例７〜９及び比較例２の結果を示すグ
ラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）は融
解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図３４】 実施例１１〜１３及び比較例３の結果を示
すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）
は微分解析をそれぞれ示す。

【図３５】 実施例１５〜１７及び比較例４の結果を示
すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）
は融解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図３６】 実施例２０〜２３の結果を示すグラフであ
り、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）は融解曲線の
微分解析をそれぞれ示す。

【図３７】 実施例２４〜２７及び比較例５の結果を示
すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）
は融解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図３８】 実施例２８及び比較例７の結果を示すグラ
フである。

【図３９】 実比較例６及び７の結果を示すグラフであ
る。

【図４０】 実施例２９〜３１及び比較例８の結果を示
すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）
は融解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図４１】 実施例３２〜３４及び比較例９の結果を示
すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、（ｂ）
は融解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

【図４２】 実施例３５〜３７及び比較例１０の結果を
示すグラフであり、（ａ）は通常の融解曲線解析、
（ｂ）は融解曲線の微分解析をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 波木井 千雅子 千葉県柏市あけぼの４−３−27 ハイム・ デンマー502 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 CA10 HA19 4B063 QA13 QQ44 QR32 QR55 QS34 QX02

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オリゴヌクレオチドの自己集合反応によ
   り形成された自己集合体を、該自己集合体の融解曲線を
   解析することにより、検出することを特徴とするオリゴ
   ヌクレオチド自己集合体の検出方法。
2. 【請求項２】 前記自己集合体が、お互いに相補的な塩
   基配列領域がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対
   のプローブの複数対を用いて、互い違いに交差するよう
   にハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌ
   クレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成さ
   せる自己集合体の形成方法を用いて形成された自己集合
   体であることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレ
   オチド自己集合体の検出方法。
3. 【請求項３】 前記一対のプローブの構成は、１対１で
   ハイブリダイゼーションする時に必ずｎ（ｎ≧３）カ所
   の相補的な部分の中で、１カ所ずつが特異的にハイブリ
   ダイゼーションするように構成されることを特徴とする
   請求項２記載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方
   法。
4. 【請求項４】 前記一対のプローブの複数対の構成が、
   該塩基配列領域が少なくとも１カ所異なるｍ（ｍ≧２）
   種の一対のプローブからなることを特徴とする請求項２
   又は３記載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方
   法。
5. 【請求項５】 前記自己集合体が、Ｎｏ．１及びＮｏ．
   ２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチド
   を３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域
   に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補
   的な塩基配列としてダイマープローブを形成するととも
   に、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基
   配列とした複数のダイマープローブを含む第１の系と、
   Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各
   オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つ
   の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び
   ５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
   架橋プローブを含む第２の系とを有し、 第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
   と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領
   域、 第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
   と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領
   域、 第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域
   と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領
   域、 第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域
   と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領
   域、をそれぞれ相補的な塩基配列とし、第１の系のダイ
   マープローブに対して、第２の系の架橋プローブが架橋
   するようにハイブリダイゼーションさせることにより、
   オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体
   を形成させる自己集合体の形成方法を用いて形成された
   自己集合体であることを特徴とする請求項１記載のオリ
   ゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
6. 【請求項６】 前記自己集合体が、Ｎｏ．１及びＮｏ．
   ２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチド
   を３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域
   に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補
   的な塩基配列としてダイマープローブを形成するととも
   に、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基
   配列とした複数のダイマープローブを含む第１の系と、
   Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各
   オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つ
   の領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び
   ５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対の
   架橋プローブを含む第２の系とを有し、 第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域
   と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領
   域、 第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域
   と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領
   域、 第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域
   と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領
   域、 第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域
   と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領
   域、をそれぞれ相補的な塩基配列とし、第１の系のダイ
   マープローブに対して、第２の系の架橋プローブが架橋
   するようにハイブリダイゼーションさせることにより、
   オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体
   を形成させる自己集合体の形成方法を用いて形成された
   自己集合体であることを特徴とする請求項１記載のオリ
   ゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
7. 【請求項７】 Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴ
   ヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中
   央領域及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌ
   クレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列として
   ダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び
   ５’側領域を互いに非相補的な塩基配列としたそれぞれ
   複数のダイマープローブをそれぞれ含む第１番目の系か
   ら第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上の整数）の系まで順
   番に複数個形成されたダイマープローブ含有系と、 Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの
   各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２
   つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及
   び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対
   の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ
   番目の系まで順番に複数個形成された架橋プローブ含有
   系とを有し、 第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、 第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−
   オリゴヌクレオチドの５’側領域、 第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、 第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの５’側領域、 ダイマープローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
   オチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．
   １−オリゴヌクレオチドの３’側領域、 ダイマープローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
   オチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．
   ２−オリゴヌクレオチドの５’側領域、 架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
   レオチドの３’側領域、 架橋プローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列と
   し、第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにお
   ける複数のダイマープローブに対して、第２番目の系か
   ら第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが
   架橋するようにハイブリダイゼーションさせることによ
   り、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集
   合体を形成させる自己集合体の形成方法を用いて形成さ
   れた自己集合体であることを特徴とする請求項１記載の
   オリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
8. 【請求項８】 前記自己集合体が、Ｎｏ．１及びＮｏ．
   ２の各一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチ
   ドを３’側領域、中央領域及び５’側領域の３つの領域
   に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補
   的な塩基配列としてダイマープローブを形成するととも
   に、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基
   配列としたそれぞれ複数のダイマープローブをそれぞれ
   含む第１番目の系から第（２ｎ−１）番目（ｎは２以上
   の整数）の系まで順番に複数個形成されたダイマープロ
   ーブ含有系と、 Ｎｏ．１及びＮｏ．２の各一対のオリゴヌクレオチドの
   各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２
   つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及
   び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした複数対
   の架橋プローブをそれぞれ含む第２番目の系から第２ｎ
   番目の系までの順番に複数個形成された架橋プローブ含
   有系とを有し、 第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、 第（２ｎ−３）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−
   オリゴヌクレオチドの５’側領域、 第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．２−
   オリゴヌクレオチドの３’側領域、 第（２ｎ−２）番目の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第（２ｎ−１）番目の系のＮｏ．１−
   オリゴヌクレオチドの５’側領域、 ダイマープローブの最後の系のＮｏ．１−オリゴヌクレ
   オチドの３’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．
   １−オリゴヌクレオチドの３’側領域、 ダイマープローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレ
   オチドの５’側領域と架橋プローブの最後の系のＮｏ．
   １−オリゴヌクレオチドの５’側領域、 架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの３’側領域と第１番目の系のＮｏ．２−オリゴヌク
   レオチドの３’側領域、 架橋プローブの最後の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチ
   ドの５’側領域と第１番目の系のＮｏ．１−オリゴヌク
   レオチドの５’側領域、をそれぞれ相補的な塩基配列と
   し、第１番目の系から第（２ｎ−１）番目の系までにお
   ける複数のダイマープローブに対して、第２番目の系か
   ら第２ｎ番目の系までにおける複数対の架橋プローブが
   架橋するようにハイブリダイゼーションさせることによ
   り、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集
   合体を形成させる自己集合体の形成方法を用いて形成さ
   れた自己集合体であることを特徴とする請求項１記載の
   オリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
9. 【請求項９】 前記複数のダイマープローブが、前記中
   央領域の異なるｍ（ｍ≧２）種のダイマープローブから
   なることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項記載
   のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
10. 【請求項１０】 前記架橋プローブが、３’側領域と
    ５’側領域の中央部にダイマープローブと架橋プローブ
    の各領域の塩基配列とは非相補的な領域を有することを
    特徴とする請求項５〜９のいずれか１項記載のオリゴヌ
    クレオチド自己集合体の検出方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のフリーサイト領域
    が、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ，ＬＮＡ及びオリゴヌクレ
    オチドと結合できるペプチド、自己集合体性粒子、磁性
    体粒子、またはその他の化合物であることを特徴とする
    請求項１０記載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出
    方法。
12. 【請求項１２】 前記自己集合体が、Ｎｏ．１及びＮ
    ｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオ
    チドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの
    領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに
    相補的な塩基配列とし、３’側領域、及び５’側領域を
    互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマープロー
    ブを含む系を第１の系及び第２の系まで形成し、 第１の系の各オリゴヌクレオチドの３’側領域が、第２
    の系の各オリゴヌクレオチドの３’側領域のいずれか一
    方とそれぞれ相補的な塩基配列であり、且つ、 第１の系の各オリゴヌクレオチドの５’側領域が、第２
    の系の各オリゴヌクレオチドの５’側領域のいずれか一
    方とそれぞれ相補的な塩基配列であるようにし、 第１の系及び第２の系までの複数対のダイマープローブ
    をハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌ
    クレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成さ
    せる自己集合体の形成方法を用いて形成された自己集合
    体であることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレ
    オチド自己集合体の検出方法。
13. 【請求項１３】 前記自己集合体を、核酸と結合する性
    質を有する蛍光物質を添加させ、蛍光を用いて自己集合
    体の融解曲線を解析することにより、自己集合体を検出
    することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記
    載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
14. 【請求項１４】 前記自己集合体を、自己集合体の紫外
    線に対する光化学的な吸収の変化を利用して、自己集合
    体の融解曲線を解析することにより、自己集合体を検出
    することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記
    載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
15. 【請求項１５】 前記プローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｐ
    ＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成
    されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項
    記載のオリゴヌクレオチド自己集合体の検出方法。
16. 【請求項１６】 前記プローブの相補的塩基配列領域の
    分岐点に、少なくとも１つのＧ（グアニン）またはＣ
    （シトシン）を配置させ、プローブがハイブリダイズし
    た際に少なくとも１つのＣ−Ｇ結合を相補的塩基配列領
    域の端部に形成させることを特徴とする請求項１〜１５
    のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド自己集合体の
    検出方法。
17. 【請求項１７】 自己集合体を形成するプローブを、タ
    ーゲット遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するオリ
    ゴヌクレオチドを含むように構成し、該プローブのター
    ゲット遺伝子と相補的な領域を少なくとも１箇所予め切
    断しておき、温度制御により、ハイブリダイゼーション
    反応、ライゲーション反応及び解離反応をさせ、該切断
    されたプローブを連結させて完全なプローブを形成さ
    せ、自己集合体を形成させ、該自己集合体の融解曲線を
    解析することにより、ターゲット遺伝子の量を測定する
    ことを特徴とする遺伝子の定量分析方法。
18. 【請求項１８】 前記プローブとしてＨＣＰを用い、該
    ＨＣＰのうち、いずれか一方のプローブの一つ以上の相
    補的な領域を、ターゲット遺伝子の一部と相補的な塩基
    配列を有する領域となるように構成し、該ＨＣＰのター
    ゲット遺伝子に相補的な領域の片側、または両側の一箇
    所、または複数箇所をあらかじめ切断しておくことを特
    徴とする請求項１７記載の遺伝子の定量分析方法。
19. 【請求項１９】 前記プローブとしてダイマープローブ
    のみ又はダイマープローブ及び架橋プローブを用いるこ
    とを特徴とする請求項１７記載の遺伝子の定量分析方
    法。
20. 【請求項２０】 前記ターゲット遺伝子の一部と相補的
    な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、前記ダイマ
    ープローブであることを特徴とする請求項１９記載の遺
    伝子の定量分析方法。
21. 【請求項２１】 前記ダイマープローブのオリゴヌクレ
    オチドのうち、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドの
    中央領域を、ターゲット遺伝子と相補的な塩基配列を有
    する領域となるように構成し、ターゲット遺伝子と相補
    的なダイマープローブの各オリゴヌクレオチドの中央領
    域の片側、または両側の一箇所、または複数箇所をあら
    かじめ切断しておくことを特徴とする請求項２０記載の
    遺伝子の定量分析方法。
22. 【請求項２２】 前記ターゲット遺伝子の一部と相補的
    な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、前記架橋プ
    ローブであることを特徴とする請求項１９記載の遺伝子
    の定量分析方法。
23. 【請求項２３】 前記ライゲーション反応をリガーゼ酵
    素、耐熱性のリガーゼ酵素、又は酵素を使用しないオー
    トライゲーションを用いて行うことを特徴とする請求項
    １７〜２２のいずれか１項記載の遺伝子の定量分析方
    法。
24. 【請求項２４】 前記ターゲット遺伝子に一本鎖のＤＮ
    Ａ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項
    １７〜２３のいずれか１項記載の遺伝子の定量分析方
    法。
25. 【請求項２５】 前記ターゲット遺伝子に二本鎖のＤＮ
    Ａ及び／またはＲＮＡを用いることを特徴とする請求項
    １７〜２３のいずれか１項記載の遺伝子の定量分析方
    法。
26. 【請求項２６】 前記あらかじめ切断されたオリゴヌク
    レオチドの切断部分がＳＮＰｓ（一塩基多形）の部分と
    相補的になるようにデザインされることを特徴とする請
    求項１７〜２５のいずれか１項記載の遺伝子の定量分析
    方法。