CN108588203B - 一种基于dna酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用；荧光检测试剂盒由荧光探针、金属离子、荧光染料、缓冲溶液组成；使用荧光探针为分子识别元件对目标分子进行特异性识别，其中，DNA酶基底序列中锁住的G‑四链体可以被DNA酶在Mg2+存在下切割，加入钾离子与荧光染料后就可以产生显著的荧光响应，该信号可用于灵敏检测多个目标物，检测限低至70pM。与蛋白质酶切割策略相比，我们开发的方法具有免标记、简单、经济、灵敏度高、稳定性好等优点。所述试剂盒探针的设计具有高度的灵活性，可通过类似的设计方便的应用于检测其它核酸、酶等生物分子。

Description

一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用，属于分子检测领域。
背景技术
核酸与各种生命过程息息相关，精确检测核酸在药品开发和医学研究等领域具有重要作用。然而在传统的核酸检测方法需要用到蛋白质酶，其成本高，且所用探针必须具有特异性识别位点，其用于检测时反应条件复杂，这限制了蛋白质酶在分析检测中的应用。与蛋白质酶相比，DNA酶具有一些实际优势，比如具有高度的裂解活性，稳定性好，非特异性反应低，制备简单等特点，所以现在已成为生物传感领域的研究热点之一。
目前，DNA酶由于具有上述显著优势，已经在核酸分析中得到应用。Chai小组构建了一种基于DNA酶的双扩增电化学发光生物传感器来检测miRNA[Zhang,P.；Wu,X.；Yuan,R.；Chai,Y.Anal.Chem.2015,87,3202-3207]。然而，由于电化学检测的不稳定性和电极修饰的困难限制了其发展。另外，Chen课题组提出了一种免标记免酶的比色平台，用DNA酶和G四链体构建逻辑门来进行核酸的分析[Chen,J.；Pan,J.；Chen,S.Chem.Sci.2018,9,300-306]。然而，该方法必须与氧化还原反应相结合，实验程序复杂。此外，Kim课题组报道了一种基于氧化石墨烯(GO)和切割RNA的DNA酶来检测RNA中单核苷酸变化的荧光方法[Hong,C.；Kim,D.；Baek,A.；Chung,H.；Jung,W.；Kim,D.Chem.Commun.2015,51,5641-5644]，Yang小组提出了一种基于Au纳米粒子和可特异性识别Zn2+的DNA酶的DNA纳米机器来实现miRNA的检测[Liu,J.；Cui,M.；Zhou,H.；Yang,W.ACS sensors 2017,2,1847-1853.]。然而，这两种方法都需要荧光标记，高昂的检测成本和繁琐的标记步骤限制了这两种方法的发展与应用。
发明内容
为了克服现有技术中的缺点，改善上述核酸分子检测中检测成本高、步骤繁琐等问题，本发明的目的是在于提供一种低成本、高灵敏度、高选择性检测核酸的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒及其在核酸检测中的应用，荧光检测试剂盒由荧光探针、金属离子、荧光染料、缓冲溶液组成。
其中，所述的荧光探针包括三部分：
DNA酶1、DNA酶2、基底探针
探针序列如下：
DNA酶1:5'-CCATCTTTACCCGGTCGAAATAGTAACCCACCC-3'
DNA酶2:5'-CATCTCTTCTCCGAGCAGACAGTGTTA-3'
基底探针:5'-GGGTGGGTGGGTGGGTTACTAT/rA/GGAAGAGATG-3'
本专利中所使用到的金属离子为钾离子与镁离子，其中，钾离子用于与荧光染料结合发出荧光，镁离子用于DNA酶催化剪切位点。本专利中所用到的荧光染料为THT，所使用的缓冲溶液为Tris-EDTA缓冲溶液。
本发明提出了一种利用基于DNA酶的荧光检测试剂盒检测核酸分子的方法，其原理如下：
如图1所示，在该方案中，两种DNA酶1和DNA酶2包含区域II和II'，其对应于分裂的Mg2+依赖DNA酶的序列片段，区域I和I'与目标物序列互补配对。在目标物不存在的情况下，分裂的DNA酶，即DNA酶1和DNA酶2，在每条链末端与基底探针部分杂交，然后形成无活性的DNA酶。在加入目标物的情况下，分裂的DNA酶的区域I和I'可以与目标物结合，导致产生有活性的DNA酶。在Mg2+存在下，形成催化核心并且使活性DNA酶切割基底链，导致锁住的G-四链体序列(区域III)的释放。这些释放的G-四链体与ThT结合形成G-四链体/ThT二聚体并产生明显的荧光。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果在于：
1、设计的探针成本低廉，且易于获得，检测过程大大简化，无需繁琐的基材准备。
2、本发明设计的检测探针可用于快速筛查样本中是否含有目标物；试剂盒本身具有高的灵敏度和可重复性。
3、本发明设计的试剂盒对细胞裂解液样本中的靶标有较好的响应，且在类似序列中对目标序列有较好的区分度。
附图说明
【图1】为本发明的检测目标物方法的工作原理图。
【图2】为本实验中所需的探针序列。
【图3】为荧光法验证可行性(a)和G-四链体的圆二表征图(b)。
【图4】为探针比例、反应温度和时间的优化。
【图5】为通用型荧光法检测miRNA(a-b)和病毒DNA(c-d)的线性光谱图和线性方程。
【图6】为检测miRNA(a)和病毒DNA(b)选择性探究图。
【图7】实际样品中检测miRNA(a)和病毒DNA(b)图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒中检测探针体系的设计：
体系包括三个部分：DNA酶1和DNA酶2以及基底探针；
探针序列如下：
DNA酶1:5'-CCATCTTTACCCGGTCGAAATAGTAACCCACCC-3'
DNA酶2:5'-CATCTCTTCTCCGAGCAGACAGTGTTA-3'
基底探针:5'-GGGTGGGTGGGTGGGTTACTAT/rA/GGAAGAGATG-3'
实施例2
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒在核酸检测中的可行性测定
如图3a所示，设计的非基底探针的腺嘌呤是存在DNA中而非在RNA中，则其没有剪切识别位点。在不存在miRNA-141的情况下，DNA酶1和DNA酶2分别与基底探针和非基底探针结合。然后形成锁住的G-四链体和非活性DNA酶，产生弱荧光背景信号。随着miRNA-141的加入，形成稳定和具有活性的DNA酶。在Mg2+存在下，活性DNA酶可切割基底链，导致G-四链体序列的释放和荧光强度的增强。由于非基底探针不存在切割位点，非基底链不能被切割RNA的DNA酶切断，并伴随着低荧光强度的产生。上述结果进一步证明了所提出的方法可以识别目标物并激发切割RNA的DNA酶。接着用圆二色谱验证G-四链体结构。如图3b所示，在270nm左右存在平行G-四链体的特征正极峰，在245nm附近存在波谷，这是G-四链体的特征峰形。当加入目标物时，特征峰显着增加，因为DNA酶剪切后释放并形成了更多的G-四链体。
实施例3
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒在核酸分子检测中的探针比例、反应温度和时间的优化
为了提高方法的性能，我们优化了DNA酶1，DNA酶2和基底探针的浓度，杂交温度和反应时间。为了获得最佳的DNA酶催化活性，探针比例已经适当优化。如图4a所示，当DNA酶1，DNA酶2和基底探针的比例为5：6：6时，信号比性能最佳。因此，DNA酶1，DNA酶2和基底探针的浓度分别为500nM，600nM和600nM。考虑到温度会影响杂交反应效率，我们对反应温度进行了优化(图4b)，最佳杂交温度是37℃。随后，我们对反应时间进行了优化(图4c)，荧光变化随反应时间的延长而逐渐增加，并在2小时后达到平稳。因此，选择2小时为最佳反应时间。
实施例4
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒在核酸分子检测中的灵敏度分析
为了进一步验证该定量检测多目标物的策略的可用性，在最佳条件下加入并测量一系列不同浓度的miRNA-141和病毒亚型H5N1基因。如图5a所示，随着miRNA-141浓度的增加，其信号明显升高。然后，在图5b中，构建了校准曲线和良好的线性关系，其中miRNA-141浓度范围在1-500nM，相关方程为F-F0＝0.4407C+11.06(F0和F是分别没有和有目标的存在情况下的荧光强度，C代表miRNA-141浓度)，其相关系数R2＝0.9957。检测限计算为0.2nM。然后，这个通用型策略也被用于检测病毒H5N1基因。图5c显示荧光强度随着病毒H5N1基因浓度的增加而增加。如图5d所示，F-F0值随病毒H5N1基因浓度从1nM到400nM增加而增加，相关系数为0.9965。相关方程为F-F0＝1.173C+14.72(C为病毒H5N1基因浓度)，检测限为0.07nM。该策略对多个目标物具有宽线性范围和低检测限。因此，这个策略对于定量检测多个目标物显示出很好的灵敏度。
实施例5
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒在检测miRNA(a)和病毒DNA(b)中的选择性探究
为了研究该方法的特异性，使用miRNA-200家族中具有高度序列同源性的三种miRNA，如miRNA-429，miRNA-21和miRNA-200b来评估相同浓度和实验条件下试剂盒的特异性识别能力。如图6a所示，随着四种miRNA的加入，其他miRNA的荧光变化明显较低，但在miRNA-141存在下产生显著的荧光变化。另外，还记录了具有不同错配DNA序列的病毒H5N1基因的荧光变化。图6b显示由单碱基错配(SM)，双碱基错配(DM)，三碱基错配(TM)和非互补(NC)DNA链引起的荧光差值显著低于由病毒H5N1基因产生的荧光变化。以上结果表明这种通用方法具有高特异性。
实施例6
一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒用于检测实际样品中miRNA(a)和病毒DNA(b)
为了研究本方法在实际样品中的潜在应用，我们以22Rv1细胞和HeLa细胞为研究对象进行了相关检测实验。如图7a所示，随着22Rv1细胞裂解物的增加(细胞数从10万至100万)，可观察到荧光强度逐渐增强；而HeLa细胞的细胞裂解物引起的荧光增强较弱。所得结果证明两种细胞中miRNA-141的含量明显不同，这与以前的报道一致。我们还研究了所设计的试剂盒在人血清中的应用：将一系列不同浓度的目标病毒DNA加入到稀释100倍的人血清中，如图7b所示，由目标物病毒DNA产生的信号响应强度接近在缓冲液中获得的响应强度。这些研究结果表明，所述试剂盒可应用于实际样品中miRNA和病毒DNA的检测，这对于临床诊断有重要的意义，具有很大的应用潜力。

Claims (3)

1.一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒包含：
荧光探针、金属离子、荧光染料、缓冲溶液；
所述的荧光探针由三部分组成：
DNA酶1、DNA酶2、基底探针
其序列分别为:
DNA酶1:5'-CCATCTTTACCCGGTCGAAATAGTAACCCACCC-3'
DNA酶2:5'-CATCTCTTCTCCGAGCAGACAGTGTTA-3'
基底探针:5'-GGGTGGGTGGGTGGGTTACTAT/rA/GGAAGAGATG-3'；
所述的金属离子为钾离子和镁离子。
2.根据权利要求1所述的一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒，其特征在于：
所述的荧光染料为THT。
3.根据权利要求1所述的一种基于DNA酶的荧光检测试剂盒，其特征在于：
所述的缓冲溶液为Tris-EDTA缓冲溶液。
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