CN111118223A - 通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒。所述方法包括同时提取所述样品中DNA和RNA、在核酸扩增液中等温扩增提取的DNA和RNA和对核酸扩增产物进行检测。本发明的方法检测样本总核酸，增加靶标的量，提高检测的灵敏度；反应速度快，时间短，提高了检测效率，和特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法。
背景技术
分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的有无和多少，从而对人体状态和疾病作出诊断。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。目前的分子生物学检测技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)检测技术、Sanger测序技术和高通量测序技术、等温扩增技术等。
PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，现已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
sanger测序是第一代测序，它是使用的链终止法。Sanger测序作为30多年来惟一的DNA测序方法,对现代生物学研究起到了极大的促进作用。高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序,不再需要大肠杆菌进行体内扩增,而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序。根据其原理又可分为两类:聚合酶合成测序和连接酶合成测序。基于新一代测序的分子诊断市场是近年来临床诊断领域发展的热点，是体外诊断市场中发展速度最快的市场。随着老年人口的增加，医疗模式的转变，社会市场对测序分子诊断市场的需求不断增加，伴随着相关企业市场扩张和自身创新的需求，测序分子诊断市场面临前所未有的发展机遇。
等温扩增技术主要是基于恒定温度进行核酸扩增反应，克服了PCR扩增需要专用设备的方式。目前等温扩增的方法有多种，根据原理可以分为两种。第一类是反应依赖于特异性引物延伸的等温扩增技术；第二类是第一步反应依赖于限制性内切酶的等温扩增技术。目前使用较多的是第一种扩增技术，主要包括如依赖核酸序列的扩增、链置换扩增、滚环扩增、环介导恒温扩增、解旋酶依赖的扩增等多种恒温扩增技术。
上述列举的分子生物学检测技术，在进行检测之前都需要提取核酸，然后进行检测。都是通过直接或者间接的技术和方法使被检测的核酸分子能够在体外进行放大，从而实现检测。上述分子生物学技术都检测生命循环过程的一种靶标物质，DNA或者RNA。检测的目的，究其根本是为了确定检测靶标DNA或者RNA的有无和多少。目前的病原体检测，都是基于病原体主要遗传物质进行检测，如乙肝病毒核酸检测主要是针对乙型肝炎病毒的DNA，而人类免疫缺陷病毒核酸检测主要是针对人类免疫缺陷病毒的RNA，这些的检测目的都是通过检测主要的遗传物质实现对感染病原体的有无和多少进行确认。
发明内容
为进一步提高样本中核酸的检测灵敏度，本发明提供一种通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法，在所述方法种采用含逆转录酶和DNA聚合酶的等温扩增体系检测DNA为遗传物质的样品，所述方法包括以下步骤：步骤1：同时提取所述样品中DNA和RNA；步骤2：在核酸扩增液中等温扩增提取的DNA和RNA，所述核酸扩增液包括逆转录酶和用于等温扩增的DNA聚合酶，所述逆转录酶将提取的RNA逆转录反应生成cDNA和所述DNA聚合酶等温扩增反应提取的DNA和逆转录的cDNA；和步骤3：对核酸扩增产物进行检测。
在一种实施方式中，步骤2中在同一个温度下完成逆转录和核酸等温扩增反应。
在一种实施方式中，在步骤2中先在一温度下完成逆转录反应，然后在另一温度下完成核酸扩增反应。
在一种实施方式中，所述逆转录反应和/或等温扩增反应温度是37℃-65℃，优选为50℃-65℃。
在一种实施方式中，所述DNA聚合酶为具有链置换功能的DNA聚合酶，包括Bst DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。
在一种实施方式中，所述等温扩增为环介导等温扩增、重组酶聚合酶等温扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、交叉引物扩增技术、核酸依赖性扩增检测技术或切刻内切酶核酸等温扩增。
在一种实施方法，本发明提供在上述方法中使用的等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括：同时提取样品中DNA和RNA的提取试剂，和包括逆转录酶、用于等温扩增的DNA聚合酶、RNaseH以及扩增引物的核酸扩增试剂。
在一种实施方式中，本发明提供在上述方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包括：同时提取样品中DNA和RNA的提取试剂，和包括逆转录酶、用于等温扩增的DNA聚合酶、RNaseH酶、扩增引物F3、R3、FIP、BIP、LF、LB和含RNA碱基的扩增探针、dNTPs、甜菜碱。
在一种实施方式中，本发明提供型肝炎病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针，
，其中HBV-F3、HBV-B3、HBV-FI、HBV-BIP、HBV-LF和HBV-LB为扩增引物，HBV RNA-P为检测探针，其中探针HBV RNA-P的T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团；和，ATTB-OF3、ATTB-OR3、ATTB-FIP、ATTB-BIP、ATTB-LF和ATTB-LB为内参基因ATTB扩增引物，探针ATTB-ZrnaP为内参基因检测探针，T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团。
本发明利用DNA和RNA都是生物(RNA类病毒除外)生命过程中的一种遗传物质，按照中心法则，那么在检测生物物种的DNA时，样品中应该有RNA的存在。本发明采用含逆转录酶的一个温度或两个温扩通过等温增反应液检测待检测样本中的总核酸，包括DNA和RNA，一方面可提高检测的灵敏度，另一方面通过等温扩增，在不牺牲扩增效率的前提下简化检测流程，缩短检测的时间。
本发明在等温扩增体系中引入含RNA碱基的探针，相较染料法或显色法，含RNA碱基探针序列为靶基因特异性序列，检测特异性进一步提高；且探针在RNaseH的作用下5’端带荧光标记片段可继续作为引物而延伸形成产物，提高扩增产物量。
本发明的主要优点如下：检测样本总核酸，增加靶标的量，提高检测的灵敏度；反应速度快，时间短，10-45min即可完成反应，提高了检测效率；特异性高，特异性的引物探针确保无交叉或干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1表示实时等温检测体系检测HBV总核酸的检测结果图，其中A曲线表示样品HBV，B曲线表示内参IC；
图2表示实时等温检测体系检测HBV DNA的检测结果图，其中A曲线表示样品HBV，B曲线表示内参IC；和
图3表示RPA等温扩增体系检测肺炎支原体的检测结果图，其中1-2:总核酸检测体系检测样本1、样本2；3-4：DNA检测体系检测样本1、样本2；5：阳性对照；6：阴性对照。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例1：乙型肝炎病毒总核酸等温扩增试剂盒
以乙型肝炎病毒检测体系为例，用本发明的方法检测HBV总核酸，并比较加逆转录酶组(检测总核酸)与不加逆转录酶组(检测HBV DNA)对检测结果的差异，比较本发明与普通DNA扩增体系的灵敏度。具体方法包括如下步骤：
一、引物、探针的设计
根据HBV和内标核酸序列保守区域设计等温扩增的引物和探针，具体序列信息详见表1。
表1 HBV检测引物和探针序列
其中探针的T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团
表1中HBV-F3、HBV-B3、HBV-FI、HBV-BIP、HBV-LF和HBV-LB为HBV扩增引物，HBVRNA-P为HBV检测探针，其中探针HBV RNA-P的T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团；和，内参扩增引物ATTB-OF3、ATTB-OR3、ATTB-FIP、ATTB-BIP、ATTB-LF和ATTB-LB，内参选择外源植物叶绿素基因，探针ATTB-ZrnaP为内参基因检测探针，T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团。
二、血清样本总核酸提取
采用天根生化(北京)科技有限公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(离心柱法，(DP315)提取新鲜采集的血清样本总核酸。
三、扩增反应
为了比较本发明方法的检测灵敏度，总核酸检测体系中加入逆转录酶，DNA检测体系中未加入逆转录酶，其他组分相同。
1)总核酸检测体系：
1×等温扩增缓冲液，6mM MgSO4，1.4mM dNTPs、0.8μM FIP/BIP，0.4μM LF/LB，0.1μM LF/LB，0.2μM探针，8U Bst，12.5mU RNaseH，10U AMV。30μL反应体系，其中核酸模板加入10μL。
反应条件：50℃15min；63℃,30s，60cycles(每隔30s收集荧光)。
2)DNA检测体系：
1×等温扩增缓冲液，6mM MgSO4，1.4mM dNTPs、0.8μM FIP/BIP，0.4μM LF/LB，0.1μM LF/LB，0.2μM探针，8U Bst，12.5mU RNaseH。30μL反应体系，其中核酸模板加入10μL。
反应条件：63℃,30s，60cycles(每隔30s收集荧光)。
四、检测结果
1)试剂盒内质控
阴性对照品：FAM通道应无扩增曲线，VIC(HEX)通道Tt值应小于40；
阳性对照品：FAM通道应有明显扩增曲线且Tt值应不大于40。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
2)根据扩增曲线分别设置FAM通道和VIC(HEX)通道的基线和阈值，分析FAM通道的Tt值(Tt值为扩增曲线与阈值线交点的横坐标读数)。
3)检测总核酸组和检测DNA组检测10例HBV血清样本的结果见表1。
图1表示两温检测体系检测HBV总核酸的检测结果图；A：HBV(FAM通道)B:内标(VIC通道)；
图2表示两温检测体系检测HBV DNA的检测结果图；A：HBV(FAM通道)B:内标(VIC通道)；
表1.10例HBV血清检测的Tt值
从以上检测结果可看出，10例样本其中6例阳性，含逆转录酶扩增体系(总核酸组)6例均检测为阳性，而DNA检测体系检出5例阳性，1例检测为阴性。且总核酸组检测乙型肝炎病毒患者血清样本的Tt值均比DNA检测体系小，出峰时间更早，说明血清中HBV的含逆转录酶扩增体系比DNA检测体系灵敏度高。
实施例2肺炎支原体的检测
以肺炎支原体检测为例，用本发明的方法对肺炎支原体进行定性检测，比较本发明与检测肺炎支原体DNA的灵敏度。具体方法包括如下步骤：
一、样本总核酸提取
用天根生化科技(北京)有限公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(离心柱法，(DP315)按照说明书提取咽拭子样本中总核酸。
二、引物探针设计
根据肺炎支原体序列保守区域设计RPA引物。具体序列信息详见表2。
表2肺炎支原体的检测引物
三、等温扩增反应
为了比较本发明方法的检测灵敏度，在总核酸检测体系中加入逆转录酶，DNA检测的RPA等温扩增体系中未加入逆转录酶，其他组分相同。
1)总核酸检测体系：
50μL反应体系：2×缓冲液25μL(含Buffer，重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶)；上游引物：2μL(10μM)；下游引物：2μL(10μM)；10UAMV逆转录酶，模板2μL，补足水至47.5μL。震荡混匀、离心。加入2.5μL乙酸镁启动反应。
2)DNA检测体系：
50μL反应体系：2×缓冲液25μL(含Buffer，重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶)；上游引物：2μL(10μM)；下游引物：2μL(10μM)；模板2μL，补足水至47.5μL。震荡混匀、离心。加入2.5μL乙酸镁启动反应。
反应条件：37℃20min
检测完成后加入终止液，并将产物进行电泳检测。
四、结果分析
总核酸检测体系和DNA扩增体系检测咽拭子样本的结果见图3。其中1-2表示总核酸检测体系检测肺炎支原体阳性样本1和样本2中的电泳结果图；3-4表示DNA检测体系检测肺炎支原体阳性样本1和样本2中的电泳结果图；5表示阳性对照；6表示阴性对照。从以上检测结果可看出，检测咽拭子样本中的肺炎支原体，总核酸检测体系比DNA检测体系产物浓度更高，扩增灵敏度更高。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法及其试剂盒
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgctttttc atttgccg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcgacgtg cagaggt 17
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atatttcaaa gattgtgtgt tta 23
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcccaaggt tttacataag aggatttttg gatt 34
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<211> 18
<212> DNA
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ttccttttca ggcatgga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggaaagaca cccactttga 20
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacacagtgt tgtttggcgg tgccagggca gtgatttc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcatgatgga gttgaaggta gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccaccatg taccttgg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccaccatg taccttggca ttg 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
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cgggtaccat taccatgggt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gccttgcgct actaagttca gg 22
Claims (10)
1.通过等温扩增技术检测样品中核酸的方法，其特征在于，在所述方法种采用含逆转录酶和DNA聚合酶的等温扩增体系检测DNA为遗传物质的样品，所述方法包括以下步骤：
步骤1：同时提取所述样品中DNA和RNA；
步骤2：在核酸扩增液中等温扩增提取的DNA和RNA，所述核酸扩增液包括逆转录酶和用于等温扩增的DNA聚合酶，所述逆转录酶将提取的RNA逆转录反应生成cDNA和所述DNA聚合酶等温扩增反应提取的DNA和逆转录的cDNA；和
步骤3：对核酸扩增产物进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中在同一个温度下完成逆转录和核酸等温扩增反应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中先在一温度下完成逆转录反应，然后在另一温度下完成核酸扩增反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应和/或等温扩增反应温度是37℃-65℃，优选为50℃-65℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为具有链置换功能的DNA聚合酶，包括Bst DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增为环介导等温扩增、重组酶聚合酶等温扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、交叉引物扩增技术、核酸依赖性扩增检测技术或切刻内切酶核酸等温扩增。
7.在权利要求1-6任一方法中使用的等温扩增试剂盒，所述试剂盒包括：同时提取样品中DNA和RNA的提取试剂，和包括逆转录酶、用于等温扩增的DNA聚合酶、RNaseH以及引物的核酸扩增试剂。
8.根据权利要求1-6任一方法中使用的等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：同时提取样品中DNA和RNA的提取试剂，和包括逆转录酶、用于等温扩增的DNA聚合酶、RNaseH、扩增引物F3、R3、FIP、BIP、LF、LB和含RNA碱基的扩增探针、dNTPs、甜菜碱。
9.根据权利要求8所述的等温扩增试剂盒，其特征在于，所述含RNA碱基的扩增探针包含至少1个RNA碱基，且RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基。
10.根据权利要求9所述的等温扩增试剂盒，所述试剂盒是乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物和探针，
其中HBV-F3、HBV-B3、HBV-FI、HBV-BIP、HBV-LF和HBV-LB为扩增引物，HBV RNA-P为检测探针，其中探针HBV RNA-P的T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团；和，ATTB-OF3、ATTB-OR3、ATTB-FIP、ATTB-BIP、ATTB-LF和ATTB-LB为内参基因ATTB扩增引物，探针ATTB-ZrnaP为内参基因检测探针，T修饰报告荧光基团，A为RNA碱基，3'末端修饰淬灭基团。
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