CN109055499A - 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas的常温等温快速检测核糖核酸的技术及检测方法。本发明旨在生物体外利用公开的多种基因工程酶与化学组分进行核糖核酸扩增，并通过一种或多种核酸酶，在常温等温条件下实现快速、一步或两步的完成特定核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的扩增与检测过程，使对各种核酸的检测更快速和更简便。包括以下步骤:(1)通过核酸提取得到待检测样本的RNA或单链DNA或双链DNA；(2)利用逆转录酶、转录酶、核糖核酸酶H、CRISPR相关蛋白13的组合酶以及核酸荧光探针与待检核酸在等温进行反应，若待检测核酸为DNA，在反应前增加预变性的步骤；(3)通过检测荧光信号，判断待检测样本中是否存在目标核酸。
Description
技术领域
本发明是一种新的核酸等温扩增检测技术，利用逆转录酶、RNA聚合酶和Cas13a蛋白在常温等温条件下，可快速、一步、单管的完成针对特定DNA或RNA的扩增和检测反应。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增和检测已经是分子检测领域最为经典和通用的方法。同样，RNA的体外扩增大多是利用PCR的衍生技术，逆转录PCR进行的。逆转录PCR一般分两步，第一步先利用逆转录酶将RNA反转录为cDNA，之后再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而实现RNA的扩增和检测。然而，PCR本身需要依赖高精密的温度循环仪进行检测，且污染控制较为严格，基于PCR的RNA检测局限于中心实验室，对于现场快速检测有很大的限制。
除了PCR，基于核酸杂交的技术也是非常常用的检测方法，DNA或RNA分子先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性进行标记。在膜上杂交时，核酸探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。这个方法目前应用也相当广泛，优点是可以一次分析大量样品，缺点是容易出现假阳性。同时，核酸杂交的反应时间较长也是一个难以克服的缺点，也无法满足现场快速检测的需要。
近年来发展出很多新的核酸等温扩增检测技术，1)环介导等温扩增技术(LAMP)利用4对引物特异识别6个靶位点和具有链置换活性的DNA聚合酶，可在60-65度条件下实现核酸快速扩增和检测(一般小于1小时)；2)依赖于核酸序列的扩增(NASBA)法，利用三种酶(逆转录酶、RNaseH和T7 RNA聚合酶)和两个特异性引物的引导，在一恒定温度下温育45-90分钟，即可完成对RNA模板的快速扩增，同时利用荧光基团标记的发夹型核酸探针进行检测；3)滚环扩增技术(RCA)，利用DNA连接酶和DNA聚合酶，以滚环复制的模式，从一条或多条引物处进行环形模板的链置换合成，从而可实现部分病毒的环状基因组的扩增；4)重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，是在由多种酶和蛋白的参与下，在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，利用这三种酶的共同作用，实现在等温环境下的扩增。
以上几种技术都各有其内在缺陷，如LAMP法扩增一旦开盖容易形成气溶胶污染，加上目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重，并且其引物设计要求比较高，对于分型或点突变检测常常不能满足要求；RPA方法的酶组分较为复杂，对于点突变的检测能力有限；RCA的反应时间偏长(>4小时)，使其在应用方面特别是现场检测中的优势不甚明显。
CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是含有多个短同向重复的基因座，其被发现存在于约40％已测序的细菌基因组中和90％已测序的古细菌基因组中。CRISPR作为原核的适应性免疫系统发挥功能，可提供针对入侵的外源核酸的获得性抗性。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中，作为CRISPR元件保留过去暴露的记忆。这些被留作记忆的间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传物质。Cas蛋白(CRISPR相关蛋白)是CRISPR系统中一种重要的蛋白质成分。
CRISPR相关蛋白13(Cas13a)是近年来新鉴定到一种CRISPR核酸酶，这个核酸酶具有能被特异性RNA激活获得非特异性切割其他RNA的活性，配合RNA荧光报告系统能够检测特异性的RNA，但Cas13a单独作用时灵敏度较低，只能实现pM级别的核酸检测，对于分子诊断的灵敏度欠佳。2017年，张锋等利用Cas13a蛋白结合等温扩增技术RPA，开发了可以检测核酸的新方法SHERLOCK，其灵敏度可以实现对aM级样品的检测。但SHERLOCK方法对于RNA检测无法实现一步单管的检测，且RPA方法成分复杂，稳定性欠佳，增加了操作难度。
发明内容
为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明提供一种基于Cas13检测核酸的新方法，利用RNA聚合酶和逆转录酶的循环扩增作用，在完成扩增的同时进行检测反应，利用向导DNA代替了通常Cas13a直接使用的向导RNA，使得RNA的扩增反应和检测反应可以在同一反应管中进行，单管实现了对RNA样本的检测。同时，加入预变性的处理方法，本方法也可以用于DNA样本的检测。本方法的优点在于兼顾反应效率和准确度，实现对样本中特异性核酸的高灵敏度检出。
本发明采用以上技术方案实现上述目的：
基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待检测样本中提取总核酸；
(2)将提取后的待检核酸样本加入含有酶混合液、向导DNA、RNA荧光探针和扩增引物对的缓冲液中进行等温反应；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白；
(3)利用酶标仪检测反应后的荧光信号，通过荧光信号来判断待检样本中是否存在目标核酸序列。
若待检测核酸为DNA，在反应前增加预变性的步骤。
本发明能在常温等温条件下，快速、单管的完成对DNA或RNA的检测，首先通过核酸提取得到待检测样本的RNA、单链DNA或双链DNA；再利用逆转录酶、转录酶、核糖核酸酶H、CRISPR相关蛋白的组合酶以及核酸荧光探针与待检核酸在等温进行反应，最后通过检测荧光信号，判断待检测样本中是否存在目标核酸。
进一步地，所述CRISPR-Cas核酸酶结合向导RNA可以被目标核酸序列特异性激活从而具有非特异性的RNA核酸酶活性，实现对RNA荧光探针的剪切；CRISPR-Cas核酸酶包括LbaCas13、LbuC13a、LwaCas13a、AspCas13b、BzoCas13b、CcaCas13b、PsmCas13b、PinCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PbuCas13b、PguCas13b、PigCas13b、PsaCas13b、RanCas13b、PspCas13b、EsCas13d、RspCas13d。该酶可以包括野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上Cas蛋白的混合物。CRISPR-Cas核酸酶优选为LwaCas13a。
进一步地，所述向导DNA是用于转录产生向导RNA序列的双链DNA分子；向导DNA的序列由RNA聚合酶序列和向导RNA序列组成。向导DNA在反应中直接转录产生向导RNA，避免了对目标分子起始阶段的扩增，使得扩增和检测反应得以在同一管完成，避免了开盖两步法可能的污染。所述向导DNA在5‘端具有T7序列，所述T7序列为TAATACGACTCACTATAGGG。向导DNA用在基于Cas13的检测反应中，可以在检测反应的同时产生CRISPR相关蛋白13检测反应所需的向导RNA。在保证了核酸的扩增的效率的同时使得单管的扩增检测反应称为可能。所述向导RNA是指引导CRISPR相关蛋白特异性结合靶标DNA的RNA。
所述RNA聚合酶能够利用含有特定启动子的DNA片段，产生同样序列的RNA分子；RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶。该酶可以包括野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上RNA聚合酶的混合物。所述的RNA聚合酶优选为T7 RNA聚合酶。
所述逆转录酶能够在互补引物的引导下形成与单链RNA或DNA模板互补的DNA；逆转录酶包括MMLV、AMV逆转录酶。所述的逆转录酶优选为鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶，该酶可以包括野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上逆转录酶的混合物。
所述的核糖核酸酶H可以降解RNA/DNA的杂合链中的RNA，该酶包括野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上具有同样功能酶的混合物。
所述RNA酶抑制蛋白为小鼠RNA酶抑制蛋白、大鼠RNA酶抑制蛋白或其他物种来源的RNA酶抑制蛋白，该蛋白包括野生型、改造过的、密码子优化过的、进化过的、嗜热的、嵌合的、工程化的和/或一种以上具有同样功能蛋白的混合物。
所述RNA荧光探针为荧光标记的单链RNA分子；单链RNA分子为在5‘端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团。5’端的荧光基团包括HEX，Cy5，FAM，TexasRed等，3’端荧光淬灭基团包括BHQ1，Dabcyl，TAMRA等。
所述扩增引物对为一对长度15-30碱基的DNA引物，其中一条引物上带有T7启动子序列，扩增长度为100-500bp长度。
所述缓冲液成分还包括10-100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，2-30mM氯化镁，10-100mM氯化钾，1-10mM二硫苏糖醇，1-5mM NTP，1-5mM dNTP，1-5nmol扩增引物，5-10％二甲基亚砜，0.1-1％牛血清白蛋白；所述缓冲液pH值在7.0-8.0之间。
本发明的第二个目的是提供一种基于CRISPR-Cas的等温核酸检测试剂盒，可以实现常温等温条件下对特定RNA或DNA分子的精准、快速和高灵敏度检测。
基于CRISPR-Cas的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶混合液、向导DNA、RNA荧光探针、扩增引物对和缓冲液；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白。
进一步地，所述CRISPR-Cas核酸酶为LbaCas13，所述向导DNA在5‘端具有T7序列，所述T7序列为TAATACGACTCACTATAGGG；所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述RNA荧光探针为5‘端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团的单链RNA；所述扩增引物对为一对长度15-30碱基的DNA引物，其中一条引物上带有T7启动子序列。
在一个具体实施例中，缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0；氯化镁，1mM-30mM；氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM；dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％；牛血清白蛋白，0.1ug-20ug/ul；RNaseAlert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；FAM标记的荧光探针1-4nM；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
在本发明试剂盒中，靶标DNA、向导RNA和Cas13a蛋白形成复合物，该复合物会切割体系中其他的单链RNA分子。
本发明的检测方法和试剂盒可以检测病原微生物、人或其他动植物组织的核酸分子。
本发明的主要优点在于：
1、高灵敏度：应用本发明检测的DNA和RNA，可以实现对aM浓度级别的核酸检测；
2、通用性：应用本发明可以实现对DNA或RNA的检测，并且能够区分点突变；
3、多通道：可以实现多通道的检测，一次性检测多个样本；
4、快速：本发明可以短至一小时内完成检测；
5、便捷：本发明实现了单管单个缓冲液的等温反应，操作方便，步骤简便；
6、稳定：利用向导DNA代替了向导RNA，提高了试剂盒的稳定性。
7、低假阳性：本发明的反应体系虽然包含扩增步骤，但扩增产物为RNA而非DNA，RNA易降解和不易产生气溶胶的特性使得检测方法本身克服了LAMP、荧光定量PCR等易污染的特点。同时，本方法是闭管反应，在物理上进行隔绝，最大可能降低了污染的可能性。
8、常温等温：由5种工程酶和化学组分一起创造出一个最大程度模拟生物体内核酸扩增的环境，而且每种工程酶都各司其职，在其最适的反应温度上工作，因此工作效率最高。
9、一步法：利用向导DNA代替了通常Cas13a直接使用的向导RNA，使得RNA的扩增反应和检测反应可以在同一反应管中进行，也只通过一次性加样完成，因此操作更简单。
附图说明
图1显示了本发明检测RNA样本的流程示意图。
图2显示了本发明检测DNA样本的流程示意图。
图3显示了在该方法中使用向导DNA极大的提高了检测活性。
图4显示了在该方法中对RNA样本的检测灵敏度。
图5显示了在该方法中对单链DNA样本的检测灵敏度。
图6显示了在该方法中对单链DNA样本的检测灵敏度。
图7显示了在Cas13a反应中逆转录酶MMLV对Cas13a活性的影响。
图8显示了在Cas13a反应中逆转录酶AMV对Cas13a活性的影响。
图9显示了利用本发明检测肿瘤相关基因KRAS G12位点的三种突变类型。
图10显示了利用本发明检测宫颈癌筛查样本的HPV 16和18分型。
图11显示了利用本发明检测耳聋相关基因GJB2的突变。
图12显示了利用本发明检测APC基因的一个SNP的三种分型。
图13显示了利用本发明检测甲流病毒。
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明提供的方法与技术方案的进一步说明，但不应理解成对本发明的限制。
实施例所用到的引物列表如下:
实施例1：使用本发明检测RNA靶标
选用RNA(Target1)作为靶标序列，Target1序列为：aucgauagucuagucaucguacguagcuagucagucaauaucgauca；
靶标RNA的制备方法为，合成包含T7序列的反向互补长引物(Target1-primer-R)tgatcgatattgactgactagctacgtacgatgactagactatcgatccctatagtgagtcgtattaT7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链，利用T7转录酶在37度进行过夜反应，再利用ZYMO RNA CLEAN&CONCENTRATION试剂盒(Zymo Research公司)进行纯化得到靶标RNA，制备完成后保存于-20度或-80度。
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物crDNA-target1-R:agctacgtacgatgactagacGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
扩增引物为：TMC-Target1-F taatacgactcactatagatcgatagtctagtcatc；TMC-Target1-R cgatgactagactatcgat；
扩增和检测反应：将待检RNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；FAM标记的荧光探针；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图4所示，应用此方法可以检测到1aM的单链RNA分子。
实施例2：使用本发明检测单链DNA靶标
选用DNA(Target2)作为靶标序列，Target2序列为：atcgatagtctagtcatcgtacgtagctagtcagtcaatatcgatca。
靶标单链DNA的制备方法为，合成引物(Target2-primer-F)：atcgatagtctagtcatcgtacgtagctagtcagtcaatatcgatcacccaatgtgacatcgctga，溶解于水中稀释至100uM。
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物crDNA-target2-R：agctacgtacgatgactagacGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
扩增和检测反应：将待检单链DNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图5所示，应用此方法可以检测到1aM的单链DNA分子。
实施例3：使用本发明检测双链DNA靶标
选用DNA(Target3)作为靶标序列，Target3序列为：
atcgatagtctagtcatcgtacgtagctagtcagtcaatatcgatcagacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggc。
靶标DNA的制备方法为，合成反向互补长引物(Target3-primer-R)
gccttcgatgcggaccttctgggttttgatctcctcgatgtctgatcgatattgactgactagctacgtacgatgactagactatcgat，以及正向引物(Target3-primer-F)
atcgatagtctagtcatcgtacgtagctagtcagtcaatatcgatcagacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggc，引物进行混合褪火反应，制备完成后保存于-20度或-80度。
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物crDNA-target3-R：agctacgtacgatgactagacGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
DNA单链化反应：将待检测DNA中加入0.1-1N的KOH进行碱变性，再加入0.1-1N的HCl中和。
扩增和检测反应：将待检双链DNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。共设置5个反应，无DNA底物，10aM DNA底物，100aM DNA底物，1fM DNA底物，10fM DNA底物。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图6所示，应用此方法可以检测到1aM的双链DNA分子。
实施例4：使用本发明检测人基因组肿瘤相关基因突变
本实施例检测人KRAS基因的G12位点突变，野生型KRAS第一个外显子的序列为：atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagag，G12C-KRAS第一个外显子序列为：atgactgaatataaacttgtggtagttggagctCgtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagag，G12V-KRAS第一个外显子序列为：atgactgaatataaacttgtggtagttggagctgTtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagag，G12D-KRAS第一个外显子序列为atgactgaatataaacttgtggtagttggagctgAtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagag，
待检测DNA的来源为293T细胞系、H358细胞系、ASPC-1细胞系、SW48细胞系，分别提取四个细胞系的基因组DNA作为待检测样本。
KRAS的扩增引物为，Primer-KRAS-F1：atgcatttttcttaagcgtcgatgg；
Primer-KRAS-R1:ccctgacatactcccaaggaaag；
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物：
Primer-KRAS-probeControl-R:
GCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；
Primer-KRAS-probeWT-R:
ttgtggtagttggagctggtggcgtTggGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；Primer-KRAS-probeG12C-R:
ttgtggtagttggagctTgtggcgtTggGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；Primer-KRAS-probeG12V-R:
ttgtggtagttggagctgTtggcgtTggGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；Primer-KRAS-probeG12D-R:
ttgtggtagttggagctgAtggcgtTggGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。DNA单链化反应：将待检基因组DNA中加入0.1-1N的KOH进行碱变性，再加入0.1-1N的HCl中和。
扩增和检测反应：将单链化后待检DNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图9所示，本发明可以检测肿瘤相关基因KRAS G12位点的三种突变类型。
实施例5：使用本发明检测HPV病毒
本实施例检测16和18分型HPV病毒的E6/E7 RNA，HPV 16分型的E6/E7序列为：
atgcaccaaaagagaactgcaatgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttaccacagttatgcacagagctgcaaacaactatacatgatataatattagaatgtgtgtactgcaagcaacagttactgcgacgtgaggtatatgactttgcttttcgggatttatgcatagtatatagagatgggaatccatatgctgtatgtgataaatgtttaaagttttattctaaaattagtgagtatagacattattgttatagtttgtatggaacaacattagaacagcaatacaacaaaccgttgtgtgatttgttaattaggtgtattaactgtcaaaagccactgtgtcctgaagaaaagcaaagacatctggacaaaaagcaaagattccataatataaggggtcggtggaccggtcgatgtatgtcttgttgcagatcatcaagaacacgtagagaaacccagctgtaatcatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctactgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataa；
HPV 18分型的E6/E7序列为：
atggcgcgctttgaggatccaacacggcgaccctacaagctacctgatctgtgcacggaactgaacacttcactgcaagacatagaaataacctgtgtatattgcaagacagtattggaacttacagaggtatttgaatttgcatttaaagatttatttgtggtgtatagagacagtataccgcatgctgcatgccataaatgtatagatttttattctagaattagagaattaagacattattcagactctgtgtatggagacacattggaaaaactaactaacactgggttatacaatttattaataaggtgcctgcggtgccagaaaccgttgaatccagcagaaaaacttagacaccttaatgaaaaacgacgatttcacaacatagctgggcactatagaggccagtgccattcgtgctgcaaccgagcacgacaggaacgactccaacgacgcagagaaacacaagtataatattaagtatgcatggacctaaggcaacattgcaagacattgtattgcatttagagccccaaaatgaaattccggttgaccttctatgtcacgagcaattaagcgactcagaggaagaaaacgatgaaatagatggagttaatcatcaacatttaccagcccgacgagccgaaccacaacgtcacacaatgttgtgtatgtgttgtaagtgtgaagccagaattgagctagtagtagaaagctcagcagacgaccttcgagcattccagcagctgtttctgaacaccctgtcctttgtgtgtccgtggtgtgcatcccagcag；
待检测DNA的来源为293T细胞，HeLa细胞和SiHa细胞系。提取总RNA后为待检测样品。
HPV16的扩增引物为，Primer-HPV16-F1：AGTAATTTAATACGACTCACTATAGGGAatgcaccaaaagagaactgc；Primer-HPV16-R1：agttgtttgcagctctgtgc；
HPV18的扩增引物为，Primer-HPV18-F1：AGTAATTTAATACGACTCACTATAGGGAgcgaccctacaagctacctg；Primer-HPV18-R1：tatactgtctctatacaccac；
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物Primer-HPV16-probe-R：
TCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；Primer-HPV18-probe-R：gtgcacggaactgaacacttcactgcaaGTTTTAGTCCCCTTCGTT
TTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
扩增和检测反应：将提取后的RNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图10所示，本发明方法可以用于检测宫颈癌筛查样本的HPV感染分型。
实施例6：使用本发明检测耳聋相关基因突变
本实施例检测人耳聋相关基因GJB2的突变，野生型GJB2的编码区序列为：
atggattggggcacgctgcagacgatcctggggggtgtgaacaaacactccaccagcattggaaagatctggctcaccgtcctcttcatttttcgcattatgatcctcgttgtggctgcaaaggaggtgtggggagatgagcaggccgactttgtctgcaacaccctgcagccaggctgcaagaacgtgtgctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggccctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtggcctaccggagacatgagaagaagaggaagttcatcaagggggagataaagagtgaatttaaggacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggctccctgtggtggacctacacaagcagcatcttcttccgggtcatcttcgaagccgccttcatgtacgtcttctatgtcatgtacgacggcttctccatgcagcggctggtgaagtgcaacgcctggccttgtcccaacactgtggactgctttgtgtcccggcccacggagaagactgtcttcacagtgttcatgattgcagtgtctggaatttgcatcctgctgaatgtcactgaattgtgttatttgctaattagatattgttctgggaagtcaaaaaagccagtttaa；GJB2突变后的序列为：
atggattggggcacgctgcagacgatcctggggggtgtgaacaaacactccaccagcattggaaagatctggctcaccgtcctcttcatttttcgcattatgatcctcgttgtggctgcaaaggaggtgtggggagatgagcaggccgactttgtctgcaacaccctgcagccaggctgcaagaacgtgtgctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggccctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtggcctaccggagacatgagaagaagaggaagttcatcaagggggagataaagagtgaatttaaggacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggctccctgtggtAgacctacacaagcagcatcttcttccgggtcatcttcgaagccgccttcatgtacgtcttctatgtcatgtacgacggcttctccatgcagcggctggtgaagtgcaacgcctggccttgtcccaacactgtggactgctttgtgtcccggcccacggagaagactgtcttcacagtgttcatgattgcagtgtctggaatttgcatcctgctgaatgtcactgaattgtgttatttgctaattagatattgttctgggaagtcaaaaaagccagtttaa
待检测DNA的来源为正常人血液样本和携带GJB2突变的耳聋患者的血液样本，提取基因组DNA后为待检测样本。
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物
Primer-GJB2-probeWT-R：
GCTGCAGACGATCCTGGGGGGTGTGAgttttagtccccttcgtttttggggtag；
Primer--GJB2-probeMut-R：
GGGCACGCTGCAGACGATCCTGGGGGgttttagtccccttcgtttttggggtag；T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
DNA单链化反应：将待检基因组DNA中加入0.1-1N的KOH进行碱变性，再加入0.1-1N的HCl中和。
扩增和检测反应：将单链化后待检DNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200 PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图10所示，本发明方法可用于检测耳聋相关基因GJB2的基因突变。
实施例7：使用本发明检测人基因组SNP
本实施例检测人APC基因的SNP位点：ATATCATGGGGAGTCATCAGCAAAA[A/C/T]CTAGAGTATGGGACACTCTATAAAA
扩增引物为Primer-APC-SNP-T7-F，taatacgactcactatagATTTTCTCTCACAAACCTCCTTCTC，Primer-APC-SNP-R，CTCCCCATGATATACTTCAACATGT。
靶标DNA的制备方法为，从人源细胞系或组织中利用QIAGEN genomic DNAextraction kit提取基因组DNA，提取后保存于-20度或-80度。
向导DNA的制备：制备三条不同的向导DNA，分别检测A，C，T三种SNP位点，合成包含T7序列的反向互补长引物分别是
Primer-APC-SNP-Probe-A-R:tcaAcaaaaActagagtatgggacactcGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；
Primer-APC-SNP-Probe-C-R:tcaAcaaaaCctagagtatgggacactcGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；
Primer-APC-SNP-Probe-T-R:tcaAcaaaaTctagagtatgggacactcGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；以及T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
DNA单链化反应：将待检基因组DNA中加入0.1-1N的KOH进行碱变性，再加入0.1-1N的HCl中和。
扩增和检测反应：将单链化后待检DNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图12所示，利用本方法可以检测APC的三种纯合分型。
实施例8：使用本发明检测甲流病毒
甲流病毒为RNA病毒，从待检血液样本中提取总RNA，提取的总RNA作为待检RNA；
选用甲流M1基因序列作为靶标序列，甲流M1的保守区序列为：
tucacgcucaccgugcccagugagcgaggacugcagcguagacg，
向导DNA的制备：合成包含T7序列的反向互补长引物：
Primer-InfleunzaA-M1-probe1-R：CACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；
Primer-InfleunzaA-M1-probe2-R：GCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGAGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA；T7的正向引物(T7-F)taatacgactcactatag，通过双引物褪火制成DNA不完全双链。制备完成后保存于-20度或者-80度。
扩增和检测反应：将待检RNA加入反应体系，反应体系包括，缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，pH6.0-8.0，氯化镁，1mM-30mM，氯化钾，0mM-100mM；氯化钠，0mM-200mM；二硫苏糖醇，1mM-10mM；rNTP，1mM-5mM，dNTP，0.1uM-10uM；二甲基亚砜，0.1％-1％，牛血清白蛋白，0.1ug-20ug；RNase Alert 0.1uM-1uM)；扩增引物(1mM-5mM)；酶混合物(T7转录酶，50U-200U；AMV逆转录酶，5U-20U；RNA酶抑制蛋白，10U-100U；Cas13a蛋白，0.1ug-5ug；核糖核酸酶H，0.05U-0.2U)。
荧光检测：反应混合后，在酶标仪(Tecan Infinite 200PRO)中设置温度为41度，荧光发射波长为488mm，检测波长为520nm，检测时间间隔为3min，检测2小时。
结果：如图13所示，本发明可用于对甲流病毒进行检测。
序列表
<110> 杭州杰毅麦特医疗器械有限公司
<120> 基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法及试剂盒
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatcgatat tgactgacta gctacgtacg atgactagac tatcgatccc tatagtgagt 60
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctacgtac gatgactaga cgttttagtc cccttcgttt ttggggtagt ctaaatcccc 60
tatagtgagt cgtattaa 78
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactatag 18
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactatagat cgatagtcta gtcatc 36
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgatgactag actatcgat 19
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcgatagtc tagtcatcgt acgtagctag tcagtcaata tcgatcaccc aatgtgacat 60
cgctga 66
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agctacgtac gatgactaga cgttttagtc cccttcgttt ttggggtagt ctaaatcccc 60
tatagtgagt cgtattaa 78
<210> 8
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgatagtc tagtcatcgt acgtagctag tcagtcaata tcgatcagac atcgaggaga 60
tcaaaaccca gaaggtccgc atcgaaggc 89
<210> 9
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gccttcgatg cggaccttct gggttttgat ctcctcgatg tctgatcgat attgactgac 60
tagctacgta cgatgactag actatcgat 89
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taatacgact cactatagat tttctctcac aaacctcctt ctc 43
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctccccatga tatacttcaa catgt 25
<210> 12
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcaacaaaaa ctagagtatg ggacactcgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 13
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaacaaaac ctagagtatg ggacactcgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 14
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcaacaaaat ctagagtatg ggacactcgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
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<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caccgtgccc agtgagcgag gactgcaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
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<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcccagtgag cgaggactgc agcgtagagt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 17
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtaatttaa tacgactcac tatagggaat gcaccaaaag agaactgc 48
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agttgtttgc agctctgtgc 20
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtaatttaa tacgactcac tatagggagc gaccctacaa gctacctg 48
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tatactgtct ctatacacca c 21
<210> 21
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcaggaccca caggagcgac ccagaaaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 22
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtgcacggaa ctgaacactt cactgcaagt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctgcagacg atcctggggg gtgtgagttt tagtcccctt cgtttttggg gtag 54
<210> 24
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gggcacgctg cagacgatcc tggggggttt tagtcccctt cgtttttggg gtag 54
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgcattttt cttaagcgtc gatgg 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccctgacata ctcccaagga aag 23
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<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcccagtgag cgaggactgc agcgtagagt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 28
<211> 85
<212> DNA
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ttgtggtagt tggagctggt ggcgttgggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 29
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttgtggtagt tggagcttgt ggcgttgggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 30
<211> 85
<212> DNA
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<400> 30
ttgtggtagt tggagctgtt ggcgttgggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttgtggtagt tggagctgat ggcgttgggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaa 85
<210> 32
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<212> DNA
<213> HPV
<400> 32
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaatca 480
tgcatggaga tacacctaca ttgcatgaat atatgttaga tttgcaacca gagacaactg 540
atctctactg ttatgagcaa ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc 600
cagctggaca agcagaaccg gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt 660
gtgactctac gcttcggttg tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag 720
acctgttaat gggcacacta ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccataa 776
<210> 33
<211> 800
<212> DNA
<213> HPV
<400> 33
atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa 60
ctgaacactt cactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagac agtattggaa 120
cttacagagg tatttgaatt tgcatttaaa gatttatttg tggtgtatag agacagtata 180
ccgcatgctg catgccataa atgtatagat ttttattcta gaattagaga attaagacat 240
tattcagact ctgtgtatgg agacacattg gaaaaactaa ctaacactgg gttatacaat 300
ttattaataa ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa acttagacac 360
cttaatgaaa aacgacgatt tcacaacata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg 420
tgctgcaacc gagcacgaca ggaacgactc caacgacgca gagaaacaca agtataatat 480
taagtatgca tggacctaag gcaacattgc aagacattgt attgcattta gagccccaaa 540
atgaaattcc ggttgacctt ctatgtcacg agcaattaag cgactcagag gaagaaaacg 600
atgaaataga tggagttaat catcaacatt taccagcccg acgagccgaa ccacaacgtc 660
acacaatgtt gtgtatgtgt tgtaagtgtg aagccagaat tgagctagta gtagaaagct 720
cagcagacga ccttcgagca ttccagcagc tgtttctgaa caccctgtcc tttgtgtgtc 780
cgtggtgtgc atcccagcag 800
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<212> DNA
<213> 人耳聋相关基因GJB2突变型(GJB2)
<400> 34
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ggaaagatct ggctcaccgt cctcttcatt tttcgcatta tgatcctcgt tgtggctgca 120
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ctgatcttcg tgtccacgcc agcgctccta gtggccatgc acgtggccta ccggagacat 300
gagaagaaga ggaagttcat caagggggag ataaagagtg aatttaagga catcgaggag 360
atcaaaaccc agaaggtccg catcgaaggc tccctgtggt agacctacac aagcagcatc 420
ttcttccggg tcatcttcga agccgccttc atgtacgtct tctatgtcat gtacgacggc 480
ttctccatgc agcggctggt gaagtgcaac gcctggcctt gtcccaacac tgtggactgc 540
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atttgcatcc tgctgaatgt cactgaattg tgttatttgc taattagata ttgttctggg 660
aagtcaaaaa agccagttta a 681
<210> 35
<211> 681
<212> DNA
<213> 人耳聋相关基因GJB2突变型(GJB2)
<400> 35
atggattggg gcacgctgca gacgatcctg gggggtgtga acaaacactc caccagcatt 60
ggaaagatct ggctcaccgt cctcttcatt tttcgcatta tgatcctcgt tgtggctgca 120
aaggaggtgt ggggagatga gcaggccgac tttgtctgca acaccctgca gccaggctgc 180
aagaacgtgt gctacgatca ctacttcccc atctcccaca tccggctatg ggccctgcag 240
ctgatcttcg tgtccacgcc agcgctccta gtggccatgc acgtggccta ccggagacat 300
gagaagaaga ggaagttcat caagggggag ataaagagtg aatttaagga catcgaggag 360
atcaaaaccc agaaggtccg catcgaaggc tccctgtggt agacctacac aagcagcatc 420
ttcttccggg tcatcttcga agccgccttc atgtacgtct tctatgtcat gtacgacggc 480
ttctccatgc agcggctggt gaagtgcaac gcctggcctt gtcccaacac tgtggactgc 540
tttgtgtccc ggcccacgga gaagactgtc ttcacagtgt tcatgattgc agtgtctgga 600
atttgcatcc tgctgaatgt cactgaattg tgttatttgc taattagata ttgttctggg 660
aagtcaaaaa agccagttta a 681
Claims (10)
1.基于CRISPR-Cas的等温核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从待检测样本中提取总核酸；
(2)将提取后的待检核酸样本加入含有酶混合液、向导DNA、RNA荧光探针和扩增引物对的缓冲液中进行等温反应；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白；
(3)利用酶标仪检测反应后的荧光信号，通过荧光信号来判断待检样本中是否存在目标核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas核酸酶结合向导RNA可以被目标核酸序列特异性激活从而具有非特异性的RNA核酸酶活性，实现对RNA荧光探针的剪切；CRISPR-Cas核酸酶包括LbaCas13、LbuC13a、LwaCas13a、AspCas13b、BzoCas13b、CcaCas13b、PsmCas13b、PinCas13b、Pin2Cas13b、Pin3Cas13b、PbuCas13b、PguCas13b、PigCas13b、PsaCas13b、RanCas13b、PspCas13b、EsCas13d、RspCas13d。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述向导DNA是用于转录产生向导RNA序列的双链DNA分子；向导DNA的序列由RNA聚合酶序列和向导RNA序列组成；所述向导DNA在5‘端具有T7序列，所述T7序列为TAATACGACTCACTATAGGG。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶能够利用含有特定启动子的DNA片段，产生同样序列的RNA分子；RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录酶能够在互补引物的引导下形成与单链RNA或DNA模板互补的DNA；逆转录酶包括MMLV、AMV逆转录酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA荧光探针为荧光标记的单链RNA分子；单链RNA分子为在5‘端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增引物对为一对长度15-30碱基的DNA引物，其中一条引物上带有T7启动子序列，扩增长度为100-500bp长度。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液成分还包括10-100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，50mM，2-30mM氯化镁，10-100mM氯化钾，1-10mM二硫苏糖醇，1-5mM NTP，1-5mM dNTP，1-5nmol扩增引物，5-10％二甲基亚砜，0.1-1％牛血清白蛋白；所述缓冲液pH值在6.5-8.0之间。
9.基于CRISPR-Cas的等温核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶混合液、向导DNA、RNA荧光探针、扩增引物对和缓冲液；所述酶混合液包括CRISPR-Cas核酸酶、RNA聚合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA酶抑制蛋白。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR-Cas核酸酶为LbaCas13，所述向导DNA在5‘端具有T7序列，所述T7序列为TAATACGACTCACTATAGGG；所述RNA聚合酶为T7RNA聚合酶；所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述RNA荧光探针为5‘端标记荧光基团、3’端标记荧光淬灭基团的单链RNA；所述扩增引物对为一对长度15-30碱基的DNA引物，其中一条引物上带有T7启动子序列。
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