KR102309189B1 - 핵산 검출용 다가 핵산 나노구조체 및 이를 이용한 고감도 핵산 탐침 - Google Patents

핵산 검출용 다가 핵산 나노구조체 및 이를 이용한 고감도 핵산 탐침 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 바이오마커의 탐지 효율을 높이기 위한 핵산 프로브 시스템으로서, 단일가닥 기반의 프로브 서열을 핵산 나노구조체에 집약시키는 방법을 통해 바이오마커에 대한 탐지 효율 및 검출 감도를 개선한 발명이며, 이를 위해 개발한 본 발명의 핵산 나노구조체는 프로브 서열의 국지적 집약을 통해 단순 확산에 따른 분자 간 충돌/반응 단계의 일부를 구조체 내부의 빠른 반응으로 전환시키고, 구조적 유연성을 통한 구조체 내 빠른 신호증폭 기전을 활성화시킴으로써 검출 능력을 증진시킴으로써 검출 능력을 증진시키고 검출 한계를 효과적으로 낮출 수 있는 효과가 있다.

Description

핵산 검출용 다가 핵산 나노구조체 및 이를 이용한 고감도 핵산 탐침 {Multivalent Nucleic Acid Nanostructure for Nucleic Acids Detection and High-sensitive Nucleic Acid Probing Using The Same}
본 발명은 핵산 바이오마커의 탐지 효율을 높이기 위한 핵산 프로브 시스템에 관한 것으로, 구체적으로, 단일가닥 기반의 프로브 서열을 핵산 나노구조체에 집약시키는 방법을 통해 바이오마커에 대한 탐지 효율 및 검출 감도를 개선한 발명이다.
특정한 핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질을 검출하는 방법은 과학연구 분야에서 기본적으로 중요한 기술이다. 특정한 핵산 또는 단백질을 검출하고 동정할 수 있게 됨으로써, 연구자들은 어떤 유전적, 생물학적 표지가 사람의 건강상태를 나타내는 지표가 되는지를 판정할 수 있게 되었다. 이러한 핵산과 단백질을 검출하는 방법을 이용하면 시료에 존재하는 병원체 유전자의 변형, 또는 특정 유전자의 발현 등을 발견할 수 있다. 이와 같은 분자 진단은 DNA 또는 RNA 등 질병의 근본을 진단하는 것으로 감염질환, 암 진단, 유전질환 및 맞춤 진단 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 대표적인 분자진단 기술로는 단시간 내에 DNA를 증폭시키는 PCR 기술이 있다 (Saiki, R., et. al., Science 239: 487-91., 1998). 그러나, 일반적인 PCR 기술은 증폭된 DNA를 확인하기 위해서 전기영동 방법을 사용하여야 한다. 이러한 전기영동을 수행하기 위해서는 아가로즈 젤 (Agarose gel)을 만들고 DNA를 EtBr 등으로 염색하여 확인해야 하는 번거로움이 있어왔다. 또한, 최근에 사용되고 있는 real-time PCR 방법은 형광을 사용하기 때문에 전기영동이 불필요하나, 고가의 사용 기기와 고가의 형광시약을 사용해야 한다는 문제점이 있다(Higuchi, R., et. al., Nature Biotechnology 11:1026-1030, 1993). 최근에 현장 진단 개념의 PCR 제품인 Cepheid사의 GeneXprt system과 시약이 개발되어 판매되고 있으나, 장비와 시약이 매우 고가이므로 일반적인 검사에서 사용하는 데는 어려움이 있다(Helb, D., et. al., J. Clin. Microbiol. 48:229-237, 2010). 다른 방법으로, PCR 후에 젤 전기영동 대신에 멤브레인을 사용하여 확인하는 핵산 측면 흐름 어세이(Nucleic Acid Lateral Flow Assay)가 있다 (Aveyard, J., et. al., Chem. Commun., 41:4251-4253, 2007). 그러나, 젤 전기영동 기술에 비해 복잡하여 실험실에서 제조하여 사용하기는 불가능하며, 멤브레인에 부착된 프로브의 시퀀스는 PCR 증폭 산물에 따라서 특이적으로 결합할 수 있도록 사용하여야 하는 기술의 한계 때문에 범용으로 사용하는 데는 한계점이 있다. 특히, 이와 같은 PCR 기반의 염기서열분석법은 특정 오류에 극히 취약하고 데이터 해석과정에서 문제가 생겨 핵산 및 단백질 검출의 정확도 및 감도에 한계를 나타낸다.
임상적 진단 목적을 위해 세포나 조직 혹은 혈액으로부터 분리 및 정제된 핵산 바이오마커는 그 농도가 낮아 검출 과정에서의 신호증폭 과정이 불가피하다. 핵산 바이오센서에 적용되는 신호증폭 기법에는 HCR(Hybridization Chain Reaction); RCA(Rolling Circle Amplification)과 같은 대표적인 방법들이 제시되어 있으며, 이와 같은 기존의 증폭기법은 프로브의 타겟(target) 인식 이후 발생하는 신호를 증폭시키는 데 초점을 두고 있다. 하지만 이러한 기술을 적용한 바이오센서 또한 초기 단계에서 프로브가 타겟을 인식하고 뒤따르는 반응을 개시하는 과정을 필연적으로 포함하고 있고, 이 과정은 프로브와 타겟 분자의 확산 및 충돌의 지배를 받는다. 특히, 타겟 분자의 농도가 낮은 경우 이러한 충돌빈도가 매우 급격히 감소하게 되어 신호증폭 단계의 비 반응 혹은 노이즈를 일으키게 되는데 이 경우 뒤따르는 증폭과정에도 불구하고 타겟 검출의 효율이 저하되는 문제점이 있다.
예를 들어, HPA(Hybridization Protection Assay); SDA(Strand Displacement Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification); DKA(Dual kinetic Assay)와 같이 뛰어난 검출 효율을 보이는 프로브 시스템들이 기존 문헌을 통해 제시된 바 있으며, 이들은 주로 타겟(target) 인식에 따라 발생하는 신호증폭 효율을 높이는 것에 중점을 두고 개발되었다. 그러나 뛰어난 신호증폭 효율을 보이는 시스템이라고 할지라도 바이오마커의 농도가 매우 낮아지게 되면 타겟 검출 및 신호증폭을 위한 분자 간 충돌/반응빈도 또한 줄어들게 되고, 이로 인해 프로브 시스템의 반응성 및 검출 감도의 한계가 결정되는 문제가 있으며, 이에 대한 대응 전략은 제시된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 프로브 시스템 자체의 반응성과 바이오마커의 검출 감도의 한계를 근본적으로 개선하기 위해 예의 노력한 결과, 단일가닥 기반의 프로브 서열을 다가(multivalent)로 집약시킨 신규 핵산 나노구조체를 개발하였으며, 상기 나노구조체 형성으로 인한 프로브의 집적 및 나노구조체의 유연성을 기반으로 프로브 간의 충돌빈도가 증가하여 바이오마커에 대한 탐지 효율이 개선되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 타겟 핵산에 상보적인 프로브 쌍을 포함하는 핵산 나노구조체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 핵산 나노구조체를 포함하는 핵산 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 핵산 나노구조체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 핵산 나노구조체를 이용한 핵산 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 헤어핀 구조를 가지며, 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 프로브 쌍이 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 프로브-구조체 가닥을 각각 형성하고, 상기 각각의 프로브-구조체 가닥은 상기 구조체 핵산 사이의 상보적 결합에 의하여 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노 구조체를 제공한다.
본 발명은 상기 핵산 나노구조체를 포함하는 타겟 핵산 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산 검출용 조성물을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 핵산 나노구조체의 제조방법을 제공한다:
(a) 헤어핀 구조를 가지며, 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 프로브 쌍이 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 있는 프로브-구조체 가닥을 제작하는 단계; 및
(b) 상기 프로브-구조체 가닥을 서로 어닐링시켜, 핵산 나노구조체를 수득하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 핵산 나노구조체를 이용하여 타겟 핵산을 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 핵산 나노구조체는 프로브 서열을 국지적으로 집약시킨 구조를 통해 단순 확산에 따른 분자 간 충돌/반응 단계의 일부를 핵산 구조체 내부의 빠른 반응으로 전환시킬 수 있어, 구조적 유연성을 통한 핵산 구조체 내 신호증폭 기전을 빠르게 활성화시킴으로써 표적핵산에 대한 검출 능력을 증진시키고 검출 능력을 향상하여 표적핵산에 대한 최종 검출 한계를 효과적으로 낮출 수 있다.
도 1은 miR-21 증폭 검출 프로브 시스템의 반응과정 모식도 (a); DNA 나노구조체 집약 프로브 시스템의 반응과정 모식도 (b); 및 DNA 나노구조체 프로브 시스템들의 충돌빈도와 반응성 (c)을 나타낸다.
도 2는 H1 및 H2 모티프를 포함하는 DNA 나노구조체들의 합성 결과에 대한 전기영동 분석 결과를 나타낸다:
(a) D-DNA의 1x TBE 12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과;
(b) T-DNA의 1x TBE 5% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과;
(c) Y-DNA의 1x TBE 12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과; 및
(d) H-DNA의 1x TBE 5% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 결과.
도 3은 H1 및 H2 모티프의 농도 (100 nM)가 동일한, 분리 상태의 H1 및 H2, D-DNA, T-DNA 및 H-DNA의 다양한 농도의 miR-21에 대한 반응을 전기영동 분석 (a) 전기영동 분석; 모식도 (miR-21에 의한 분자 간 반응 및 분자 내 반응에 따른 구조 변화) (b); 반응 24 시간 후 miR-21 농도별 반응정도 (c); 및 반응 시간별 검출 한계 (d)로 나타낸 도이다:
(e) 분리 상태의 H1 및 H2의 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도;
(f) D-DNA의 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도;
(g) T-DNA의 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도;
(h) H-DNA의 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도;
α: DNA 나노구조체가 듀얼 어닐링에 의해 합성되어 H1 과 H2가 이중가닥을 형성하지 않은 상태; 및
β: 일반적 어닐링에 의해 H1과 H2가 이중가닥을 형성한 DNA 나노구조체 상태.
도 4는 miR-21에 의한 분자 내 반응에 따른 D-DNA, Y-DNA, 2-Arm T-DNA의 구조 변화를 결과를 나타낸 모식도 및 실시간 반응도 측정을 위한 형광 염료 및 소광제의 위치 정보 (a); 각 프로브 시스템의 다양한 miR-21 농도 조건에 대한 초기 반응 속도 (b); 각 프로브 시스템의 반응 시간별 검출 한계 (c); 및 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 D-DNA (d), Y-DNA (e) 및 2-Arm T-DNA (f)의 반응도를 나타낸 도이다.
도 5는 DNA 나노구조체의 형성과 구조체 내 염기 쌍 간 거리 분석을 위해 사용된 oxDNA 핵산 시뮬레이션 프로그램의 파라미터를 나타낸 도이다.
도 6은 D-DNA (a); T-DNA (b); 및 H-DNA(c)의 oxDNA 시뮬레이션 분석을 통한 분자 H1 및 H2 모티프 간의 거리를 나타낸 도이다.
도 7 D-DNA, T-DNA 및 H-DNA의 H1 및 H2 모티프 간의 거리가 특정 거리에 도달하는 횟수를 나타낸 도이다.
도 8은 스몰루초프스키 방정식에 의해 계산된 각 DNA 나노구조체의 H1 및 H2 모티프의 분자 간 반응의 충돌빈도와, oxDNA 시뮬레이션 분석을 통해 유추된 각 DNA 나노구조체 H1 및 H2 모티프의 분자 내 반응의 충돌빈도를 비교한 도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에서 핵산은 좌측에서 우측으로 5' -> 3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
본 발명에서는 표적핵산 검출을 위한 고감도 프로브 시스템을 개발하고자 하였으며, 단일가닥 기반의 프로브 서열을 다가(multivalent)로 포함하는 신규 핵산 나노구조체를 제작하고, 상기 핵산 나노구조체를 사용하여 표적핵산을 검출하는 경우, 나노구조체의 유연성을 기반으로 프로브 간의 충돌빈도가 증가하여 바이오마커에 대한 탐지 효율이 개선되는 것을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 헤어핀 구조를 가지며, 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 프로브 쌍이 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 프로브-구조체 가닥을 각각 형성하고, 상기 각각의 프로브-구조체 가닥은 상기 구조체 핵산 사이의 상보적 결합에 의하여 서로 혼성화되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노 구조체에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, "핵산 나노구조체"는 타겟 핵산에 상보적인 서열을 포함하는 프로브 쌍, 구조체 핵산, 형광단 및 소광제를 포함하는 구조체들을 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 다이머형(D형), Y형, 테트라머형(T형), 또는 헥사머형(H형)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 특정 서열을 포함하는 핵산(예, 바이오마커)과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 핵산의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서 프로브 쌍은 헤어핀 구조를 가지는 한 쌍의 단일가닥 프로브를 의미하며, 본 명세서에서 상기 각각의 프로브는 구분을 위해"제 1 프로브" 및 "제 2 프로브"로 명명되어 사용된다. 본 명세서의 일부에서, 설명의 편의를 위해 타겟 핵산과 특이적으로 결합한 프로브를 "제 1 프로브"로, 즉각적인 분자 내 반응으로 상기 제 1 프로브와 결합한 프로브를 "제 2 프로브"로 지칭하였으나, 명명 순서에 따라 서수를 달리하여 사용될 수 있다. 상기 "제 1" 및 "제 2"등 의 서수는 프로브 쌍을 구성하는 각 프로브를 구분하기 위해 명시한 것으로, 권리범위를 제한하는 것은 아니며, "구조체 핵산"을 구분하기 위해 동일한 방법으로 사용되었다.
본 발명에서 상기 프로브 쌍 중 어느 하나 이상이 상보적인 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로브쌍의 프로브는 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 즉각적인 프로브간의 반응을 위해, 일 프로브의 헤어핀 구조 외의 서열 일부가 다른 프로브의 서열 일부와 상보적인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 일 프로브의 헤어핀이 구조가 풀어졌을 때의 단일가닥으로 드러나는 서열의 일부가 다른 프로브의 서열 일부와 상보적인 것을 특징으로 할 수 있다 (도 1, 도 3).
본 발명의 용어 "구조체 핵산"이란 상기 프로브를 집약시켜, 다가의 핵산 나노 구조체를 형성을 유도하는 올리고핵산을 의미한다.
본 발명에서 상기 구조체 핵산은 일부에 서로 상보적인 서열을 포함하므로, 혼성화를 통해 핵산 나노구조체를 형성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 구조체 핵산이 3개 이상인 경우 각 구조체 핵산은 다른 1개 이상의 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여, 혼성화를 통해 핵산 나노 구조체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 상기 구조체 핵산은 그 자체로 사용될 수 있으며, 프로브에 연결되어 프로브-구조체 가닥 형태로 사용될 수 있다. 상기 구조체의 핵산은 2개 이상의 다른 구조체 핵산의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 그 조합에 따라 핵산 나노구조체의 형태를 달리할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1 내지 서열번호 9의 서열을 갖는 구조체 핵산이 사용되었으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
'프로브'와 '구조체 핵산'의 연결, 또는 '프로브 또는 구조체 핵산'과 '소광제(quencher) 또는 형광단(fluorophore)'의 연결의 문맥에서 사용된 본 발명의 용어 "연결"이란, 프로브, 구조체, 소광제 및 형광단 사이가 통상의 기술자에의해 인식될 수 있는 방법으로 결합되어 있음을 의미한다. 상기 '연결'은 예를 수소결합, 공유결합, 전기적 결합, 반데르발스 결합 등에 의해 직접적으로 결합된 것일 수 있으며, 링커 등에 의해 간접적으로 결합될 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 프로브와 구조체 핵산의 연결은 프로브의 5'말단과 구조체핵산의 3' 말단이 인산디에스테르결합으로 연결되었으며, 프로브 또는 구조체화 소광제 또는 형광단의 결합은 공유결합을 통해 연결되었으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "상보적"이란, 서로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들면, 왓슨-크릭 염기쌍 결합과 같이, DNA에 있어서 아데노신은 티민과 상보적이고, 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에서 개시되거나 또는 사용된 완전히 상보적인 서열뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열에의해 "상보적"인 서열도 포함한다
본 발명에서, "프로브" 및 "구조체 핵산"에서 사용된 "서로 상보적인 서열"은 각각 독립적 의미로 사용된다.
본 발명에서 상기 프로브 쌍을 구성하는 두 단일가닥 프로브 중 어느 하나의 프로브가 타겟 핵산과 결합하는 경우, 헤어핀 구조가 풀어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 타겟 핵산과 결합한 프로브의 헤어핀 구조가 풀어진 후, 즉각적인 분자 내 반응을 통해 상기 프로브 쌍을 구성하는 다른 프로브와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 타겟 핵산과 결합한 프로브가 즉각적인 분자 내 반응을 통해 상기 프로브 쌍을 구성하는 다른 프로브와 상보적으로 결합하는 경우, 상기 다른 프로브의 헤어핀 구조가 풀어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "즉각적인 분자 내 반응"이란, 상기 제 1 프로브 및 제2 프로브가 상보적인 서열에 의한 결합을 형성하고 이로 인해 일어날 수 있는 반응을 의미하며, 본 발명의 핵산 나노구조체의 형성으로 인해 개별적인 프로브 분자의 반응보다 현저히 높은 반응성을 나타낼 수 있다. 상기 반응은 각 구현예에 따라 도 1b, 도 3b 및 도 4a에 상세히 도시되어 있다.
본 발명에서, 상기 프로브 쌍을 구성하는 두 프로브가 상보적으로 결합하는 경우, 타겟 핵산이 분리되어, 다른 핵산 나노구조체와 반응할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 제 1 프로브 및 제 2 프로브의 결합으로 인해 타겟 핵산이 분리되더라도, 헤어핀 구조의 형성이 억제되어 지속적으로 선형 프로브의 형태를 유지하고, 검출 신호(예, 형광)를 발생시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 나노구조체는 하나의 구조체에 복수개(multivalent)의프로브 서열을 포함하고 있어, 표적핵산과 결합가능한 프로브가 공간적으로 집약되어 있으면서, 가지의 개수와 유연성은 높아 프로브 간의 접근성, 충돌 빈도가 올라가 표적핵산에 대한 감도가 높아지고 검출한계가 낮아지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 "타겟 핵산"은 검출하고자 하는 표적이되는 핵산을 의미한다. 상기 타겟 핵산은 바람직하게는 단일가닥인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, miRNA, siRNA, piwiRNA, snoRNA 등의 짧은 RNA 단편일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 "타겟 핵산"은 바람직하게는 10 내지 40 bp의 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 핵산 나노구조체는 3' 말단에 각각의 프로브 쌍이 연결된 구조체 핵산을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 나노구조체는 1쌍, 2쌍 또는 3쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함할 수 있으며, 1쌍의 프로브를 포함하는 구조체는 직선형의 양 끝에 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 Dimer-구조체, 3개의 이중 가닥 가지 중 2개의 가지의 끝에 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 Y-형 구조체, 및 십자형의 4개의 이중 가닥 가지 중 2개의 가지의 끝에 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 2-Arm Tetramer-구조체를 포함할 수 있고; 2쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체는 4개의 이중 가닥 가지 끝에 포함하는 Tetramer-구조체일 수 있으며; 및 3쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체는 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 번갈아 6개의 이중 가닥 가지 끝에 포함하는 Hexamer-구조체일 수 있다 (도 3b 및 도 4a 참조).
본 발명의 각 프로브 쌍은 동일한 프로브 쌍이 1쌍, 2쌍 또는 3쌍 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 동일 또는 상이한 타겟 핵산에 특이적으로 결합하는 상이한 프로브 쌍이 조합되어 사용될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 직선형의 양 끝에 프로브쌍의 각 핵산구조체 모형의 프로브를 포함하는 다이머형(D 형) 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다이머형(D 형) 구조체는 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥과 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥으로 구성되어 있고, 서로 상보적인 서열을 포함하는 제 1 구조체 가닥과 제 2 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 3개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지 끝에 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 Y형 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Y형 구조체는 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥 및 제 제 2 프로브-3 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
제 1구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 3 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 십자형의 4개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지 끝에 프로브 쌍의 각 단일가닥 프로브를 포함하는 2-Arm Tetramer 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2-Arm Tetramer 구조체는 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥, 제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥으로 구성되고,
제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 4 구조체 핵산은 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥, 제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 2쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 4개의 이중가닥 가지 끝에 2쌍의 프로브의 각 단일가닥 프로브를 포함하는 테트라머형(T 형) 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 테트라머형(T 형) 구조체는 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산과 상보적인 서열을 포함하고, 제 4 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 3쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 프로브 쌍의 각 단일가닥 프로브를 번갈아 6개의 이중가닥 가지 끝에 포함하는 헥사머형(H 형) 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 헥사머형(H 형) 구조체는 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 5 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 6 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 4 구조체 핵산은 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 5 구조체 핵산은 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 6 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 5 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 6 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 각각의 프로브에 연결된 상보적인 구조의 구조체 핵산을 포함할 수 있으며, 각각의 헤어핀 구조의 프로브에 연결된 구조체 핵산은 서로 상보적인 서열을 포함할 수 있고, 각각의 프로브 및 구조체가 연결된 단일가닥 핵산의 각각의 말단에는 형광단 또는 소광제가 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, D-구조체의 경우 제 1 프로브의 말단에는 소광제가 부착되어 있고 제 2 구조체 단일가닥 핵산의 말단에는 형광단이 부착되어 있어, 제 1 프로브 및 제 1 구조체 단일가닥 핵산과 제 2 프로브 및 제 2 구조체 단일가닥 핵산이 상보적으로 결합되어 있고, 제 1 프로브가 헤어핀 구조를 갖추고 있는 경우에는 유의미한 형광신호가 검출되지 않는다 (도 3b의 αD-DNA 참조). 여기에서, 상기의 제 1 구조체 단일가닥 핵산과 제 2 구조체 단일가닥 핵산이 상보적으로 결합된 상태의 제 1 프로브가 타겟 핵산 서열과 분자 내 반응을 하여 구조가 변경됨으로써 소광제와 형광단이 멀어져 형광 신호를 방출한다 (도 3b의 βD-DNA 참조).
일 구현예에서, 1쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체 (Dimer-구조체)는 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 1 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 및 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 2 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산을 포함하며, 제 1 구조체 핵산과 제 2 구조체 핵산은 서로 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 1쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체 (Y-형 구조체)는 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 1 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 제 2 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 및 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 3 구조체 핵산을 포함하며, 제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이며, 제 3 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 1쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체 (2-Arm T-구조체)는 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 1 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 제 2 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 제 3 구조체 핵산; 및 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 4 구조체 핵산을 포함하며, 제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 4 구조체 핵산은 제 1 구조체 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 2쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체 (T-구조체)는 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 1 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 2 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 3 구조체 핵산; 및 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 4 구조체 핵산을 포함하며, 제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 4 구조체 핵산은 제 1 구조체 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 3쌍의 프로브를 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체 (H-구조체)는 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 1 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 2 구조체 핵산을 포함하는 단일가닥 핵산; 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 3 구조체 핵산; 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 4 구조체 핵산; 프로브 쌍의 제 1 프로브에 연결된 제 5 구조체 핵산; 및 프로브 쌍의 제 2 프로브에 연결된 제 6 구조체 핵산을 포함하며, 제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 4 구조체 핵산은 제 3 구조체 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이며, 제 5 구조체 핵산은 제 4 구조체 핵산 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적이고, 제 6 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적일 수 있다.
일 구현예에서, 구조체 핵산은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 S1, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 S2, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 S3, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 S4, 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 S5, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 S6, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 S7, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 S8, 또는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 S9, 또는 이의 조합을 포함할 수 있으며, 일 실시예에서, 본 발명의 D-구조체는 S1 및 S8을 포함하고, T-구조체는 S1, S2, S3 및 S4를 포함하며, H-구조체는 S1, S2, S3, S5, S6 및 S7을 포함하고, Y-구조체는 S1, S2 및 S9을 포함하며, 2-arm T-구조체는 S1, S2, S3 및 S4를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 나노구조체는 소광제(quencher) 및 형광단(fluorophore)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 구현예에서, 5' 말단 또는 3' 말단에 소광제(quencher)를 포함하고, 3' 말단 또는 5' 말단에 형광단(fluorophore)을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 형광단은 FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 및 양자점 (Quantum dot)으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 소광제는 DDQ-I, DDQ- I I, Dabcyl, Eclipse, Iowa black FQ, Iowa black RQ, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QSY-21, QSY-7, 금 나노입자, 탄소나노튜브, 그래핀, FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 및 양자점 (Quantum dot)으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 타겟 핵산에 상보적인 프로브 쌍을 한 구조체 내에 포함하는 핵산 나노구조체는, 헤어핀 구조로 인해 서로 반응하지 않는 프로브 쌍이 타겟 핵산의 촉매 역할에 의해 차례로 반응하여 헤어핀 구조가 풀어짐으로써 상보적 결합을 통해 이중가닥을 형성하여 각각의 소광제에 의해 소광된 형광단이 발광할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 핵산 나노구조체는 검출 과정의 반응물인 핵산 프로브를 핵산 나노구조체에 집약시킴으로써, 반응 과정이 분자 간 반응이 아닌 분자 내 반응으로 일어날 수 있게 만들어 준다. 따라서, 용액 상에 분산되어 있던 반응물을 한 분자에 집약시켜 제한된 양의 촉매에 의해 빠르고 효율적인 반응을 유도하며, 반응을 저해하던 반응물의 확산과정이 일부 생략되어 핵산 구조체 내부 프로브 간의 높은 충돌빈도를 야기함으로써 반응성, 진단 감도 및 검출 속도가 개선된다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 나노구조체는 타겟 핵산인 miR-21(서열번호 19)에 대해 프로브 쌍으로서 H1(서열번호 20) 및 H2(서열번호 21); 및 구조체 핵산으로서 S1(서열번호 1), S2(서열번호 2), S3(서열번호 3), S4(서열번호 4), S5(서열번호 5), S6(서열번호 6), S7(서열번호 7), S8(서열번호 8), S9(서열번호 9), S1H1(서열번호 10), S2H2(서열번호 11), S3H1(서열번호 12), S4H2(서열번호 13), S5H2(서열번호 14), S6H1(서열번호 15), S7H2(서열번호 16), S8H2(서열번호 17), S9H2(서열번호 18), 또는 이들의 조합을 포함한 핵산 나노구조체일 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 핵산 나노구조체를 포함하는 핵산 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "시료(샘플)"는 대상 또는 환자로부터 얻은 조직, 세포, 혈액, 혈청, 소변, 타액, 혈장 또는 체액을 포함하며, 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "타겟 핵산"은 검출하고자 하는 표적이되는 핵산을 의미한다. 상기 타겟 핵산은 바람직하게는 단일가닥인 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, miRNA, siRNA, piwiRNA, snoRNA 등의 짧은 RNA 단편일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 "타겟 핵산"은 바람직하게는 10 내지 40 bp의 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 타겟 핵산 검출용 조성물을 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 핵산 나노구조체의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 헤어핀 구조를 가지며, 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 갖는 프로브 쌍이 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 있는 프로브-구조체 가닥을 제작하는 단계; 및
(b) 상기 프로브-구조체 가닥을 서로 어닐링시켜, 핵산 나노구조체를 수득하는 단계.
일 구현예에서, 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하여 프로브와 구조체 핵산을 연결하여, 프로브-구조체 가닥을 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 프로브-구조체 가닥의 농도를 각각 500 내지 700nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링함으로써 D-구조체를 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 프로브-구조체 가닥의 농도를 각각 800 내지 1000nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링함으로써 Y-구조체를 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 프로브-구조체 가닥의 농도를 각각 1100 내지 1300nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링함으로써 2-Arm T-구조체 또는 T-구조체를 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 프로브와 연결된 구조체 핵산들의 농도를 각각 1700 내지 1900nM로 하여, 50 내지 60℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.1℃/144초의 속도로 어닐링함으로써 H-구조체를 제작할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 나노구조체의 일부인 프로브 쌍의 프로브 단일 가닥 각각의 헤어핀 구조가 풀어지거나 다른 서열과 부수적인 결합을 이루지 않는 상태를 유지하면서 구조체 중심의 이중가닥 가지를 형성하기 위해 어닐링을 두 번에 걸쳐 시행될 수 있으며, 구조체를 구성하는 각 단일가닥 (D-구조체는 두 가닥, T-구조체는 네 가닥, H-구조체는 여섯 가닥, Y-구조체는 3가닥, 2-arm T-구조체는 네 가닥)을 따로 어닐링하여 프로브 단일 가닥 모티프의 헤어핀 구조를 완성한 후, 이 헤어핀 구조가 풀어지지 않도록 초기온도를 저온으로 설정하여 상기 단일가닥들을 어닐링할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산 나노구조체 또는 상기 핵산 검출용 조성물을 이용한 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 검출 프로브 쌍을 포함하는 DNA 나노구조체 합성
1-1. 분리 상태 H1 및 H2의 합성
목적 핵산인 miR-21의 탐지를 위한 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 프로브 쌍인 H1 및 H2를 등온 가닥 치환(isothermal strand displacement) 반응을 통해 형광 신호증폭을 유도하였다. 구체적으로, 헤어핀 구조의 풀림을 형광 신호 증가를 통해 확인할 수 있도록, H1 서열의 3' 말단에 BHQ2(black hole quencher 2), 5' 말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, H1 서열의 농도가 300 nM, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 100 μL 만든 후 열 순환기 (thermal cycler) 기기에서 95℃를 5분간 유지한 후 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. H2 서열 또한 같은 방법으로 준비하였다.
1-2. Dimer-DNA(D-DNA) 구조체의 합성
목적 핵산인 miR-21의 탐지를 위한 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 프로브 쌍인 H1 및 H2를 dimer 구조 (2개의 이중가닥 가지를 가짐-1쌍의 H1 및 H2 포함)로 가지는 나노구조체를 합성하였다. 구체적으로, 헤어핀 구조의 풀림을 형광 신호 증가를 통해 확인할 수 있도록, S1H1 서열의 3'말단에 BHQ2(black hole quencher 2), S8H2 서열의 5'말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, S1H1 또는 S8H2 서열의 농도가 600 nM, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 각각 50 μL 만든 후 열 순환기에서 95℃를 5분간 유지한 후 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 그 후, NaCl(aq) 농도가 200 mM이고, 서열의 농도가 각각 600 nM인 S1H1 및 S8H2 용액을 50 μL씩 섞은 후 43.5℃에서 5분간 유지한 열 순환기에서 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 이를 통해, 최종적으로 구조체의 농도가 300 nM이고 NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 100 μL의 D-DNA 용액이 완성되었다.
1-3. Tetramer-DNA(T-DNA) 구조체의 합성
목적 핵산인 miR-21의 탐지를 위한 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 프로브 쌍인 H1 및 H2를 tetramer 구조 (4개의 이중가닥 가지를 가짐-2쌍의 H1 및 H2 포함)로 가지는 나노구조체를 합성하였다. 구체적으로, S1H1 서열 및 S3H1 서열의 각 3'말단에 BHQ2가, S2H2 서열 및 S4H2 서열의 각 5'말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, S2H2, S3H1, S4H2 또는 S1H1 서열의 농도가 1200 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 각각 25 μL 만든 후 열 순환기에서 95℃를 5분간 유지 후 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 그 후, NaCl(aq) 농도가 200 mM이고, 서열의 농도가 각 1200 nM인 S1H1, S2H2, S3H1 및 S4H2 용액을 25 μL씩 섞은 후 43.5℃에서 5분간 유지한 열 순환기에서 43.5℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하여, 최종적으로 구조체의 농도가 300 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 100 μL의 T-DNA 용액이 완성되었다.
1-4. Hexamer-DNA(H-DNA) 구조체의 합성
목적 핵산인 miR-21의 탐지를 위한 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 프로브 쌍인 H1 및 H2를 Hexamer 구조 (6개의 이중가닥 가지를 가짐-3쌍의 H1 및 H2 포함)로 가지는 나노구조체를 합성하였다. 구체적으로, S1H1 서열, S3H1 서열 및 S6H1 서열의 3'말단에 BHQ2가, S2H2 서열, S5H2 서열 및 S7H2 서열의 5'말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, S2H2, S3H1, S5H2, S6H1, S7H2 또는 S1H1 서열의 농도가 1800 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 16.7 μL씩 만든 후 열 순환기에서 95℃를 5분간 유지한 뒤 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 상기에서 준비한 NaCl(aq) 농도가 200 mM이고, 각 서열의 농도가 각 1800 nM인 S1H1, S2H2, S3H1, S5H2, S6H1 및 S7H2 용액을 16.7 μL씩 섞은 후, 열 순환기에서 55℃를 5분간 유지한 뒤 55℃에서 4℃까지 -0.1℃/144초의 속도로 어닐링하였다. 최종적으로 구조체의 농도가 300 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 100 μL의 H-DNA 용액이 완성되었다.
1-5. Y형-DNA(Y-DNA) 구조체의 합성
DNA 나노구조체의 유연성 비교를 위해 한 쌍의 H1 및 H2 모티프를 포함하는 DNA 나노구조체로서, Y-DNA 구조체 (총 3 개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지에만 H1 및 H2 모티프를 포함)를 합성하였다. 구체적으로, S1H1 서열의 3'말단에 BHQ2가, S9H2 서열의 5'말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, S2, S9H2 또는 S1H1 서열의 농도가 900 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 33.3 μL씩 만든 후 열 순환기에서 95℃를 5분간 유지한 뒤 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 상기와 같이 준비한 NaCl(aq) 농도가 200 mM이고, 서열의 농도가 각 900 nM인 S1H1 및 S9H2 용액을 33.3 μL씩 섞은 후 열 순환기에서 43.5℃를 5분간 유지한 뒤 43.5℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링함으로써, 최종적으로 구조체의 농도가 300 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 100 μL의 Y-DNA 용액이 완성되었다.
1-6. 2-Arm T-DNA 구조체의 합성
DNA 나노구조체의 유연성 비교를 위해 한 쌍의 H1 및 H2 모티프를 포함하는 DNA 나노구조체로서, T-DNA 구조체 (총 4 개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지에만 H1 및 H2 모티프를 포함)를 합성하였다. 구체적으로, S1H1 서열의 3' 말단에 BHQ2가, S2 서열의 5'말단에 Cy5 형광단이 치환된 서열을 사용하였으며, S2, S3, S4H2 또는 S1H1 서열의 농도가 1200 nM이고 NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 용액을 각각 25 μL 만든 후 열 순환기에서 95℃를 5분간 유지한 뒤 95 ℃에서 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 이렇게 제조한 NaCl(aq) 농도가 200 mM이고, 각 서열의 농도가 각 1200 nM인 H1S1, S2, S3 및 S4H2 용액을 25 μL씩 섞은 후 열 순환기에서 43.5 ℃를 5분간 유지한 뒤 43.5 ℃에서 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하였다. 최종적으로 구조체의 농도가 300 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 200 mM인 100 μL의 2-Arm T-DNA 용액이 완성되었다.
상기 실시예 1에서 제조 및 사용된 프로브 쌍, 구조체 핵산 및 타겟 핵산의 염기서열은 다음 표와 같다.
목록 염기서열(5' ->3') 서열
번호
프로브 쌍
(DNA)		 H1 tcaacatcag tctgataagc taccatgtgt agatagctta tcagact (47 bp) 20
H2 taagctatct acacatggta gcttatcaga ctccatgtgt aga (43bp) 21
구조체
핵산
(DNA)		 S1 cgaccgatga atagcggtca gatccgtacc tactcg (36bp) 1
S2 cgagtaggta cggatctgcg tattgcgaac gactcg (36bp) 2
S3 cgagtcgttc gcaatacggc tgtacgtatg gtctcg (36bp) 3
S4 cgagaccata cgtacagcac cgctattcat cggtcg (36bp) 4
S5 cgagaccata cgtacagcgc gatgcgcacg cgcacg (36bp) 5
S6 cgtgcgcgtg cgcatcgctg cggtgccgtg tgcacg (36bp) 6
S7 cgtgcacacg gcaccgcaac cgctattcat cggtcg (36bp) 7
S8 cgagtaggta cggatctgac cgctattcat cggtcg (36bp) 8
S9 cgagtcgttc gcaatacgac cgctattcat cggtcg (36bp) 9
프로브-구조체 가닥 S1H1 cgaccgatga atagcggtca gatccgtacc tactcgtcaa catcagtctg ataagctacc atgtgtagat agcttatcag act (83bp) 10
S2H2 cgagtaggta cggatctgcg tattgcgaac gactcgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 11
S3H1 cgagtcgttc gcaatacggc tgtacgtatg gtctcgtcaa catcagtctg ataagctacc atgtgtagat agcttatcag act (83bp) 12
S4H2 cgagaccata cgtacagcac cgctattcat cggtcgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 13
S5H2 cgagaccata cgtacagcgc gatgcgcacg cgcacgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 14
S6H1 cgtgcgcgtg cgcatcgctg cggtgccgtg tgcacgtcaa catcagtctg ataagctacc atgtgtagat agcttatcag act (83bp) 15
S7H2 cgtgcacacg gcaccgcaac cgctattcat cggtcgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 16
S8H2 cgagtaggta cggatctgac cgctattcat cggtcgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 17
S9H2 cgagtcgttc gcaatacgac cgctattcat cggtcgtaag ctatctacac atggtagctt atcagactcc atgtgtaga (79bp) 18
타겟 핵산
(RNA)		 miR-21 uagcuuauca gacugauguu ga (22bp) 19
*상기 프로브는 볼드체로 표시된 서열의 혼성화를 통해 헤어핀 구조를 가짐
실시예 2. 나노구조체의 합성 여부 확인
상기 실시예 1에서 제작한 D-DNA, T-DNA, H-DNA 및 Y-DNA 구조체의 합성 여부를 확인하기 위해, 1x TBE 5 % 또는 12% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (1x tris/borate/EDTA polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, D-DNA, T-DNA, H-DNA 및 Y-DNA 구조체 모두가 성공적으로 합성된 것을 알 수 있었다 (도 2).
실시예 3. 분리 상태 프로브 시스템과 DNA 나노구조체 프로브가 집약된 시스템의 목적 물질에 대한 반응성 비교
3-1. 분리 상태 H1 및 H2
NaCl(aq)의 농도가 50 mM이고 miR-21 서열의 농도가 각 0 nM, 30 nM, 60 nM, 90 nM, 120 nM, 150 nM, 180 nM, 210 nM, 240 nM, 300 nM, 450 nM 또는 600 nM인 용액 16.7 μL과 상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 분리 상태의 H1 및 H2 용액을 각각 16.7 μL씩 혼합하여, 최종적으로 H1 및 H2의 농도가 각 100 nM이고, miR-21의 농도가 0 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 100 nM, 150 nM 또는 200 nM이며, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. Cy5 형광단 및 소광제로부터 miR-21에 의한 반응을 나타내는 H1의 헤어핀 구조의 풀림을 측정 가능하므로, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극 (excitation)하여 670 nm의 방출 (emission) 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 3e), miR-21 농도별 프로브의 반응 전과 후를 전기영동 분석 (도 3a), 반응 24 시간 후 miR-21 농도별 반응정도 (도 3c) 및 반응 시간별 검출 한계 (도 3d)를 확인하였다 (도 3).
3-2. D-DNA
200 mM NaCl(aq) 용액 16.7 μL, miR-21 서열의 농도가 각 0 nM, 30 nM, 60 nM, 90 nM, 120 nM, 150 nM, 180 nM, 210 nM, 240 nM, 300 nM, 450 nM 또는 600 nM인 용액 16.7 μL 및 상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 D-DNA 구조체 용액 16.7 μL을 혼합하여 최종적으로 구조체의 농도가 100 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. 그 후, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극하여 670 nm의 방출 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 3f), miR-21 농도별 프로브의 반응 전과 후를 전기영동 분석 (도 3a), 반응 24 시간 후 miR-21 농도별 반응정도 (도 3c) 및 반응 시간별 검출 한계 (도 3d)를 확인하였다 (도 3).
3-3. T-DNA
상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 T-DNA 구조체 용액 8.3 μL을 상기 2-1에서와 같이 다양한 농도의 miR-21 용액 16.7 μL 및 200 mM NaCl(aq) 용액 25 μL을 혼합하여, 최종적으로 구조체의 농도가 50 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. 그 후, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극하여 670 nm의 방출 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 3g), miR-21 농도별 프로브의 반응 전과 후를 전기영동 분석 (도 3a), 반응 24 시간 후 miR-21 농도별 반응정도 (도 3c) 및 임상 및 실험 표준 기관(Clinical and Laboratory Standards Institution, CLSI)의 가이드라인에 근거하여 계산한 반응 시간별 검출 한계 (도 3d)를 확인하였다 (도 3). 그 결과, 전기영동에서 γ 구조가 확인되었다.
3-4. H-DNA
상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 H-DNA 구조체 용액 5.5 μL을 상기 2-1에서와 같이 다양한 농도의 miR-21 용액 16.7 μL 및 200 mM NaCl(aq) 용액 27.8 μL을 혼합하여, 최종적으로 구조체의 농도가 33.3 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. 그 후, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극하여 670 nm의 방출 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 3h), miR-21 농도별 프로브의 반응 전과 후를 전기영동 분석 (도 3a), 반응 24 시간 후 miR-21 농도별 반응정도 (도 3c) 및 반응 시간별 검출 한계 (도 3d)를 확인하였다 (도 3).
3-5. 분리 상태 H1 및 H2, D-DNA, T-DNA, 및 H-DNA의 최종 반응 정도 비교 및 검출 한계 계산
각 서열에 부착된 형광 세기의 변화를 통해 H1의 헤어핀 구조의 풀림 정도, 즉 각 프로브 시스템의 반응 정도를 24 시간동안 측정한 도 3의 e, f, g 및 h의 결과를 바탕으로 각 구조체의 여러 miR-21 농도에 대한 반응 정도 측정 24 시간째의 반응 정도를 각 샘플의 반응정도는 각 구조체가 200 nM의 miR-21을 사용하였을 경우 도달한 평형 상태의 형광 값을 100%라고 가정하고 평형에 도달한 정도를 통해 비교한 결과, H-DNA, T-DNA, D-DNA, 및 분리 상태 H1 및 H2의 순으로 낮은 농도의 miR-21에 대한 높은 반응정도를 나타냈다 (도 3c). 또한, 24 시간동안 형광 세기의 변화로 측정된 각 프로브 시스템의 반응 정도를 바탕으로, 임상 및 실험 표준 기관 (Clinical and Laboratory Standards Institution, CLSI)의 가이드라인에 근거하여 반응 시간별 검출 한계를 하기 수학식 1로 계산한 결과, 분리 상태의 H1 및 H2와 비교하였을 때 분자 간 반응을 대신하여 분자 내 반응이 일어나는 D-DNA, T-DNA 및 H-DNA의 검출한계가 크게 줄어든 것을 확인할 수 있었고, 반응 12 시간 이후부터 H-DNA, T-DNA, D-DNA의 순으로 검출한계가 낮게 나타났다 (도 3d). 아울러, 동일한 농도의 H1 또는 H2 모티프 조건 (100 nM)에서 H-DNA의 구조체의 경우에는 H-DNA의 구조체 자체의 농도가 낮아 (33.3 nM) 도 1b에 나타낸 분자 간 충돌빈도가 비교적 낮아 초기 속도 및 반응성이 다른 프로브 시스템에 비해 떨어진 것으로 나타났다.
Figure 112020054337660-pat00001
(음성대조군: miR-21의 농도가 0 nM인 경우; 및 저 농도 샘플: miR-21의 농도가 10 nM인 경우)
3-6. Y-DNA
상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 Y-DNA 구조체 용액 16.7 μL을 상기 2-1에서와 같이 다양한 농도의 miR-21 용액 16.7 μL 및 200 mM NaCl(aq) 용액 16.7 μL을 혼합하여, 최종적으로 구조체의 농도가 100 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. 그 후, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극하여 670 nm의 방출 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 4e), 초기 반응 속도 (도 4b) 및 반응 시간별 검출 한계 (도 4c)를 확인하였다.
3-7. 2-Arm T-DNA
상기 실시예 1에서 합성한 300 nM의 2-Arm T-DNA 구조체 용액 16.7 μL을, 상기 2-1에서와 같이 다양한 농도의 miR-21 용액 16.7 μL 및 200 mM NaCl(aq) 용액 16.7 μL과 혼합하여 최종적으로 구조체의 농도가 100 nM이고, NaCl(aq)의 농도가 150 mM이 되도록 하였다. 그 후, 37 ℃에서 분광기를 통해 640 nm의 파장으로 Cy5 형광단을 자극하여 670 nm의 방출 파장의 세기를 24 시간 동안 3분 간격으로 측정함으로써 다양한 농도의 miR-21에 대한 시간에 따른 반응도를 확인하였으며 (도 4f), 초기 반응 속도 (도 4b) 및 반응 시간별 검출 한계 (도 4c)를 확인하였다.
3-8. 검출 한계 계산 및 초기 반응 속도 비교
각 서열에 부착된 형광 세기의 변화를 통해 H1의 헤어핀 구조의 풀림 정도, 즉 각 프로브 시스템의 반응 정도를 24 시간동안 측정한 도 4의 d, e 및 f의 결과를 바탕으로, 각 구조체의 각 miR-21 농도에서의 그래프를 가장 가까운 S자형 웨이불(weibull) 모델에 맞추어 회귀하여 시간에 따른 반응 정도에 대한 식을 도출하고, 이를 통해 그래프의 반응 시작 1 시간째의 기울기, 즉 반응 속도를 계산한 결과, 반응 시작으로부터 1 시간째의 각 프로브 시스템 별 반응 속도를 miR-21 농도에 따라 비교한 초기 반응 속도에서, 0 nM에서 40 nM까지의 miR-21 농도 조건에서는 2-Arm T-DNA, Y-DNA 및 D-DNA의 순으로 반응속도가 빠른 것으로 나타났으며, 50 nM 이상의 miR-21 농도 조건에서는 2-Arm T-DNA, Y-DNA, D-DNA의 순으로 반응이 포화상태에 도달하여 반응속도가 감소하기 시작하였다 (도 4b). 또한, 임상 및 실험 표준 기관 (Clinical and Laboratory Standards Institution, CLSI)의 가이드라인에 근거하여 각 프로브 시스템의 반응 시간별 검출 한계를 도출한 결과, H1 및 H2 모티프 간의 연결 부위의 유연성이 큰 2-Arm T-DNA, Y-DNA 및 D-DNA의 순으로 검출한계가 낮은 것으로 나타났다 (도 4c).
실시예 4. oxDNA 시뮬레이션 프로그램을 통한 DNA 나노구조체 내에서의 프로브 간의 거리 측정 및 충돌 빈도 계산
4-1. 구조체 형성 단계의 염기쌍 간 거리 및 충돌 빈도 계산
DNA 나노구조체의 형성과 구조체 내 염기 쌍 간 거리 분석을 위해 도 5에 기재된 파라미터를 이용한 DNA 핵산 시뮬레이션 프로그램을 통해 각 구조체의 H1 모티프가 miR-21과 결합된 상태의 D-DNA, T-DNA 및 H-DNA의 구조를 분석하였다. 구체적으로, 프로그램 상에서 각 구조체를 형성하기 위해 각 구조체에서 상보적으로 결합하는 서열들의 끝에서 두 번째 염기쌍을 "trap" 기능을 통해 묶어주었다. 또한, 구조가 비교적 복잡한 H-DNA의 경우에만 추가적으로 끝에서 세 번째 염기쌍에도 mutual trap 기능을 적용하였다 (Mutual trap: 서로 다른 두 염기의 좌표 상 거리를 임의로 가깝게 하는 기능으로 일반적으로 서열 간의 원활한 이중결합 형성을 위해 사용하는 기능).
4-2. 구조체 내 염기 쌍 간 거리 분석
DNA 나노구조체에 집약된 H1, H2 모티프 간의 분자 내 반응 시의 거리를 측정하기 위해, 서열-기반 molecular dynamic(MD) 시뮬레이션을 통해 상기 4-1의 실제로 반응이 시작되는 miR-21이 결합된 상태의 H1 모티프의 3' 말단에서부터 여덟 번째 염기와 H2 모티프의 5'말단에서부터 첫 번째 염기 (H1과 H2 사이의 상보 결합이 시작되는 염기쌍) 사이의 거리를 측정하였으며, D-DNA, T-DNA 및 H-DNA는 각각 한 가지, 네 가지, 아홉 가지의 H1, H2 모티프 조합의 사이의 거리를 측정하였다 (도 6).
4-3. H1 및 H2의 유효 충돌 빈도 계산
상기 4-2에서 측정한 DNA 나노구조체 내 H1 및 H2 모티프 사이의 상보 결합이 시작되는 염기 쌍 사이의 거리 분포 중, 일반적으로 oxDNA 프로그램 거리 단위 1 (일반적으로 통용되는 염기 쌍 사이에 유효한 반응이 일어나기 위한 충분한 거리)에 도달하는 횟수와 시간을 측정하여 충돌 빈도를 계산하였다 (도 7). 이를 위해, 도 6에서 측정한 모티프 간의 거리를 바탕으로 H1 및 H2 모티프 간의 거리가 1일 때의 횟수를 기준으로 분자 내의 충돌빈도를 계산하였다.
실시예 5. 분리 상태의 H1 및 H2의 충돌 빈도의 이론적 계산
기존 단일 가닥 기반의 진단 시스템에 해당하는 분리 상태의 H1 및 H2의 프로브 간 충돌 빈도는 수용액 내 확산 반응을 기반으로 한 스몰루초프스키 방정식을 통해 이론적으로 계산하였다. 구체적으로, 스몰루초프스키의 액상에서의 용질의 응고 모델(Smoluchowski coagulation model)의 일부를 이용하여 분리 상태의 H1 및 H2의 충돌빈도를 계산하였으며, 중심이 되는 한 입자를 향해 브라우니언 운동(Brownian motion)에 의해 분산되는 입자의 개수를 고려하였고, 픽의 법칙(Fick'law)에 의해 반지름이 r인 모든 중심입자를 둘러싸고 있는 입자를 통과하며 결국 중심입자에 도달하는 한 입자의 플럭스(flux), 즉 중심입자와의 충돌 빈도를 하기 수학식 2로 나타낼 수 있다.
Figure 112020054337660-pat00002
(F: 플럭스 (flux); D: 확산계수 (diffusivity); R: 두 입자의 중심 간 거리; 및 υ0: 벌크(bulk) 농도)
여기서, 충돌하는 입자의 반지름이 같다고 가정하면, 스토크스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)에 의해 확산계수를 하기 수학식 3으로 나타낼 수 있음.
Figure 112020054337660-pat00003
(kB: 볼츠만 상수; 및 η: 용액의 점도)
상기 수학식 3을 수학식 2에 대입하고, 용액의 점도를 실험 조건에 따라 759.873 μPa·s으로 가정하면, 분리 상태의 H1 및 H2의 충돌 빈도는 2710 s-1로 계산된다. 이를 상기 실시예 4의 oxDNA 시뮬레이션 분석을 통해 유추된 각 DNA 나노구조체 H1, H2 모티프의 분자 내 반응의 충돌빈도와 비교한 결과, 분리 상태의 H1 및 H2는 분자 간 충돌빈도가 도 1a에서와 같이 하나의 miR-21에 대해 두 번 일어났으나, D-DNA, T-DNA 및 H-DNA의 반응 과정에서 일어나는 한 번의 분자 내 반응의 경우 충돌빈도가 분리 상태의 H1 및 H2의 분자 간 반응의 충돌빈도에 비해 적게는 5배, 크게는 500배 이상 큰 것으로 나타났다. 이를 통해 분리 상태의 H1 및 H2에 비해 H1 및 H2 모티프가 DNA 나노구조체에 집약되어 있는 본 발명의 구조체 프로브 시스템의 높은 반응성을 확인할 수 있었다 (도 8). 즉, 증대된 진단 감도가 구조체 내 집약된 프로브 서열로 인한 것임을 알 수 있다.
두 가지의 헤어핀 구조를 가지는 모티프인 H1 및 H2는 등온 가닥 치환 반응을 통해 miR-21을 검출할 수 있으며, 두 가지의 모티프가 관여함으로 인해 miR-21은 검출 프로브와 분리, 재활용이 가능하고 이는 검출 시그널의 증폭을 가능하게 하고, 이 과정에서 프로브와 miR-21 사이에서는 두 번의 분자 간 반응이 일어났다 (도 1a). 두 모티프인 H1 및 H2가 이중가닥 구조에 집약됨으로써 분리된 H1 및 H2의 분자 간 반응 2가 보다 즉각적이고 빠른 분자 내 반응으로 바뀌었으며 (도 1b). 분리 상태이던 H1 및 H2는 DNA 나노구조체로의 집약으로 인해 각 모티브 간의 충돌빈도가 증가하였고, 이로 인해 프로브 시스템의 반응성이 증가하였다 (도 1c).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. 헤어핀 구조를 갖는 프로브 쌍을 포함하는 타겟 핵산의 검출용 핵산 나노 구조체로,
    상기 프로브 쌍 중 어느 하나 이상의 프로브는 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 포함하고,
    상기 프로브 쌍의 프로브는 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 프로브-구조체 가닥을 각각 형성하며,
    상기 각각의 프로브-구조체 가닥은 상기 구조체 핵산 사이의 상보적 결합에 의하여 서로 혼성화되어 있고,
    타겟 핵산과 상기 프로브 쌍의 일 프로브가 결합하는 경우, 핵산 나노 구조체 내 반응을 통해 상기 프로브 쌍의 다른 프로브와 상보적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 검출용 핵산 나노 구조체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브 쌍의 프로브는 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노 구조체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구조체 핵산의 3' 말단에 프로브가 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노 구조체.
  4. 제1항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체:
    (i) 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체;
    (ii) 2쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체; 및
    (iii) 3쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노 구조체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 직선형의 양 끝에 프로브쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 다이머형(D 형) 구조체로서, 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥과 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥으로 구성되어 있고, 서로 상보적인 서열을 가지는 제 1 구조체 가닥과 제 2 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 3개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지 끝에 프로브 쌍의 각 단일 가닥 프로브를 포함하는 Y형 구조체로서,
    제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 3 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
    제 1구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
    상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 3 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체.
  7. 제4항에 있어서, 상기 1쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 십자형의 4개의 이중가닥 가지 중 2개의 가지 끝에 프로브 쌍의 각 단일가닥 프로브를 포함하는 2-가지 테트라머(2-Arm Tetramer) 구조체로서,
    제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥, 제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제4 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
    제 1구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 4 구조체 핵산은 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
    상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 구조체 가닥, 제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체.
  8. 제4항에 있어서, 상기 2쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 4개의 이중가닥 가지 끝에 2쌍의 프로브의 각 단일가닥 프로브를 포함하는 테트라머형(T 형) 구조체로서,
    제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
    제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 4 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
    상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체.
  9. 제4항에 있어서, 상기 3쌍의 프로브를 포함하는 핵산 나노구조체는 프로브 쌍의 각 단일가닥 프로브를 번갈아 6개의 이중가닥 가지 끝에 포함하는 헥사머형(H 형) 구조체로서,
    제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 5 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 6 구조체 가닥으로 구성되어 있고,
    제 1 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산과 상보적인 서열 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 2 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 3 구조체 핵산은 제 2 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 4 구조체 핵산은 제 3 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하며, 제 5 구조체 핵산은 제 4 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 6 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 제 6 구조체 핵산은 제 1 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열 및 제 5 구조체 핵산의 일부 서열과 상보적인 서열을 포함하여,
    상기 제 1 프로브-제 1 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 2 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 3 구조체 가닥, 제 2 프로브-제 4 구조체 가닥, 제 1 프로브-제 5 구조체 가닥 및 제 2 프로브-제 6 구조체 가닥이 서로 상보적으로 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 핵산 나노구조체의 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA 및 RNA인 핵산 나노구조체.
  11. 제1항에 있어서, 5' 말단 또는 3' 말단에 소광제(quencher)를 포함하고, 3' 말단 또는 5' 말단에 형광단(fluorophore)을 포함하는 핵산 나노구조체.
  12. 제1항의 핵산 나노구조체를 포함하는 타겟 핵산 검출용 조성물.
  13. 제12항의 핵산 검출용 조성물을 포함하는 진단 키트.
  14. 다음 단계를 포함하는 제1항의 핵산 나노구조체의 제조방법:
    (a) 헤어핀 구조를 가지며, 타겟 핵산과 특이적으로 결합하는 염기서열을 갖는 프로브 쌍이 각각 서로 상보적인 서열을 포함하는 구조체 핵산과 연결되어 있는 프로브-구조체 가닥을 제작하는 단계; 및
    (b) 상기 프로브-구조체 가닥을 서로 어닐링시켜, 제1항의 핵산 나노구조체를 수득하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, (a) 단계에서 프로브-구조체 가닥은 95℃에서 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하여 프로브와 구조체 핵산을 연결하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체의 제조 방법.
  16. 제14항에 있어서, (b) 단계에서 프로브-구조체 가닥들의 농도를 각각 500 내지 700nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체의 제조 방법.
  17. 제 14항에 있어서, (b) 단계에서 프로브-구조체 가닥들의 농도를 각각 800 내지 1000nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체의 제조 방법.
  18. 제 14항에 있어서, (b) 단계에서 프로브-구조체 가닥들의 농도를 각각 1100 내지 1300nM로 하여, 40 내지 45℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4℃까지 -0.5℃/30초의 속도로 어닐링하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체의 제조 방법.
  19. 제 14항에 있어서, (b) 단계에서 프로브-구조체 가닥들의 농도를 각각 1700 내지 1900nM로 하여, 50 내지 60℃에서 3 내지 10분 동안 유지한 뒤 4 ℃까지 -0.1℃/144초의 속도로 어닐링하는 것을 특징으로 하는 핵산 나노구조체의 제조 방법.
  20. 제1항의 나노구조체 또는 제12항의 핵산 검출용 조성물을 이용한 타겟 핵산의 검출방법.
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