CN110452963B - 基于枝状dna的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，步骤为：制备一种n枝状DNA和一种不同于n枝状的粘性末端的m枝状DNA，将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入n枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入m枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定；直至加入一种n枝状DNA或m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。本发明操作简便，无需酶的参与，无需分子标记，成本低廉，适用范围广泛。

Description

基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法
技术领域
本发明属于核酸分子检测的技术领域，涉及基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，属于一种定性的核酸检测方法。
背景技术
核酸的检测和分析对疾病的诊断和治疗起着非常重要的作用，如何快速精准地检测核酸序列是现代医学亟需解决的问题，也是个性化医疗的发展趋势，现主要检测的目标分为细菌和病毒病原体、癌症标志物、遗传性疾病等[1]。癌症是全球第二大致死病因[2]，很多病人由于未及时发现疾病，而错过了最佳的诊断和治疗时间，因此癌症的早期诊断对于人类健康和安全来说是至关重要的[3]。核酸可以作为一种肿瘤标志物，比如循环肿瘤DNA(ctDNA)是从肿瘤细胞上脱落下来的游离在外周血部位的单碱基突变DNA[4]，携带有肿瘤细胞特异性的遗传信息，相对于正常人来说，它在癌症病人的血清中含量较高，若能在早期癌症患者的体内及时检出ctDNA，则会在很大程度上提高癌症治愈的几率。细菌或病毒病原体的侵入会造成人体受到感染，当病原体DNA发生核酸突变时，可能会使得病原体具备抗生素耐药性[5]，因此可通过检测病原体DNA来判断患者所感染的疾病。当核酸变异发生在基因组编码区时，可能会改变氨基酸序列和蛋白的功能，进而造成人体遗传性疾病的发生，因此对基因核酸的检测可预知遗传性疾病发生的概率。然而对于临床样品来说，核酸的浓度是很低的，比如ctDNA的浓度在μg/L和ng/L之间，病原体DNA的浓度处于pg/L的级别[6]，因此如何在实际样品中实现高灵敏度、高精度的核酸检测仍然是现存的难题之一。
传统的核酸检测方法主要为基于核酸的直接杂交，包括印迹杂交、斑点杂交、原位杂交和酶联免疫吸附测定等方法[7]，但这些方法大多费时费力，需要利用荧光或同位素进行标记，而且灵敏度普遍较低。随后发展了两种方法，即基因组测序技术和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)[8]，测序技术可用于大规模多重序列分析，无需提前知道所测的序列，这种方法可以得到人类基因组的数据，个体性的基因组差异促进了个体医疗的发展，但测序方法存在固有的误差率、耗时长、昂贵等缺点，无法做到全民普及；PCR方法可大量增加靶标核酸的拷贝数，具有高灵敏度，但易出现假阳性或假阴性的结果，不能进行多重分析，且需要复杂的操作和精密的仪器，尽管这两种是现临床常用的方法，但其局限性限制了它们的发展。基于此，发展了很多体外扩增的方法来尽量规避这些缺点，同时降低检测限，提高灵敏度和准确性。体外扩增技术通常包括两类，分别是酶辅助的体外扩增技术和无酶参与的体外扩增技术。酶辅助的体外扩增技术包括滚环扩增反应(rollingcircle amplification，RCA)[9]、连接酶链式反应(helicase-dependent amplification，HDA)[10]、环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[11]和酶辅助的靶标循环放大方法(enzyme-assisted target recycling，EATR)[12]等，由于这些反应均需要酶的参与，而酶的活性易受外界储存、运输和处理等条件的影响，影响反应的正常进行，因此酶辅助的扩增技术所需的反应条件比较苛刻，费用高。另外，无酶参与的体外扩增技术包括杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)[13]、链置换反应(stranddisplacement reaction，SDR)[14]、催化发卡组装(catalytic hairpin assembly，CHA)[15]和DNA酶介导的反应(DNAzyme-mediated assays)[16]，但这些方法对DNA序列的设计要求较高，需要DNA二级结构在一定条件下发生精确的动态响应，这些复杂的要求和扩增方法无疑增加了设计和实施的难度。
由于现有的核酸检测方法依然存在很多局限性，因此需开发新的方法实现靶标触发的信号级联放大的核酸检测。
参考文献
1.Smith,S.J.,C.R.Nemr,and S.O.Kelley,Chemistry-driven approaches forultrasensitive nucleic acid detection.Journal of the American ChemicalSociety,2017.139(3):p.1020-1028.
2.Jayanthi,V.,A.B.Das,and U.Saxena,Recent advances in biosensordevelopment for the detection of cancer biomarkers.Biosensors andBioelectronics,2017.91:p.15-23.
3.Wu,L.and X.Qu,Cancer biomarker detection:recent achievements andchallenges.Chemical Society Reviews,2015.44(10):p.2963-2997.
4.Alix-Panabieres,C.and K.Pantel,Clinical applications of circulatingtumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.Cancer Discovery,2016.6(5):p.479-491.
5.Chen,S.X.,D.Y.Zhang,and G.Seelig,Conditionally fluorescentmolecular probes for detecting single base changes in double-strandedDNA.Nature Chemistry,2013.5(9):p.782-789.
6.Labib,M.,E.H.Sargent,and S.O.Kelley,Electrochemical methods for theanalysis of clinically relevant biomolecules.Chemical Reviews,2016.116(16):p.9001-9090.
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8.Khodakov,D.,C.Wang,and D.Y.Zhang,Diagnostics based on nucleic acidsequence variant profiling:PCR,hybridization,and NGS approaches.Advanced DrugDelivery Reviews,2016.105(PtA):p.3-19.
9.Ali,M.M.,et al.,Rolling circle amplification:a versatile tool forchemical biology,materials science and medicine.Chemical Society Reviews,2014.43(10):p.3324-3341.
10.Zhao,Y.,et al.,Isothermal amplification of nucleic acids.ChemicalReviews,2015.115(22):p.12491-12545.
11.Hartman,M.R.,et al.,Point-of-care nucleic acid detection usingnanotechnology.Nanoscale,2013.5(21):p.10141-10154.
12.Gerasimova,Y.V.and D.M.Kolpashchikov,Enzyme-assisted targetrecycling(EATR)for nucleic acid detection.Chemical Society Reviews,2014.43:p.6405-6438.
13.Xu,G.,et al.,Cycling of rational hybridization chain reaction toenable enzyme-free DNA-based clinical diagnosis.ACS Nano,2018.12(7):p.7213-7219.
14.Wang,D.,et al.,Highly selective detection of single-nucleotidepolymorphisms using a quartz crystal microbalance biosensor based on thetoehold-mediated strand displacement reaction.Analytical Chemistry,2012.84(16):p.7008-7014.
15.Zhou,H.,et al.,Optical nano-biosensing interface via nucleic acidamplification strategy:construction and application.Chemical Society Reviews,2018.47(6):p.1996-2019.
16.Peng,H.,et al.,DNAzyme-mediated assays for amplified detection ofnucleic acids and proteins.Analytical Chemistry,2018.90(1):p.190-207.
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种定性的、基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法。
本发明的技术方案概述如下：
基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，包括如下步骤：
(1)制备一种n枝状DNA：
设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝3或4；
第1条DNA单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第2条DNA单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第n条DNA单链从3'端到5'端，分为n-1段、n-2段和n-3段，n-1段和n-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；n-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第n条DNA单链的n-1段核苷酸序列反向互补配对；
第n条DNA单链的n-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第n条DNA单链的n-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；
(2)制备一种m枝状DNA：
设计并合成均带有相同的粘性末端的、不同于步骤(1)粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝3或4；
第1条DNA单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第2条DNA单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第m条DNA单链从5'端到3'端，分为m-1段、m-2段和m-3段，m-1段和m-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；m-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第m条DNA单链的m-1段核苷酸序列反向互补配对；
第m条DNA单链的m-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第m条DNA单链的m-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；
(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，所述核酸探针分子的核苷酸从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，共有核苷酸21-25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸，p-2段核苷酸数为11-15个，p-2可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；
(4)在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种n枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种m枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定；
(5)重复步骤(4)，直至加入一种n枝状DNA或一种m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。
本发明的优点：
本发明的基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，操作简便，无需酶的参与，无需分子标记，成本低廉，适用范围广泛，由于DNA序列的可编程性使得该检测方法可针对于特定的核酸序列来设计，同时其级联放大的特点使其具有很好的灵敏性和准确度，该检测方法可应用于生物传感器、分子检测等领域。
附图说明
图1为验证合成n枝状DNA和m枝状DNA的电泳图(n＝4，m＝4)，其中M：marker；1：单链DNA(SEQ ID NO.1)；2：实施例1中的n枝状DNA；实施例1中的m枝状DNA。
图2为待测靶标触发的信号级联放大的核酸检测信号图。
具体实施方式
生物传感器以石英晶体微天平为例。
n枝状DNA和m枝状DNA是两种不同粘性末端的枝状DNA。
n枝状DNA和m枝状DNA的粘性末端是根据待测靶标分子的序列设计的，例如选择肿瘤标记物为待测靶标分子，利用本发明的方法可以检测样本中肿瘤标记物的存在与否。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
(1)制备n枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝4；
表1.制备n枝状DNA的单链序列；n＝4
Figure BDA0002143178860000061
第1条DNA单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第2条DNA单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第3条DNA单链从3'端到5'端，分为3-1段、3-2段和3-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个；3-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第4条DNA单链从3'端到5'端，分为4-1段、4-2段和4-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，4-1段和4-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个；4-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3条DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；
第3条DNA单链的3-2段核苷酸序列与第4条DNA单链的4-1段核苷酸序列反向互补配对；
第4条DNA单链的4-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第3条DNA单链的3-3段核苷酸序列、第4条DNA单链的4-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；n＝4；
(2)制备m枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝4；
表2.制备m枝状DNA的单链序列，m＝4
Figure BDA0002143178860000071
第1条DNA单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第2条DNA单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第3条DNA单链从5'端到3'端，分为3-1段、3-2段和3-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；3-1段和3-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个；3-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第4条DNA单链从5'端到3'端，分为4-1段、4-2段和4-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；4-1段和4-2段之和的DNA单链的核苷酸数为36个；4-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计51个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第3条DNA单链的3-1段核苷酸序列反向互补配对；
第3条DNA单链的3-2段核苷酸序列与第4条DNA单链的4-1段核苷酸序列反向互补配对；
第4条DNA单链的4-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第3条DNA单链的3-3段核苷酸序列、第4条DNA单链的4-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；m＝4；
n枝状DNA和m枝状DNA的合成结果见图1；
(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子SEQ ID NO.22通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：
表3.5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列
Figure BDA0002143178860000081
a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为15个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；
b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μM的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μM，并加入终浓度为1mM的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；
c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在H2O、H2O2和NH3·H2O体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，N2吹干；
c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μL滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mM 6-巯基-1-己醇(MCH)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；
(4)
a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子SEQ ID NO.23的总碱基数为30个，分为两部分，5'端的15个碱基与n枝状DNA的粘性末端互补配对，3'端的15个碱基与核酸探针分子、m枝状DNA的粘性末端均互补配对；n＝4；m＝4；
b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
c.加入n枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝4；
d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
e.加入m枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝4；
f.重复步骤a-e，直至加入n枝状DNA或m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝4；m＝4。
靶标触发的级联放大的核酸检测信号，见图2。从图2中可知，待测样品中含有靶标核酸分子。
实施例2
(1)制备n枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝3；
表4.制备n枝状DNA的单链序列，n＝3
Figure BDA0002143178860000101
第9条DNA单链从3'端到5'端，分为9-1段、9-2段和9-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；9-1段和9-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个，9-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第10条DNA单链从3'端到5'端，分为10-1段、10-2段和10-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；10-1段和10-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个，10-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第11条DNA单链从3'端到5'端，分为11-1段、11-2段和11-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，11-1段和11-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个；11-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第9条DNA单链的9-2段核苷酸序列与第10条DNA单链的10-1段核苷酸序列反向互补配对；
第10条DNA单链的10-2段核苷酸序列与第11条DNA单链的11-1段核苷酸序列反向互补配对；
第11条DNA单链的11-2段核苷酸序列与第9条DNA单链的9-1段核苷酸序列反向互补配对；
第9条DNA单链的9-3段核苷酸序列、第10条DNA单链的10-3段核苷酸序列、第11条DNA单链的11-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；n＝3；
(2)制备m枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝3；
表5.制备m枝状DNA的单链序列，m＝3
Figure BDA0002143178860000111
第12条DNA单链从5'端到3'端，分为12-1段、12-2段和12-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；12-1段和12-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个，12-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第13条DNA单链从5'端到3'端，分为13-1段、13-2段和13-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；13-1段和13-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个，13-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第14条DNA单链从5'端到3'端，分为14-1段、14-2段和14-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；14-1段和14-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28个；14-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11个，共计39个；
第12条DNA单链的12-2段核苷酸序列与第13条DNA单链的13-1段核苷酸序列反向互补配对；
第13条DNA单链的13-2段核苷酸序列与第14条DNA单链的14-1段核苷酸序列反向互补配对；
第14条DNA单链的3-2段核苷酸序列与第12条DNA单链的12-1段核苷酸序列反向互补配对；
第12条DNA单链的12-3段核苷酸序列、第13条DNA单链的13-3段核苷酸序列、第14条DNA单链的14-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；m＝3；
(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子SEQ ID NO.24通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：
表6. 5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列
Figure BDA0002143178860000121
a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸21个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为11个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；
b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μM的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μM，并加入终浓度为1mM的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；
c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在H2O、H2O2和NH3·H2O体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，N2吹干；
c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μL滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mM 6-巯基-1-己醇(MCH)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；
(4)
a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子SEQ ID NO.25的总碱
基数为22个，分为两部分，5'端的11个碱基与n枝状DNA的粘性末端互补配对，3'
端的11个碱基与核酸探针分子、m枝状DNA的粘性末端均互补配对；n＝3；m＝3；
b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
c.加入n枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝3；
d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
e.加入m枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝3；
f.重复步骤a-e，直至加入n枝状DNA或m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝3；m＝3。
实施例3
(1)制备n枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝4；
表7.制备n枝状DNA的单链序列；n＝4
Figure BDA0002143178860000131
第15条DNA单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；15-1段和15-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第16条DNA单链从3'端到5'端，分为16-1段、16-2段和16-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示；16-1段和16-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个，16-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第17条DNA单链从3'端到5'端，分为17-1段、17-2段和17-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，17-1段和17-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个；17-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第18条DNA单链从3'端到5'端，分为18-1段、18-2段和18-3段，分别用加重下划线、双下划线和单下划线表示，18-1段和18-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个；18-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第15条DNA单链的15-2段核苷酸序列与第16条DNA单链的16-1段核苷酸序列反向互补配对；
第16条DNA单链的16-2段核苷酸序列与第17条DNA单链的17-1段核苷酸序列反向互补配对；
第17条DNA单链的17-2段核苷酸序列与第18条DNA单链的18-1段核苷酸序列反向互补配对；
第18条DNA单链的18-2段核苷酸序列与第15条DNA单链的15-1段核苷酸序列反向互补配对；
第15条DNA单链的15-3段核苷酸序列、第16条DNA单链的16-3段核苷酸序列、第17条DNA单链的17-3段核苷酸序列、第18条DNA单链的18-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；n＝4；
(2)制备m枝状DNA，包括如下步骤：
设计并合成均带有相同的粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝3；
表8.制备m枝状DNA的单链序列，m＝3
Figure BDA0002143178860000141
第19条DNA单链从5'端到3'端，分为19-1段、19-2段和19-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；19-1段和19-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第20条DNA单链从5'端到3'端，分为20-1段、20-2段和20-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；20-1段和20-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个，20-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第21条DNA单链从5'端到3'端，分为21-1段、21-2段和21-3段，分别用点划线、曲线和虚线表示；21-1段和21-2段之和的DNA单链的核苷酸数为44个；21-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为15个，共计59个；
第19条DNA单链的19-2段核苷酸序列与第20条DNA单链的20-1段核苷酸序列反向互补配对；
第20条DNA单链的20-2段核苷酸序列与第21条DNA单链的21-1段核苷酸序列反向互补配对；
第21条DNA单链的21-2段核苷酸序列与第19条DNA单链的19-1段核苷酸序列反向互补配对；
第19条DNA单链的19-3段核苷酸序列、第20条DNA单链的20-3段核苷酸序列、第21条DNA单链的21-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；m＝3；
(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子SEQ ID NO.26通过巯基连接在金基底表面，包括如下步骤：
表9. 5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子的序列
Figure BDA0002143178860000151
a.所述的5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，分别用单划线和双划线表示，共有核苷酸25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸；p-2段核苷酸数为15个，可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；
b.将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子溶于水中，振荡，得到终浓度为100μM的核酸探针分子溶液；将核酸探针分子溶液稀释至0.1μM，并加入终浓度为1mM的三(2-羧乙基)膦，振荡1h；
c.选用石英晶体微天平作为生物传感器，金芯片作为基底，将金基底浸泡在H2O、H2O2和NH3·H2O体积比为5:1:1的溶液中，在75℃水浴锅中处理5min，然后分别用水和乙醇清洗三次，N2吹干；
c.取步骤b处理过的核酸探针分子溶液200μL滴加在金基底表面，37℃条件下静置16h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；随后将固定有核酸探针分子的金基底浸泡在1mM 6-巯基-1-己醇(MCH)溶液中1h，然后用水和乙醇分别清洗三次，N2吹干；
(4)
a.选用石英晶体微天平为生物传感器；所述的待测靶标核酸分子SEQ ID NO.27的总碱基数为30个，分为两部分，5'端的15个碱基与n枝状DNA的粘性末端互补配对，3'端的15个碱基与核酸探针分子、m枝状DNA的粘性末端均互补配对；n＝4；m＝3；
b.在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
c.加入n枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；n＝4；
d.加入待测靶标核酸分子，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；
e.加入m枝状DNA，浓度为0.1μM，通入体积为2mL，反应约20min，至生物传感器检测信号稳定；m＝3；
f.重复步骤a-e，直至加入n枝状DNA或m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号；n＝4；m＝3。
序列表
<110> 天津大学
<120> 基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttgtgaat gaagagctca tccatgccta gactggcgat aagtagccag c 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttttgtgaat gaagagctca gcaagcgtta tgcgtctagg catggatgag c 51
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttgtgaat gaagagctct ggtatgcatg tcggcataac gcttgctgag c 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttttgtgaat gaagagctgg ctacttatcg ccacgacatg cataccagag c 51
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaccgatga atagcggtca gatccgtacc tactcggcca atgttcagat g 51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagtaggta cggatctgcg tattgcgaac gactcggcca atgttcagat g 51
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgagtcgttc gcaatacggc tgtacgtatg gtctcggcca atgttcagat g 51
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgagaccata cgtacagcac cgctattcat cggtcggcca atgttcagat g 51
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattacttga acacgctgtc ctaaccatga ccgtcgaag 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gattacttga acttcgacgg tcatgtacta gatcagagg 39
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gattacttga acctctgatc tagtagttag gacagcgtg 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacgctgtcc taaccatgac cgtcgaagag cctatcctg 39
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttcgacggt catgtactag atcagaggag cctatcctg 39
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cctctgatct agtagttagg acagcgtgag cctatcctg 39
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttttgtgaat gaagagctca tccatgccta gacagactgg ctggcgataa gtagccagc 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttttgtgaat gaagagctca gcaagcgtta tgcatgcgtc tgtctaggca tggatgagc 59
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttttgtgaat gaagagctct ggtatgcatg tcggtcggca tgcataacgc ttgctgagc 59
<210> 18
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttttgtgaat gaagagctgg ctacttatcg ccagccacga ccgacatgca taccagagc 59
<210> 19
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cacgctgtcc taacgtccta accatgaccg catgaccgtc gaaggccaat gttcagatg 59
<210> 20
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttcgacggt catgcggtca tgtactagat tactagatca gagggccaat gttcagatg 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cctctgatct agtaatctag tagttaggac gttaggacag cgtggccaat gttcagatg 59
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaaaaaaaaa gccaatgttc agatg 25
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcttcattca caaaacatct gaacattggc 30
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaaaaaaaaa tcaacatcag t 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaaaaaaaaa gccaatgttc agatg 25
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcttcattca caaaacatct gaacattggc 30

Claims (1)

1.基于枝状DNA的靶标触发信号级联放大的核酸检测方法，其特征是包括如下步骤：
(1)制备一种n枝状DNA：
设计并合成均带有相同的粘性末端的n条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到n份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；n＝3或4；
第1条DNA单链从3'端到5'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第2条DNA单链从3'端到5'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第n条DNA单链从3'端到5'端，分为n-1段、n-2段和n-3段，n-1段和n-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；n-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第n条DNA单链的n-1段核苷酸序列反向互补配对；
第n条DNA单链的n-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第n条DNA单链的n-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的5'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的n份DNA单链水溶液，按照n条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到n枝状DNA；
(2)制备一种m枝状DNA：
设计并合成均带有相同的粘性末端的、不同于步骤(1)粘性末端的m条DNA单链；分别溶于水中，振荡，得到m份终浓度为100μM的DNA单链水溶液；m＝3或4；
第1条DNA单链从5'端到3'端，分为1-1段、1-2段和1-3段；1-1段和1-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，1-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第2条DNA单链从5'端到3'端，分为2-1段、2-2段和2-3段；2-1段和2-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个，2-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第m条DNA单链从5'端到3'端，分为m-1段、m-2段和m-3段，m-1段和m-2段之和的DNA单链的核苷酸数为28-44个；m-3段的DNA单链为粘性末端，其核苷酸数为11-15个，共计39-59个；
第1条DNA单链的1-2段核苷酸序列与第2条DNA单链的2-1段核苷酸序列反向互补配对；
第2条DNA单链的2-2段核苷酸序列与第m条DNA单链的m-1段核苷酸序列反向互补配对；
第m条DNA单链的m-2段核苷酸序列与第1条DNA单链的1-1段核苷酸序列反向互补配对；
第1条DNA单链的1-3段核苷酸序列、第2条DNA单链的2-3段核苷酸序列、第m条DNA单链的m-3段核苷酸序列与待测靶标核酸分子的3'端的一半序列均反向互补配对；
取等体积的m份DNA单链水溶液，按照m条DNA单链的等摩尔比混合，加入终浓度为80mM的NaCl水溶液，加热至95℃再降至室温，制备得到m枝状DNA；
(3)将5'端修饰有巯基基团的核酸探针分子通过巯基连接在金基底表面，所述核酸探针分子的核苷酸从5'端到3'端分为p-1段和p-2段，共有核苷酸21-25个；p-1段核苷酸数为10个，均为腺嘌呤核苷酸，p-2段核苷酸数为11-15个，p-2可与待测靶标核酸分子3'端的一半序列互补配对；
(4)在步骤(3)获得的连接有核酸探针分子的金基底加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种n枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入待测靶标核酸分子，反应，至生物传感器检测信号稳定，加入一种m枝状DNA，反应，至生物传感器检测信号稳定；
(5)重复步骤(4)，直至加入一种n枝状DNA或一种m枝状DNA后生物传感器检测信号不再波动，最终显示出级联放大的待测靶标核酸分子检测信号。
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