CN109762875B

CN109762875B - 基于dna分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法

Info

Publication number: CN109762875B
Application number: CN201910208663.5A
Authority: CN
Inventors: 郑欣; 裴景亮; 李昆; 刘巍; 张立娟; 岳朝敏
Original assignee: Jinan Guang Medical Technology Co ltd
Current assignee: Jinan Guang Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109762875A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法。本发明通过设计DNA分子探针，使体系中的靶核酸能够触发级联的DNA信号放大反应，形成超枝状的DNA纳米结构，进而有效的切割具有荧光基团修饰的信号链，并通过荧光检测仪检测荧光强度，最终实现靶核酸信息被显著放大的目的。本发明利用核酸之间竞争杂交作为能量来源实现信号放大，不需要变温和其他酶的辅助，具有操作简单、效率高、通用性好、灵敏度高、响应快等特点，同时对仪器的要求大大简化。

Description

基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法。

背景技术

核酸分子携带有遗传信息，是生物物种延续、进化的决定因素。核酸的检测涉及到基因筛查等诸多领域，与人类健康息息相关，传统的核酸检测方法灵敏度低、操作复杂、耗时耗力。为了提高检测的灵敏度，往往需要对分子识别后的信号进行有效放大，尤其在一些低浓度的待测分子的检测中显得更为重要。

现有技术中，学者们发展了多种核酸扩增放大技术，常用的核酸扩增技术有聚合酶式链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)和滚环扩增反应(Rolling CircleAmplification, RCA)等，但是PCR和RCA反应都需要酶的参与，当应用于复杂的实际样品中时，由于酶活性的不稳定性和需要严格的实验条件，其结果往往不尽人意，而且PCR和RCA反应还容易在扩增过程中出现假阳性。杂交链式反应利用引发链引发，形成有缺口的核酸长链，可作为信号放大的平台。中国专利申请（CN107574227A）公开了一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法，该方法能够增强信号放大能力，提高成像效果，但是，该方法中只含有一个发光结构，仅是线性放大过程，检测灵敏度及检测时间仍有待提高。因此，研发一种检测灵敏度更高、检测时间短、方便快捷的分析方法成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的灵敏度低、检测时间长等问题，本发明提供了一种基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法，本发明利用荧光-核苷酸探针，建立了一种高灵敏度的可视化的核酸检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法，包括以下步骤：

(1) 探针的设计及反应启动阶段：设计直链型识别探针A和定位探针B，靶核酸(I)存在的条件下，识别探针和定位探针特异性的结合到靶核酸上，同时探针发生构象变化，各暴露出一段单链序列，作为启动后续放大阶段的触发链T₁，T₁能与序列a、b互补；

(2) 探针设计及级联信号放大阶段：设计发卡探针即HCR单体：H₁、H₂、H₃、H₄；H₁包括f、a、b、c、b*、g六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为H₁发卡结构的环部，g为H₁的3’端单链粘性末端，a为H₁的5’端单链粘性末端，H₁的5’端延伸出一段f序列；H₂包括d、b*、a*、b、c*、e六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，d为H₂的5’端单链粘性末端，c*为H₂的3’端单链粘性末端，H₂的3’端延伸出一段e序列；启动阶段暴露出的触发链T₁先与H₁中的a、b杂交从而打开H₁，H₁被打开后释放出序列f、c、b*、g，其中c、b*可以与H₂中的c*、b杂交，从而将H₂打开，释放出a*、b*序列，因此被打开后的H₂又可以与H₁杂交，杂交过程中H₁的3’端和5’端分别有一段翘起片段(g)和(f)，H₂的3’端和5’端也分别有一段翘起片段(e)和(d)，最终一个靶核酸可以引发多个H₁和H₂之间进行茎环结构的交替打开，得到大量包含重复单元d-e序列和f-g序列的线性DNA长链，此过程记为HCR-1反应；

在没有靶核酸(I)时，识别探针和定位探针及HCR单体均能够保持自身的稳定性，无法发生HCR-1反应；当有靶核酸(I)存在时，就可以引发HCR-1反应，HCR-1产物用I·A·B-(H₁·H₂)_N表示，形成的HCR-1产物后，f-g序列可以作为触发链T引发下游HCR-2反应；

下游HCR-2包含H₃和H₄两个发卡结构，其中g和g*互补成双链作为H₃和H₄的茎部，e为在H₃发卡结构茎部延伸出的3’端单链粘性末端，f*为H₃的5’端单链粘性末端，H₃的5’端延伸出一段d序列，d*为H₃的发卡结构的环部；f为H₄的发卡结构的环部，b*为H₄的5’端单链粘性末端，d为H₄的3’端单链粘性末端，H₄的3’端延伸出一段a*序列；HCR-1产物中的f-g序列即触发链T₂，先和H₃中的f*、g*杂交，从而打开H₃，H₃被打开后释放出d、d*、g、e，其中的d*、g可以与H₄中的d、g*杂交，从而打开H₄，H₄释放出的f、g序列与触发链T序列一样，因此被打开后的H₄又可以与H₃杂交，杂交过程中H₃的3’端和5’端分别有一段翘起片段(e)和(d)，H₄的3’端和5’端也分别有一段翘起片段(a*)和(b*)，最终一个触发链T₂可以引发多个H₃和H₄之间进行茎环结构的交替打开，得到大量包含重复单元d-e序列和a*-b*序列的线性DNA长链(I·A·B-(H₁·H₂)_N·(H₃·H₄)_N)，此过程记为HCR-2反应；

HCR-2反应过程中产生的序列a*-b*与启动阶段暴露出来序列一样，可作为触发链打开H₁的结构，从而引发HCR-1反应，HCR-1反应中产生的f-g序列又引发HCR-2反应，最终引起多路径HCR-1与HCR-2反应的循环交替发生，产生大量的d-e序列，经多次HCR反应之后，形成的产物可以用I·A·B-[(H₁·H₂)_N·(H₃·H₄)_N]^N表示；

(3) 探针的设计及荧光-核苷酸探针可视化检测阶段：设计荧光信号链探针Sub1i-FB，其中，探针Sub1i-FB包含e*、d*两部分序列，其5’端标记荧光报告基因(FAM)，3’端标记淬灭基因(BHQ)；没有靶核酸存在时，探针稳定的存在体系中，当靶核酸存在时，引发HCR-1和HCR-2反应，最终生成的产物中包含大量的d-e序列，与探针Sub1i-FB特异性互补，导致探针Sub1i-FB断裂，荧光基因与淬灭与基因远离，荧光基因发出荧光，被荧光检测仪检测到并记录荧光强度；相反，当反应体系中不存在靶核酸时，则无级联信号放大反应，荧光检测仪检测到的荧光值为一定值，从而说明体系中不存在靶核酸。

进一步的，所述靶核酸的最低检测浓度为1 pmol/L。

进一步的，所述HCR反应的过程中，HCR单体的浓度相同。

进一步的，所述的核酸检测的反应体系包括50 mM MgCl₂，50 mM Tris-HCl(pH9.0)，1×SSC，0.8% PLL-g-Dex，50 nmol/L HCR单体(H₁,H₂和H₃,H₄)，50 nmol/L 探针(A和B)，400 nmol/L探针(Sub1i-FB)和靶核酸(I)。

上述检测过程中的反应温度为37-50℃，反应时间为30-40 min。

本发明还提供了一种基于上述的核酸检测方法制备的DNA检测试剂盒，其特征在于，包含发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、A、B；其中A和B分别是识别探针和定位探针，在靶核酸存在的情况下，启动级联放大反应；H₁和H₂是一对可杂交互补并带有粘性末端的发卡型探针，H₁包括f、a、b、c、b*、g六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为H₁发卡结构的环部，g为H₁的3’端单链粘性末端，a为H₁的5’端单链粘性末端，H₁的5’端延伸出一段f序列；H₂包括d、b*、a*、b、c*、e六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，d为H₂的5’端单链粘性末端，c*为H₂的3’端单链粘性末端，H₂的3’端延伸出一段e序列；

下游HCR-2包含H₃和H₄两个发卡结构，其中g和g*互补成双链作为H₃和H₄的茎部，e为在H₃发卡结构茎部延伸出的3’端单链粘性末端，f*为H₃的5’端单链粘性末端，H₃的5’端延伸出一段d序列，d*为H₃的发卡结构的环部；f为H₄的发卡结构的环部，b*为H₄的5’端单链粘性末端，d为H₃的3’端单链粘性末端，H₄的3’端延伸出一段a*序列；

探针Sub1i-FB包含e*、d*两部分序列，其5’端标记荧光报告基因(FAM)，3’端标记淬灭基因(BHQ)。没有靶核酸存在时，探针稳定的存在体系中，当靶核酸存在时，靶核酸与识别探针和定位探针结合且发生构象变化，引起多路径HCR-1与HCR-2反应的循环交替发生，最终生成的产物中包含大量的d-e序列，与探针Sub1i-FB特异性互补，导致探针Sub1i-FB断裂，荧光基因与淬灭基因远离，荧光基因发出荧光，被荧光检测仪检测到并记录荧光强度；相反，当反应体系中不存在靶核酸时，则无法启动级联信号放大反应，荧光检测仪检测到的荧光值为一定值，从而说明体系中不存在靶核酸。

本发明还提供了一种基于上述的核酸检测方法及试剂盒的应用，所述检测方法可应用于药物基因组学检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明提供的核酸检测方法，采用的是一步法操作，多路径多级信号级联放大，具有较高的效率，无需扩增，可缩短反应时间至30-40 min，通用性好；具有超高的选择性，抗干扰能力强，不存在交叉污染，不需要单独设置专门的PCR实验室，经试验验证证实可以很好的区分各种错配序列。

2.本发明提供的核酸检测方法，具有高灵敏度，信号级联放大的设计，可以提高灵敏度到1pM；在本发明整个核酸信号级联信号放大过程中，只有一条直链探针上带有荧光基因和淬灭基因，其他发卡结构没有进行修饰，成本低。

3.本发明提供的核酸检测方法，放大产物与靶核酸序列无关，不会造成放大产物的交叉污染，与实时定量PCR相比，由于采用的是恒温非酶反应，无需使用昂贵的热循环仪，简单的控温设备既可完成反应，应用范围更广泛。

4.本发明构建的级联HCR的产物是超枝状的DNA纳米结构，该结构中较单个HCR相比能切断更多的探针，荧光强度更强。

附图说明

图1是本发明的探针结构示意图。

图2是本发明的反应流程原理示意图；图中每个字母代表一段核酸序列，标有*的字母与相应的没有标记*的是互补的。

图3是本发明的核酸探针方法检测靶核酸时，随时间变化荧光强度变化及强度增加的比率图。

具体实施方式

下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点和显著进步，下述实施例仅在于说明本发明而不限制本发明。

实施例1

1.1探针的设计：运用Primer3软件设计相关探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。在没有靶核酸时，保证每个发卡探针能够保持自身的稳定性，但是存在靶核酸时能够引发级联杂交链式反应，具有荧光基团修饰的信号链被切割，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团发出荧光，信号被仪器收集到，从而进行定性实验的测定。

在临床药物治疗过程中，通过药物基因位点的检测，评估患者在药物代谢酶、药物转运体和药物作用靶点等方面的遗传特异性，针对患者实现可预知的、精准的个体化用药，有助于提高药物治疗效果、降低药物不良反应、缩短治疗周期和降低治疗费用。氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。设计针对测定CYP2C19基因的识别探针A和定位探针B，能特异性的与CYP2C19结合，具体序列如下表所示。

表1.经Primer3软件设计的DNA探针

图2为级联杂交链式反应应用于DNA检测的原理图。在50mM Tris-HCl，1×SSC，0.8% PLL-g-Dex，50mM MgCl₂组成的缓冲液中，H₁、H₂、H₃、H₄、A和B的浓度均为50nM，Sub1i-FB的浓度为400nM，在反应温度为42℃的条件下，采用荧光光谱仪对HCR体系进行分析，是否存在靶核酸(I)构成了本实验的实验组和对照组。结果如图3所示，纵坐标表示随着检测时间的延长，荧光值的变化情况；插图的纵坐标为随时间变化荧光强度增加的比率，横坐标为反应时间。与对照组相比，实验组的荧光值显著增强，即靶核酸的信号被显著放大。

氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。CYP2C19基因存在多态性，以CYP2C19*2为例，其SNP号为rs4244285，CYP2C19*2为A基因型的患者：氯吡格雷代谢不良，活性代谢物形成减少，导致反应降低；用氯吡格雷治疗后继发心血管事件的风险增加，此检测结果对后续医学用药具有指导作用。

实施例2

硝酸酯类药物是抗心肌缺血的常用药，硝酸甘油是前体药物，在线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）等的作用下脱去硝基，转化为一氧化氮（NO）而发挥舒血管的作用。临床上主要用于冠心病心绞痛的治疗及预防，也可用于降低血压或治疗充血性心力衰竭。

设计针对ALDH2基因的识别探针A和定位探针B，其他探针(H₁、H₂、H₃、H₄和Sub1i-FB)的序列保持不变(同实施例1)，如下表所示。

表2.经Primer3软件设计的DNA探针

实验结果见图3所示，纵坐标表示随着检测时间的延长，荧光值的变化情况；插图的纵坐标为随时间变化荧光强度增加的比率，横坐标为反应时间。与对照组相比，实验组的荧光值显著增强，即靶核酸的信号被显著放大。ALDH2的基因位于12号染色体长臂24区2带（12q24.2），ALDH2具有高度的遗传多态性。采用此方法能判断出ALDH2基因突变与否，目前研究较多的是发生在1510 G>A的突变，这一突变使得ALDH2酶活性性降低，能够显著影响硝酸甘油的生物转化进而影响硝酸甘油的疗效。

<110>济南广音医疗科技有限公司

<120>基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法

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<211>76

<212>DNA

<213>人工合成

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GAGTG GAGGC TGGTG CGGCT TAGGA TCTGA GGTTG AGTCT CAGAT CCTAA G CCGCACTGA CTGTG ACAGA GTGTA G 76

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<212>DNA

<213>人工合成

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<400>2

CATCT CTTCT CCGAG CTCAA CCTCA GATCC TAAGC CGCAC ACAGT CAGTG C GGCTTAGGA TCTGA GCGGT CGAAA TAGTG AGT 83

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<212>DNA

<213>人工合成

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TGAGT GATAA AGCTG GCAGC AGACT CACCT CCGAC CTGTC TGATG TGAGA C AGGTCGGAG GTGAG CGAGC CTCTT CTCTA C 81

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<212>DNA

<213>人工合成

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<223>

<400>4

GTGCG GCTTA GGCTC TACAC TCTGT CCAGC CTCCA CTCTC GTCTG AGTGG A GGCTGGACA GAAGA TCTGA GGTTG A 76

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<212>DNA

<213>人工合成

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GTGCG GCTTA GGCCA GGAAC CCATA 25

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<212>DNA

<213>人工合成

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ATAAT TTTCC CACTA TCATT GATTA TATGC AATAA TTTTC CCACT ATCAT TGATTATTTC 60

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<212>DNA

<213>人工合成

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ACTCA CTATA GGAAG AGATG 20

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<212>DNA

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ACTAT CATTG ATTAT TTCCC AGGAA CCCAT AACAA ATTAC TTA 43

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GTGCG GCTTA GGAAA GTGAA AACT 24

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<213>人工合成

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GGTGG CTACA AGATG TCGGG GAGTG GCCGG GAGTT GGGCG AGTAC GGGCT G CAGGCATA CACT 64

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<212>DNA

<213>人工合成

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<223>

<400>11

CGGGC TGCAG GCATA CACTA AAGTG AAAAC TGTGA GTGT 39

Claims

1.一种基于DNA分子恒温非酶级联信号放大的核酸检测方法制备的DNA检测试剂盒，其特征在于，包含发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、A、B；其中A和B分别是识别探针和定位探针，在靶核酸存在的情况下，启动级联放大反应；H₁和H₂是一对可杂交互补并带有粘性末端的发卡型探针，H₁包括f、a、b、c、b*、g六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为H₁发卡结构的环部，g为H₁的3’端单链粘性末端，a为H₁的5’端单链粘性末端，H₁的5’端延伸出一段f序列；H₂包括d、b*、a*、b、c*、e六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，d为H₂的5’端单链粘性末端，c*为H₂的3’端单链粘性末端，H₂的3’端延伸出一段e序列；

探针Sub1i-FB包含e*、d*两部分序列，其5’端标记荧光报告基因FAM，3’端标记淬灭基因BHQ；没有靶核酸存在时，探针稳定的存在体系中，当靶核酸存在时，靶核酸与识别探针和定位探针结合且发生构象变化，引起多路径HCR-1与HCR-2反应的循环交替发生，最终生成的产物中包含大量的d-e序列，与探针Sub1i-FB特异性互补，导致探针Sub1i-FB断裂，荧光基因与淬灭基因远离，荧光基因发出荧光，被荧光检测仪检测到并记录荧光强度；相反，当反应体系中不存在靶核酸时，则无法启动级联信号放大反应，荧光检测仪检测到的荧光值为一定值，从而说明体系中不存在靶核酸；

所述H₁、H₂、H₃、H₄及Sub1i-FB的序列为：

具体设计如下：

(1) 探针的设计及反应启动阶段：设计直链型识别探针A和定位探针B，靶核酸I存在的条件下，识别探针和定位探针特异性的结合到靶核酸上，同时探针发生构象变化，各暴露出一段单链序列，作为启动后续放大阶段的触发链T₁，T₁能与序列a、b互补；

(2) 探针设计及级联信号放大阶段：设计发卡探针即HCR单体：H₁、H₂、H₃、H₄；H₁包括f、a、b、c、b*、g六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为H₁发卡结构的环部，g为H₁的3’端单链粘性末端，a为H₁的5’端单链粘性末端，H₁的5’端延伸出一段f序列；H₂包括d、b*、a*、b、c*、e六个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，d为H₂的5’端单链粘性末端，c*为H₂的3’端单链粘性末端，H₂的3’端延伸出一段e序列；启动阶段暴露出的序列T₁先与H₁中的a、b杂交从而打开H₁，H₁被打开后释放出序列f、c、b*、g，其中c、b*可以与H₂中的c*、b杂交，从而将H₂打开，释放出a*、b*序列，因此被打开后的H₂又可以与H₁杂交，杂交过程中H₁的3’端和5’端分别有一段翘起片段g和f，H₂的3’端和5’端也分别有一段翘起片段e和d，最终一个靶核酸可以引发多个H₁和H₂之间进行茎环结构的交替打开，得到大量包含重复单元d-e序列和f-g序列的线性DNA长链，此过程记为HCR-1反应；

在没有靶核酸I时，识别探针和定位探针及HCR单体均能够保持自身的稳定性，无法发生HCR-1反应；当有靶核酸I存在时，就可以引发HCR-1反应，HCR-1产物用I·A·B-(H₁·H₂)_N表示，形成的HCR-1产物后，f-g序列可以作为触发链T引发下游HCR-2反应；

下游HCR-2包含H₃和H₄两个发卡结构，其中g和g*互补成双链作为H₃和H₄的茎部，e为在H₃发卡结构茎部延伸出的3’端单链粘性末端，f*为H₃的5’端单链粘性末端，H₃的5’端延伸出一段d序列，d*为H₃的发卡结构的环部；f为H₄的发卡结构的环部，b*为H₄的5’端单链粘性末端，d为H₄的3’端单链粘性末端，H₄的3’端延伸出一段a*序列；HCR-1产物中的f-g序列即触发链T₂，先和H₃中的f*、g*杂交，从而打开H₃，H₃被打开后释放出d、d*、g、e，其中的d*、g可以与H₄中的d、g*杂交，从而打开H₄，H₄释放出的f、g序列与触发链T₂序列一样，因此被打开后的H₄又可以与H₃杂交，杂交过程中H₃的3’端和5’端分别有一段翘起片段e和d，H₄的3’端和5’端也分别有一段翘起片段a*和b*，最终一个触发链T₂可以引发多个H₃和H₄之间进行茎环结构的交替打开，得到大量包含重复单元d-e序列和a*-b*序列的线性DNA长链I·A·B-(H₁·H₂)_N·(H₃·H₄)_N，此过程记为HCR-2反应；

(3) 探针的设计及荧光-核苷酸探针可视化检测阶段：设计荧光信号链探针Sub1i-FB，其中，探针Sub1i-FB包含e*、d*两部分序列，其5’端标记荧光报告基因FAM，3’端标记淬灭基因BHQ；没有靶核酸存在时，探针稳定的存在体系中，当靶核酸存在时，引发HCR-1和HCR-2反应，最终生成的产物中包含大量的d-e序列，与探针Sub1i-FB特异性互补，导致探针Sub1i-FB断裂，荧光基因与淬灭与基因远离，荧光基因发出荧光，被荧光检测仪检测到并记录荧光强度；相反，当反应体系中不存在靶核酸时，则无级联信号放大反应，荧光检测仪检测到的荧光值为一定值，从而说明体系中不存在靶核酸；

所述靶核酸的最低检测浓度为1 pmol/L；

所述HCR反应的过程中，HCR单体的浓度相同；

所述的核酸检测的反应体系包括50 mM MgCl₂，pH 9.0、50 mM Tris-HCl，1×SSC，0.8%PLL-g-Dex，50 nmol/L HCR单体H₁,H₂和H₃,H₄，50 nmol/L 探针A和B，400 nmol/L探针Sub1i-FB和靶核酸I；

所述检测过程中的反应温度为37-50℃，反应时间为30-40 min。