CN110468182B - 一种检测血小板衍生生长因子bb的均相生物分析方法及其应用 - Google Patents

一种检测血小板衍生生长因子bb的均相生物分析方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用，利用两条核酸适配体S1和S2与PDGF‑BB之间的夹心识别反应，得到一种含有Mg2+核酸酶的功能核酸结构；再通过引入两个由G‑四链体DNA酶和另外一种Mg2+核酸酶的1/2劈开碱基序列组成的发夹结构DNA，以及连接DNA，利用Mg2+激活其核酸酶催化剪切作用来实现目标物循环及发夹结构中设计的G‑四链体DNA酶的双重放大释放；利用G‑四链体DNA酶的催化显色反应构建显色产物吸光度与PDGF‑BB分析物浓度之间的定量关系；本发明方法操作简单，成本低廉，灵敏度高，重复性好，对于临床诊断领域蛋白质标记物的方便、自动化检测具有十分重要的应用价值。

Description

一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其 应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术领域，具体是一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法及其应用。
背景技术
血小板衍生生长因子（PDGF）是一类由细胞产生的重要促血管生成肽类生长因子和多种细胞的促有丝分裂剂及趋化因子。PDGF家族在胚胎正常发育、细胞生长分化和对机体组织损伤的反应中起着关键作用，肿瘤的发生、发展及动脉粥样硬化等许多病理过程均与PDGF及其受体的异常活性相关。研究表明，PDGF-BB是最早被发现的结缔组织生长因子之一，它的浓度高低与肿瘤的发生、发展关系甚为密切，因此是多种肿瘤治疗及预后处理的靶向生物标志物。
传统方法一般采用基于抗体的酶联免疫吸附法(ELISA)和放射性同位素法等来进行PDGF-BB的检测。由于抗体的成本较高，稳定性较低，而且这些方法一般操作比较复杂，所用仪器较为昂贵，通常还存在分析灵敏度不高或选择性不好的弊端，因而很难满足其在实际样品分析检测领域中的广泛应用。近年来，人们将各种生物信号放大策略与电化学、比色等分析方法相结合，在可用于复杂基质中生长因子方便、灵敏检测的生物分析方法研究方面开展了大量工作。但是，这些方法一般都是基于异相分析模式而构建，往往需要十分繁琐的固相界面修饰，以及多步温育、分离和洗涤操作，甚至还需要结合纳米材料信号放大来提高其分析灵敏度，因而不仅分析时间较长，操作繁琐，而且多步操作还会在一定程度上影响方法的重复性，提高分析成本。因此，在此基础上发展一种操作简单，且具有灵敏度高、准确性好、成本低廉等优良性能的智能型细胞因子生物分析新方法具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是针对传统PDGF-BB检测方法操作繁琐、灵敏度较低、分析成本较高、重复性不好等问题，提供一种基于碱基设计及核酸适配体高特异性生物识别作用的PDGF-BB均相生物分析新方法，该方法操作方便，成本低廉，灵敏度高，稳定性好，对操作人员的技术要求低，可简单用于复杂基质中低丰度PDGF-BB分析物的高选择性、高准确度检测，对于实际应用领域中的靶向分析物现场、智能化分析具有很好的应用价值。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一种检测血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）的均相生物分析方法，包括以下步骤：
（1）DNA链的高温退火处理
取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5，向每个PV管中加入190µL浓度为20mMpH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl2；
接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’；
再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2，所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TACTCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3’；
向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1，所述探针H1中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H1的碱基序列为5’- GCCCT ACC CAA GCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2，所述探针H2中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H2的碱基序列为5’- TTTGGG TAG GGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAAA-3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA（Linker）溶液，所述连接DNA（Linker）溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’；
将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用；再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用；
（2）均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量
取6个PV管，向每个PV管中均加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，于37℃涡旋混匀反应120min；再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系；
（3）样品中血小板衍生生长因子BB含量的检测
取处理后的样品溶液10µL，向其中加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，于37℃涡旋混匀反应120min；再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（2）中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中血小板衍生生长因子BB的含量。
本发明还提供了一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法在检测样品中血小板衍生生长因子BB中的应用。
本发明的工作原理是：通过碱基设计，在目标分析物PDGF-BB的两条核酸适配体S1和S2末端各修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基序列，利用S1和S2对PDGF-BB的特异性识别引起的邻位触及反应，形成S1/PDGF-BB/S2来引发对分别由G-四链体DNA酶和另外一种Mg2+核酸酶的1/2劈开碱基序列（L1和L2）组成的发夹结构DNA H1和H2的特异性杂交结合形成复合物S1/PDGF-BB/S2-H1和S1/PDGF-BB/S2-H2，利用Mg2+来催化剪切生成的复合物中的Mg2+功能核酸结构可以高效释放出S1/PDGF-BB/S2进行目标物循环、以及H1和H2中设计的可用于催化比色信号转导的G-四链体DNA酶和Mg2+核酸酶的两段1/2劈开碱基序列L1及L2。此外，再通过引入一段连接DNA (Linker)来与上述反应释放的Mg2+核酸酶的两段1/2劈开碱基序列L1和L2进行杂交反应以形成第二种Mg2+核酸酶L1/Linker/L2，而L1/Linker/L2还可以进一步引发H1和H2的杂交结合形成L1/Linker/L2-H1与L1/Linker/L2-H2以及Mg2+核酸酶催化释放出H1和H2中设计的高含量的G-四链体DNA酶，从而有效实现其比色信号放大和方法分析灵敏度的提高。利用PDGF-BB的高特异性核酸适配体识别，以及Mg2+核酸酶催化反应引起的目标物循环及设计于发夹DNA中的G-四链体DNA酶的双重放大释放，即可成功构建G-四链体DNA酶催化2,2´-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸/过氧化氢（ABTS/H2O2）体系显色产物吸光度与血小板衍生生长因子分析物浓度之间的定量关系。
本发明采用的核酸适配体不仅较传统抗体具有稳定性更好、成本更为低廉等优点，而且核酸适配体与PDGF-BB分析物之间更好的特异性识别作用可以很高保证该方法在复杂基质分析中的优良选择性；高效核酸酶催化反应引起的目标物循环及其释放的DNA酶的催化显色反应使得该方法拥有很高的分析灵敏度，因而避免了传统方法中复杂的纳米材料制备及其信号放大过程中可能引起的非特异性吸附影响；更重要的是，基于碱基设计的全部生物识别反应、循环信号放大及DNA酶形成都在均相溶液中一步进行，不仅操作十分简单，完全派出了非均质生物测定中繁琐的多步操作和较高的实验技术要求，而且很好保证了方法的重复性，因而较传统方法具有十分突出的优越性和实用价值。
本发明构建的生物传感方法可以方便、简单地用于PDGF-BB含量的高选择性检测，具有灵敏度高、线性范围宽、检测成本低廉等优良性能，可在2pg/mL-20ng/mL浓度范围内实现对血小板衍生生长因子的定量响应和准确测定，很好克服了传统方法操作繁琐、灵敏度较低、分析成本较高、重复性不好等缺陷。
附图说明
图1是本发明的检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法，包括以下步骤：
（1）DNA链的高温退火处理
取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5，向每个PV管中加入190µL浓度为20mMpH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl2；
接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’；
再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2，所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TACTCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3’；
向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1，所述探针H1中包含有G-四链体结构，探针H1的碱基序列为5’- GC CCT ACC CAAGCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2，所述探针H2中包含有G-四链体结构，探针H2的碱基序列为5’- TTT GGG TAGGGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAA A-3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA（Linker）溶液，所述连接DNA（Linker）溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’；
将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用；再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用；
（2）均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量
取6个PV管，向每个PV管中均加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，于37℃涡旋混匀反应120min；再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，得到PDGF-BB标准溶液的工作曲线，见下表1。
表1 血小板衍生生长因子BB标准溶液工作曲线
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 人血清中PDGF-BB含量的检测
取临床血清样品500µL，用20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液稀释50倍得到稀释后的样品溶液，该缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl。
取稀释后的样品溶液10µL，向其中加入经实施例1步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，于37℃涡旋混匀反应120min；再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% TritonX-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mMH2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据实施例1的步骤（2）中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中血小板衍生生长因子BB的含量。
检测结果表明，该血清样品溶液中无PDGF-BB检出。
实施例3
向实施例2中的血清样品溶液中加入血小板衍生生长因子BB标准溶液，进行加标回收实验，每个浓度做5组平行实验。加标回收实验的样品处理方法同标准溶液，将处理后的溶液利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据实施例1的步骤（2）中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，计算出加标回收样品溶液中血小板衍生生长因子BB的含量，得到的实验结果参见下表2。
表2 血清样品溶液的加标回收实验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从上表2可以看出，本实施例3测试结果的相对标准偏差（RSD）为2.2-3.5%，加标回收率98.0-102.2%，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

Claims (2)

1.一种用于非诊断目的的检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）DNA链的高温退火处理
取5个PV管并分别编号为#1、#2、#3、#4和#5，向每个PV管中加入190µL浓度为20mM pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有100mM NaCl、10mMKCl和10mMMgCl2；
接着向#1PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S1，所述核酸适配体S1的碱基序列为5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TGT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT AGAGTA AGC ACC CAT GTT AGA CCT C-3’；
再向#2 PV管中加入10µL浓度为10µM末端修饰一段Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列的PDGF-BB核酸适配体S2，所述核酸适配体S2的碱基序列为5’-CCT GCT CAG CGA TCT TACTCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT CAG GCT ACG GCA CGT AGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3’；
向#3 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H1，所述探针H1中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H1的碱基序列为5’- GC CCTACC CAA GCG ATT AAC GAG GTC (rA) AGC AGG GGG TAG GGC GG GTT GGG A -3’，其中H1中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#4 PV管中加入10µL浓度为10µM的Mg2+核酸酶1/2劈开碱基系列组成的发夹结构DNA探针H2，所述探针H2中包含有G-四链体DNA酶功能结构，探针H2的碱基序列为5’- TTT GGGTAG GGC GGG TTG GGA GAG GTC (rA) AGC AGG T GTT ACA CCC ATG T CT ACC CAA A-3’，其中H2中的rA表示该位置的腺苷核糖核酸，其余均为脱氧核糖核酸；
向#5 PV管中加入10µL浓度为10µM的连接DNA溶液，所述连接DNA溶液的碱基系列为5’-GAC CTC CCT GCT-3’；
将#1、#2和#5 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后迅速降温至室温，分别得到单链DNA溶液S1、单链DNA溶液S2和连接DNA溶液待用；再将#3和#4 PV管中的溶液加热至95℃，保持5min后缓慢降温2h至室温，分别得到稳定的发夹茎环结构DNA溶液H1、DNA溶液H2待用；
（2）均相反应测定标准溶液中血小板衍生生长因子BB的含量
取6个PV管，向每个PV管中均加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，再向6个PV管中分别加入10µL含有PDGF-BB的浓度梯度为0、0.002ng/mL、0.02ng/mL、0.2ng/mL、2ng/mL和20ng/mL 20mM的pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2和10mM KCl，于37℃涡旋混匀反应120min；再向每个PV管中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mMMgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1% DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向每个PV管中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mM pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mM KCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，以建立吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系；
（3）样品中血小板衍生生长因子BB含量的检测
取处理后的样品溶液10µL，向其中加入经步骤（1）高温退火后的10μL单链DNA溶液S1、10μL单链DNA溶液S2、10μL连接DNA溶液、10μL DNA溶液H1和10μL DNA溶液H2，于37℃涡旋混匀反应120min；再向其中加入含有10µL 20µM氯化血红素的25mM pH=7.4 HEPES缓冲溶液，该HEPES缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2、10mM KCl、0.05% Triton X-10和1%DMSO，于37℃涡旋混匀反应50min；接着向其中加入20µL含有20mM ABTS、40mM H2O2的20mMpH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液，该Tris-HCl缓冲溶液中还含有100mM NaCl、10mM MgCl2和10mMKCl，显色反应5min之后，利用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度值，根据步骤（2）中得到的吸光度与PDGF-BB浓度之间的定量关系，计算出样品溶液中血小板衍生生长因子的含量。
2.如权利要求1所述的一种用于非诊断目的的检测血小板衍生生长因子BB的均相生物分析方法在检测样品中血小板衍生生长因子BB中的应用。
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