CN110241237A - 一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向产气肠杆菌rpoB基因的向导RNA、扩增引物对、水化TwistAmp basic kit反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和缓冲液。使用该试剂盒进行产气肠杆菌检测，检测的特异性高，可以将产气肠杆菌与其他肠杆菌属细菌，包括阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌区分开来。同时，使用本发明所述RNA序列进行检测，耗时在1小时左右，不需要PCR仪，对设备要求低，显著低于传统的细菌培养法或PCR测序法，临床实用价值大。

Description

一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒
技术领域
本发明属于致病菌检测领域，涉及一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒。利用此试剂盒可以进行产气肠杆菌快速检测。
背景技术
产气肠杆菌是人体感染的革兰阴性菌中常见菌群，给患者及社会带来巨大负担。传统的检测方法是进行细菌培养或PCR联合测序，但细菌培养需要5-7天的时间，而PCR常由于缺乏特异性引物，无法将产气肠杆菌与其他肠杆菌属细菌区分，故而需要联合一代测序才能鉴定，成本高，需要数天时间才能出结果。在这期间临床医师由于没有获得检测结果，只能凭经验用药，常常导致疾病治疗的延误。因而，如何快速检测产气肠杆菌显得尤为重要。近期，张峰等人发现，LbCas12a蛋白可用于致病菌的检测，只需要1小时左右即可完成检测，省时省力，灵敏度高。具体的原理为，该系统包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向导RNA、两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM结构，同时该序列需要具备特异性，即区别于别的致病菌。而向导RNA序列为致病菌特异性靶向序列中TTTN后的一段序列，长度为20-24个碱基。在向导RNA引导下，LbCas12a蛋白可结合到致病菌特异性DNA序列上，随后，LbCas12a蛋白可表现出Dnase活性，从而切割两端分别带荧光基团和淬灭基团的单链DNA，使得荧光基团和淬灭基团分离，出现荧光，从而指示致病菌的存在。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒，包含一种特异性靶向产气肠杆菌rpoB基因的向导RNA、RPA扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒(TwistAmpbasic kit)反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针(ssDNA)、RNA酶抑制剂(RibonucleaseInhibitor)和缓冲液。其中特异性靶向产气肠杆菌rpoB基因的向导RNA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特异性靶向产气肠杆菌，而不能靶向阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌，可用于产气肠杆菌的检测。RPA扩增引物对RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQNo.3所示。单链DNA探针的序列如SEQ No.6所示。
本发明提供所述试剂盒进行产气肠杆菌快速检测的方法，通过以下步骤实现：
具体步骤为：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQNo.2)和RPA-R(序列为SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工，序列为SEQ No.6)，加水补至25μl。37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行产气肠杆菌检测；发黄绿色荧光说明有产气肠杆菌污染，不发光说明没有产气肠杆菌污染。本方法可以将产气肠杆菌与其他肠杆菌属细菌，包括阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌区分开来。
其中：
所述单链DNA探针ssDNA序列(SEQ No.6)为：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ1，由上海生工合成。
使用本发明所述检测试剂盒进行产气肠杆菌感染检测的优势在于：(1)与传统细菌培养或PCR联合一代测序法比较，传统方法需要数天时间，本方法只需要1小时即可完成检测。同时，本方法采用RPA法扩增，只要恒温水浴锅即可完成反应，不需要PCR仪，对设备要求低。(2)使用本发明所述检测试剂盒进行检测时，只有产气肠杆菌呈阳性反应，而其他种类的肠杆菌属细菌，包括常见的阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌均呈阴性反应。故而，本发明所述检测试剂盒具有高特异性。
附图说明
图1为产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌rpoB基因序列比对图。
图2为样品荧光显微镜下检测结果，从1号-4号管样品加入的是各肠杆菌属细菌菌株，分别为产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌。其中1号管有黄绿色荧光，呈阳性反应。2-4号管无黄绿色荧光，呈阴性反应。
图3为使用PCR法扩增不同种属肠杆菌，得到大小相似的条带，无法区分出产气肠杆菌。
图4为使用基于本发明所述向导RNA的检测法与传统PCR联合测序法，实验耗时比较图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：肠杆菌属细菌rpoB基因序列比对
如图1所示，在产气肠杆菌rpoB基因序列中，本发明所述向导RNA序列(选中部分)的5’端为TTTN的PAM结构。该向导RNA序列在阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌中没有完全一致的序列，均有数个碱基的差异。且在阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌中的同源序列5’端均无TTTN的PAM结构，故而，使用本向导RNA，Cas12a蛋白无法靶向至阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌，因而，在检测时，只有产气肠杆菌可呈现阳性反应，其余肠杆菌属细菌呈阴性反应，可用于产气肠杆菌的特异性检测。
实施例2：本发明所述向导RNA特异性判定，步骤如下：
(1)准备产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌标准菌株；
(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；
(3)准备反应体系，反应体系为25μl，包括1μl检测样品，14.75μl水化TwistAmp basickit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQ No.2)和RPA-R(序列为SEQNo.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μl buffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工)，加水补至25μl；
(4)37摄氏度恒温反应30min；
(5)反应结束后，将PCR管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在产气肠杆菌，没有荧光则表示无产气肠杆菌污染。
检测结果如图2所示，样本1为产气肠杆菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非产气肠杆菌，无荧光，呈阴性反应。
实施例3:基于本发明所述向导RNA的检测法与传统PCR法特异性及实验耗时比较
1.基于本发明所述向导RNA的检测法，步骤如下：
(1)准备产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、杰高维肠杆菌、阪崎肠杆菌标准菌株；
(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；
(3)准备反应体系，反应体系为25μl，包括1μl检测样品，14.75μl水化TwistAmp basickit反应干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列为SEQ No.2)和RPA-R(序列为SEQNo.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μl buffer2.1(NEB公司)，1000nM向导RNA(序列为SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM单链DNA探针(上海生工)，加水补至25μl；
(4)37摄氏度恒温反应30min；
(5)反应结束后，将PCR管置于荧光显微镜下直接观察，有荧光证明样品中存在产气肠杆菌，没有荧光则表示无产气肠杆菌污染；
(6)检测结果如图2所示，样本1为产气肠杆菌，观察到荧光，呈阳性反应。其余样本非产气肠杆菌，无荧光，呈阴性反应。
2.传统PCR法实验步骤如下：
(1)设计引物，PCR引物序列为RPA引物5’端起始的20个碱基，使获得的PCR产物与RPA产物序列相同，引物对序列见SEQ No.4和SEQ No.5；
(2)取1ml待测样品，98摄氏度加热5min，吸取1μl作为检测样品；
(3)配置反应体系，包含12.5μl DNA聚合酶预混液(上海生工)，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl待测样品，9.5μl水；
(4)PCR反应；
(5)琼脂糖凝胶电泳；
(6)实验结果如图3所示，所有的样本均扩增出232bp大小片段，无法区别产气肠杆菌与其他种类肠杆菌。
如上所述，PCR法无法区分肠杆菌种类，故需要进行测序比对，实验成本高，用时长，可能延误病情。
如图4所示，使用基于本发明所述检测试剂盒的检测方法特异性高，耗时短，仅为1小时左右，而使用PCR法，由于不同种肠杆菌属细菌序列高度同源，在一段序列中差异常常仅为数个碱基，设计的引物常常所有菌株都能扩增，所得产物大小接近，无法通过琼脂糖凝胶区分，故而需要进行测序，实验耗时在2天左右。本发明所述方法耗时显著低于PCR组。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒
<130> 1
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
cgcugugcug guugccggug gcg 23
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
agaaagacaa gcgtgcgctt gaaatcgaag a 31
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
tgctcagcca gttgctccag ctgattttgt t 31
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 4
agaaagacaa gcgtgcgctt g 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
tgctcagcca gttgctccag ct 22
<210> 6
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
ttatt 5

Claims (4)

1.一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒，其特征在于，由特异性靶向产气肠杆菌rpoB基因的向导RNA、扩增引物对、水化TwistAmp基础试剂盒反应干燥球、LbCas12a蛋白、单链DNA探针、RNA酶抑制剂和缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种用于产气肠杆菌检测的试剂盒，其特征在于，其中特异性靶向产气肠杆菌rpoB基因的向导RNA的核苷酸序列如SEQ No.1所示，RPA扩增引物对的序列如SEQ No.2和SEQ No.3所示，单链DNA探针的序列如SEQ No.6所示。
3.根据权利要求1所述的产气肠杆菌检测的试剂盒进行产气肠杆菌快速检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：取1ml样品，95-98摄氏度加热5min，取1μl作为检测样品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反应干燥球，0.9μl10mM RPA-F和RPA-R，0.375μlRibonucleaseInhibitor，3.5μlbuffer2.1，1000nM向导RNA，250nM LbCas12a，200nM单链DNA探针，加水补至25μl，37摄氏度反应25-45min，通过荧光显微镜下直接观察检测体系荧光变化，进行产气肠杆菌检测，发黄绿色荧光说明有产气肠杆菌污染，不发光说明没有产气肠杆菌污染。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中RPA-F的序列如SEQ No.2所示，RPA-R序列如SEQ No.3所示，向导RNA序列如SEQ No.1所示。
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