CN116042926B - 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116042926B
CN116042926B CN202310070988.8A CN202310070988A CN116042926B CN 116042926 B CN116042926 B CN 116042926B CN 202310070988 A CN202310070988 A CN 202310070988A CN 116042926 B CN116042926 B CN 116042926B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
petits ruminants
peste des
des petits
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310070988.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116042926A (zh
Inventor
黄超华
花群义
阮周曦
吴江
曹琛福
林彦星
史卫军
周华亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Original Assignee
Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center filed Critical Shenzhen Customs Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center
Priority to CN202310070988.8A priority Critical patent/CN116042926B/zh
Publication of CN116042926A publication Critical patent/CN116042926A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116042926B publication Critical patent/CN116042926B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒。本申请提供了小反刍兽疫病毒特异性引物和特异性crRNA组合，将多酶恒温快速扩增技术MIRA与CRISPR‑Cas12a系统相结合，实现检测小反刍兽疫病毒核酸的可视化快速检测，与荧光PCR方法和其他恒温扩展方法相比，本方法反应快速，灵敏性高，特异性高，而且使用方便。

Description

一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒
技术领域
本申请属于生物检测技术领域，具体而言，涉及一种小反刍兽疫病毒可视化快速检测方法及其试剂盒。
技术背景
小反刍兽疫(PPR)是一种以山羊、绵羊、鹿、骆驼以及其他野生小反刍动物为主要感染对象的病毒性疾病，其病原体为小反刍兽疫病毒(PPRV)。PPR分为急性型、标准型和温和型，其典型临床症状为发热、腹泻、呼吸困难、口腔与鼻黏膜溃疡和结膜炎等。
普通RT-PCR、实时荧光RT-PCR是目前检测PPRV用的分子生物学方法。我国国家标准《小反刍兽疫诊断技术》中推荐的PPRV分子检测方法为针对N基因的普通RT-PCR、实时荧光RT-PCR，但这些方法均耗时较长，且操作复杂、需要大型仪器设备，不适合基层牧场的AHS病毒核酸检测，更不适用于野外病毒调查，特别是新疆、甘肃和青海等地区无人区以及毗邻有PPR疫情的东南亚边境线上林地或山地等区域的野生动物带毒状况的调查工作。虽然也文献报道基于RT-RPA的PPRV核酸检测方法，但其敏感性和特异性仍有不足。为此，亟需一种适用于野外检测的方法或试剂盒，既需满足操作简单、反应快速、结果直观可视，同时亦需高度敏感。
各类等温检测技术如环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)也有应用于PPRV检测，但在特异性和扩增效率方面存在不足。张锋等人发现Crispr-Cas12a在检测DNA方面有着较高的灵敏性和实用价值。利用CRISPR/Cas12a系统与RT-MIRA技术并结合侧向流试纸或荧光基团实现了检测的可视化，可进一步提升了检测的敏感性和便利性。基于此，本发明将RT-MIRA技术与CRISPR/Cas12a系统结合起来建立一种小反刍兽疫病毒核酸的快速可视化检测方法并组装成试剂盒，具有恒温、快速、便携式、可视化等优势，更有利于在口岸现场实现快筛式检测，便于在保障进出口小反刍动物及其产品在进出口环节的快速通关的同时，实现拒小反刍兽疫于国门之外；同时操作简单便利，亦可应用于小型养羊场以及野生小反刍动物的PPRV筛查工作。
鉴于此，提出本申请。
发明内容
为解决上述技术问题，本申请提出一种一种小反刍兽疫病毒核酸的快速可视化检测方法，该方法将多酶恒温快速扩增(MultienzymeIsothermalRapidAmplification)技术与CRISPR/Cas12a系统结合，具有恒温、快速、便携式、可视化、高敏感性等优势。而且适用于野外病毒调查，包括野生动物带毒情况；亦有利于在边境口岸现场实现快筛式检测，便于在保障进出口小反刍动物及其产品在进出口环节的快速通关的同时实现拒其他非国内流行的小反刍兽疫病毒毒株于国门之外。
因此，本申请的第一目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a的小反刍兽疫病毒可视化快速检测方法。
本申请的第二目的为提供一种基于CRISPR-Cas12a的小反刍兽疫病毒可视化快速检测试剂盒。
为达成上述目的，本申请具体提出如下技术方案：
本申请首先提供一种核酸组合物，其特征在于，所述组合物包括小反刍兽疫病毒特异性引物对和特异性crRNA，所述特异性引物对和特异性crRNA是针对小反刍兽疫病毒N基因。
进一步的，所述特异性引物对序列如下：
上游引物：5’-TGGTGCTGATTTGGACAAYGAGGCAGAYAT-3，
下游引物：5’-TGTGCTAAGATGGAGGCTAACAACATRTTGAACT-3’，
其中，Y是C/T，R是A/G；
所述特异性crRNAcrRNA序列如下：
5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAGAGAAAUAAUAGAC-3’，
或者，所述特异性引物对和特异性crRNA序列是与上述序列同源性大于95％以上的序列。
进一步的，所述特异性引物中，上游引物简并碱基Y中C/T比例为1:2,下游引物简并碱基R中A/G比例为2:1。
本申请还提供一种用于检测小反刍兽疫病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒中包括上述核酸分子组合物。
进一步的，所述试剂盒中还包括Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液等。
进一步的，所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol，所述buffer溶液的pH值为7.5-8，所述buffer中Mg2+浓度为5-10mM。
更优选的，所述Cas12a蛋白最优使用终浓度为10pmol，所述报告探针最优使用终浓度为200pmol，所述buffer溶液的最优pH值为7.5，buffer中最优Mg2+浓度为10mM。
本申请还提供上述任一所述的核酸组合物在检测小反刍兽疫病毒的应用。
本申请还提供上述任一所述的核酸组合物在制备检测小反刍兽疫病毒的试剂盒中的应用。
进一步的，所述检测包括如下步骤：
1)提取小反刍动物病料核酸；
2)加入上述任一所述核酸组合物中的上下游特异性引物进行MIRA扩增反应；
3)再加入上述任一所述核酸组合物中的特异性crRNA进行CRISPR-Cas12a反应；
4)结果判定。
进一步的，所述检测包括如下的具体步骤：
1)使用核酸快速释放剂快速提取小反刍动物病料核酸；
2)加入合适量的上述任一所述核酸组合物中的上下游特异性引物和反应所必需的buffer进行MIRA扩增反应，反应条件为：37-39℃，10-15min；优选的，反应条件为37℃，10min；
3)再加入上述任一所述核酸组合物中的特异性crRNA，以及Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液进行CRISPR-Cas12a反应；
进一步的，所述反应条件为：37-42℃，10-15min；优选的，反应条件为：37℃反应10min；
进一步的，所述crRNA使用终浓度为100-400pmol，所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针为6-FAM-TTATT-BHQ1(蓝光法探针)或6-FAM-TTATT-Biotin(试纸法探针)，使用终浓度为100-400pmol；所述bufferpH值为7.5-8，buffer中Mg2+浓度为5-10mM；
更优选的，所述crRNA最优添加量为200pmol，所述Cas12a蛋白最优使用终浓度为10pmol，所述报告探针最优使用终浓度为200pmol，所述bufferpH值最优为7.5，buffer中最优Mg2+浓度为10mM。
4)结果判定：采用蓝光法时，将反应管置于蓝光下，出现绿色荧光，即为小反刍兽疫阳性；采用侧向流试纸条时，在反应管中加入100uLddH2O，随后插入侧向流试纸条，T线显现，即为小反刍兽疫阳性。
本申请还提供一种检测小反刍兽疫的方法，所述方法包括如下步骤：
1)提取小反刍动物病料核酸；
2)加入上述任一所述核酸组合物中的上下游特异性引物进行MIRA扩增反应；
3)再加入上述任一所述核酸组合物中的特异性crRNA进行CRISPR-Cas12a反应；
4)结果判定。
进一步的，所述检测包括如下的具体步骤：
1)使用核酸快速释放剂快速提取小反刍动物病料核酸；
2)加入合适量的上述任一所述核酸组合物中的上下游特异性引物和反应所必需的buffer进行MIRA扩增反应，反应条件为：37-39℃，10-15min；优选的，反应条件为37℃，10min；
3)再加入上述任一所述核酸组合物中的特异性crRNA，以及Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液进行CRISPR-Cas12a反应；
进一步的，所述反应条件为：37-42℃，10-15min；优选的，反应条件为：37℃反应10min；
进一步的，所述crRNA使用终浓度为100-400pmol，所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol；所述bufferpH值为7.5-8，buffer中Mg2+浓度为5-10mM；
更优选的，所述crRNA最优添加量为200pmol，所述Cas12a蛋白最优使用终浓度为10pmol，所述报告探针为6-FAM-TTATT-BHQ1蓝光法探针)或6-FAM-TTATT-Biotin(试纸法探针)，最优使用终浓度为2000pmol，所述bufferpH值最优为7.5，buffer中最优Mg2+浓度为10mM。
4)结果判定：采用蓝光法时，将反应管置于蓝光下，出现绿色荧光，即为小反刍兽疫阳性；采用侧向流试纸条时，在反应管中加入100uLddH2O，随后插入侧向流试纸条，T线显现，即为小反刍兽疫阳性。
与现有技术相比，本申请的有益技术效果至少包括：
1)与现有CRISPR编辑系统检测方法相比，本申请试剂盒检测小反刍兽疫病毒核酸，反应更快速，操作更简单，在一个反应管中即可完成反应；而且灵敏度高，最低检出限与实时荧光PCR相当。
2)本申请通过设计筛选简并引物及crRNA、优化反应条件等大量工作，最终确定了检测体系，能对全部4个谱系的PPRV进行兼容性检测，而且与感染反刍动物重要的病毒比如BTV、EHDV、FMDV、CaPV和PRV等均无交叉反应，也与SVDV也无交叉反应，显示出很好的特异性。
3)本申请试剂盒更适用于边境区域或边缘山区小反刍兽疫病毒的野外调查工作。便携化设备、操作简单、反应快速、可视化以及高灵敏性等特点非常适宜于野生动物带毒情况的调查；在极端条件下，手握反应管20min左右即可完成检测。
4)本申请提供的试剂盒与海关口岸快筛实验室非常契合，只需少量小型仪器设备包括小型离心机、水浴锅或恒温干浴器即可实现快速检测，具有恒温、快速、便携式、可视化等优势，更有利于在口岸现场实现快筛式检测，便于在保障进出口小反刍动物及动物产品在进出口环节的快速通关的同时，实现拒其他非国内流行的小反刍兽疫病毒毒株于国门之外。
附图说明
图1、不同引物组合RT-RAA扩增结果；
图2、不同crRNA的荧光强度；
图3、不同pH值的荧光强度；
图4、不同Mg2+浓度的荧光强度；
图5、不同反应温度的荧光强度；
图6、不同crRNA量的荧光强度；
图7、不同CRISPR-Cas12a量的荧光强度；
图8、不同报告探针量的荧光强度；
图9、试纸法兼容性检测结果；其中，1：PPRV谱系I、2：PPRV谱系II、3：PPRV谱系III、4：PPRV谱系IV、5：阴性对照；
图10、蓝光法兼容性检测结果；其中，1：PPRV谱系I、2：PPRV谱系II、3：PPRV谱系III、4：PPRV谱系IV、5：阴性对照；
图11、试纸法特异性检测结果；其中，1：阳性对照；2：蓝舌病毒(BTV)核酸、3：鹿流行性出血热病毒(EHDV)核酸、4：口蹄疫病毒(FMDV)核酸、5：羊痘病毒(CaPV)核酸、6：猪水泡病毒(SVDV)核酸、7伪狂犬病毒(PRV)核酸、8：水对照；
图12、蓝光法特异性检测结果；其中，1：阳性对照；2：蓝舌病毒(BTV)核酸、3：鹿流行性出血热病毒(EHDV)核酸、4：口蹄疫病毒(FMDV)核酸、5：羊痘病毒(CaPV)核酸、6：猪水泡病毒(SVDV)核酸、7伪狂犬病毒(PRV)核酸、8：水对照；
图13、试纸法敏感性检测结果；其中，1：4.30×106拷贝/uL，2：4.30×105拷贝/uL，3：4.30×104拷贝/uL，4：4.30×103拷贝/uL，5：4.30×102拷贝/uL，6：4.30×101拷贝/uL，7：4.30×100拷贝/uL，8：阴性对照；
图14、试纸法敏感性检测结果；其中，1：4.30×106拷贝/uL，2：4.30×105拷贝/uL，3：4.30×104拷贝/uL，4：4.30×103拷贝/uL，5：4.30×102拷贝/uL，6：4.30×101拷贝/uL，7：4.30×100拷贝/uL，8：阴性对照；
图15、国家标准推荐的实时荧光RT-PCR敏感性试验结果；其中，其中，1：4.30×106拷贝/uL，2：4.30×105拷贝/uL，3：4.30×104拷贝/uL，4：4.30×103拷贝/uL，5：4.30×102拷贝/uL，6：4.30×101拷贝/uL，7：4.30×100拷贝/uL，8：阴性对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义，除非在下文中另有定义，本申请具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本申请。
本申请中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
如本申请中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本申请描述的实施方案能以不同于本申请描述或举例说明的其它顺序实施。
下面结合具体实施例来阐述本申请。
实施例1.小反刍兽疫病毒RT-MIRA特异性引物组的筛选
利用NCBIBlast功能对小反刍兽疫病毒N基因进行比对，分析其保守区域，并初步设计获得12对小反刍兽疫病毒RT-MIRA特异性引物组(表1)。合成引物并以RT-MIRA进行扩增筛选。
PPRVN基因全序列(SEQ ID NO.1)：
ATGGCTACTCTCCTTAAAAGCTTGGCATTGTTCAAGAGGAACAAAGACAAAGCGCCTACTGCGTCGGGTTCAGGAGGGGCCATCCGGGGGATTAAGAATGTTATCATAGTCCCCATTCCCGGGGACTCATCCATCATTACCCGTTCAAGACTGCTCGACAGGCTTGTCAGATTGGCCGGAGATCCTGACATCAACGGGTCAAAGCTGACCGGCGTGATGATCAGCATGTTATCTTTGTTCGTGGAGTCACCCGGGCAATTGATACAGCGGATCACAGATGATCCAGATGTTAGCATCCGCCTTGTTGAGGTAGTTCAAAGTACTAGGTCCCAGTCCGGGTTGACCTTTGCATCACGTGGTGCTGATTTGGACAATGAGGCAGATATGTATTTTTCAACTGAAGGACCCTCGAGTGGAAGTAAGAAAAGGATCAACTGGTTTGAGAACAGAGAAATAATAGACATAGAGGTGCAAGATGCAGAAGAGTTCAATATGTTGTTAGCCTCCATCTTAGCACAAGTTTGGATCCTCCTGGCCAAGGCGGTTACGGCACCGGATACGGCAGCTGACTCAGAACTGAGAAGGTGGGTTAAATACACACAACAAAGGAGAGTGATTGGGGAATTTCGCCTTGACAAAGGGTGGCTGGACGCAGTCCGCAACAGGATTGCAGAAGATCTATCACTTCGGCGGTTCATGGTATCTCTCATACTTGACATCAAAAGGACCCCCGGCAACAAGCCAAGGATTGCAGAAATGATCTGCGACATTGACAACTATATTGTAGAAGCCGGACTCGCCAGTTTCATTCTTACTATCAAATTTGGTATTGAAACCATGTATCCTGCATTAGGCCTTCACGAGTTCGCCGGGGAATTGTCCACTATTGAATCCTTGATGAACTTGTATCAACAGCTAGGAGAGGTTGCACCCTACATGGTGATTCTAGAGAACTCAATTCAGAACAAGTTTAGTGCAGGAGCCTATCCTCTCCTCTGGAGCTATGCGATGGGTGTCGGAGTCGAGTTGGAGAACTCAATGGGGGGCCTGAACTTTGGCAGGTCATATTTTGACCCGGCCTATTTCCGTCTCGGACAGGAGATGGTCAGAAGATCTGCAGGAAAGGTCAGCTCTGTAATCGCGGCTGAGCTTGGTATCACAGCAGAGGAAGCCAAACTAGTCTCGGAAATCGCCTCACAGACTGGGGATGAACGAACCGTCAGAGGGACTGGGCCTCGACAGGCGCAGGTCTCCTTCCTCCAGCATAAAACAGATGAGGGAGAGTCGCCTACACCAGCGACCAGAGAAGAAGTCAAAGCTGCGATCCCAAATGGGTCCGAAGGAAGGGACACAAAGCGAACACGCTCAGGAAAGCCCAGAGGAGAAACTCCCGGCCAACTGCTTCCGGAGATCATGCAAGAGGATGAACTCTCGCGAGAGTCTAGTCAAAACCCTCGTGAGGCTCAAAGATCGGCTGAGGCACTCTTCAGGCTGCAGGCCATGGCCAAGATTCTGGAGGACCAGGAGGAGGGAGAAGACAACAGTCAGATCTACAACGACAAGGATCTCCTCAGCTGAGCAGACGCACCCTCCGTCCAAATCAGTGACAAGACATCGCCCGCCAGTATTATAA。
RT-MIRA体系41.5uLAbuffer、2uL特异性上游引物、2uL特异性上游引物、2uL小反刍兽疫病毒核酸和2.5uLMg2+(250nM)，反应条件为42℃，30min；反应后通过毛细电泳观察扩增产物。
结果表明：3对引物组合没有扩增条带，9对引物组合出现扩增条带；其中，组合2、3、6、10和11的扩增条带最为清晰、无非特异性扩增，具体结果见图1。因此，选取组合2、3、6、10和11为RT-MIRA特异性引物，进行下一步的试验。
表1、小反刍兽疫病毒RT-MIRA引物组合
考虑到小反刍兽疫病毒存在4个基因谱系，本实施例对上述筛选出的引物组合2、3、6、10和11与小反刍兽疫病毒的4个基因谱系进行对比分析，结果发现均存在不同程度的碱基变异。为此，本实施例在上述筛选出的引物序列的基础上，根据4个基因谱系的碱基变异合成了对应的简并碱基，具体见表2。
表2、小反刍兽疫病毒RT-MIRA简并引物组合
其中，M对应A/C,R对应A/G,W对应A/T，S对应C/G，Y对应C/T，K对应G/T,V对应A/C/G，H对应A/C/T,D对应A/G/T，B对应C/G/T，N对应A/G/C/T。
实施例2.小反刍兽疫病毒特异性crRNA的制备与筛选
1、小反刍兽疫病毒特异性crRNA的制备
考虑到Cas12a识别的PAM为TTTN，本实施例分析组合2、3、6、10和11间的小反刍兽疫病毒核酸序列，选取PAM序列后的20-23bp，并在其前加上T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)和LbCas12a的scaffold序列(AATTTCTACTAAGTGTAGAT)，从而获得7个小反刍兽疫病毒特异性crRNA序列(见表3)。
表3、小反刍兽疫病毒特异性crRNA(不含启动子序列)
crRNA1 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUCACGUGGUGCUGAUUU-3’
crRNA2 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAGAGAAAUAAUAGAC-3’
crRNA3 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUCAACUGAAGGACCCUCGAG-3’
crRNA4 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUAUUGAAACCAUGUAUCCU3’
crRNA5 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGUGCAGGAGCCUAUCCUCUC-3’
crRNA6 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGCUGGAGGAAGGAGACCU-3’
crRNA7 5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGACGGAGGGUGCGUCUGCUC-3’
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述寡核苷酸链以及反向互补链。按照10uL上游寡核苷酸链(浓度10uM)、10uL下游寡核苷酸链(浓度10uM)、5uL10×NEBbuffer3和25uLddH2O配制退火体系，95℃变性5min，在室温下慢慢退火降温，合成DNA双链，利用NanoDrop2000蛋白/核酸定量仪进行核酸浓度测定。
利用T7体外转录试剂盒和RNA纯化试剂盒转录纯化获得crRNA。T7体外转录体系为2uL T7polymerase、10uLNTPMix、10ugDNA，加RNase-FreeddH2O补足至总体系20uL，转录条件为37℃，2h。以miRNeasyMiniKit(Qiagen)纯化试剂盒纯化，并测定最终获得的crRNA浓度。
2、小反刍兽疫病毒特异性crRNA的筛选
以实例1的筛选获得的特异性引物组合和反应体系与条件进行RT-MIRA扩增，取其产物进行CRISPR-Cas12a检测从而对上述crRNA进行筛选。
CRISPR-Cas12a反应体系(总体系7uL)：0.5μLCas12a蛋白溶液(含5pmol蛋白)、0.75μLRNA酶抑制剂、0.25μL特异crRNA(含100pmol)、0.5μL报告探针(50pmol)、5μL10×buffer。将配制的7uLCRISPR-Cas12a反应体系加入到RT-MIRA反应管中。反应条件为37℃，10min。
随后，取反应产物进行琼脂电泳，并通过ImageJsoftware测定荧光强度。
结果见图2，结果显示，序列crRNA2所产生的荧光最强。由于crRNA5的序列在RT-MIRA特异性引物组合3所在的序列之中，为此，最终确定RT-RAA特异性引物组合为组合3。即序列体系为：
上游引物序列为：5’-TGGTGCTGATTTGGACAAYGAGGCAGAYAT-3’；
下游引物序列为：5’-TGTGCTAAGATGGAGGCTAACAACATRTTGAACT-3’；
crRNA序列为：5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAGAGAAAUAAUAGAC-3’。
实施例3.方法优化和试剂盒制备
以实例1和2筛选获得的小反刍兽疫病毒特异性RT-MIRA引物和crRNA为基础，进一步优化RT-MIRA的反应条件和CRISPR-Cas12a反应条件。
1、RT-MIRA反应条件的优化
分别以37℃、39℃和42℃进行RT-MIRA扩增，并以毛细电泳进行分析，结果显示，三者扩增效果没有显著差异，考虑到CRISPR-Cas12a最优反应温度(见下)，因此选择RT-MIRA的扩增温度为37-39℃，最优为37℃。
2、CRISPR-Cas12a反应条件
1)为确定CRISPR-Cas12a反应的最优Buffer，本实施例部配制了不同组合的反应Buffer，主要成分包括：20mMTris-HCl、100mMKCl、5mM-200mMMgCl2、5％甘油、5ug/mLDTT。保持其他组分不变，改变pH值；保持其他组分不变，改变Mg2+的浓度，进行CRISPR-Cas12a反应，以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果见图3和4，确定适合的pH值为7.5-8，最适为7.5；而Mg2+的适合浓度为5-10mM，最适为10mM。
2)为确定最佳的反应温度，分别以30℃、37℃、42℃和50℃进行CRISPR-Cas12a反应，以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果见图5，确定适合的反应温度为37-42℃，最适温度为37℃。
3)体系中crRNA用量的优化
为确定体系中crRNA最佳添加量，分别以体系中添加20pmol、50pmol、100pmol、200pmol和400pmol的crRNA进行CRISPR-Cas12a反应，以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果见图6，确定反应体系中crRNA适合添加量为100-400pmol，最适量为200pmol。
4)体系中CRISPR-Cas12a量的优化
为确定体系中CRISPR-Cas12a最佳添加量，分别以体系中添加1pmol、2.5pmol、5pmol、10pmol和20pmol的CRISPR-Cas12进行CRISPR-Cas12a反应，以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果见图7，确定反应体系中CRISPR-Cas12a适合添加量为5-20pmol，最适量为10pmol。
5)体系中报告探针量的优化
为确定体系中报告探针(6-FAM-TTATT-BHQ1)的最佳添加量，分别以体系中添加20pmol、50pmol、100pmol、200pmol和400pmol的报告探针进行CRISPR-Cas12a反应，以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果见图8，确定反应体系中报告探针适合添加量为100-400pmol，最适量为200pmol。
6)简并引物配比的优化
为确定反应体系中简并引物最佳比例，分别以不同比例的简并引物:上游C/T(1:1)、上游C/T(2:1)、上游C/T(1:2)和下游A/G(1:1)、下游A/G(2:1)、下游A/G(1:2)对四种基因谱系的PPRV核酸(由生工合成并通过转录获得相应的RNA片段)进行检测，并以琼脂电泳和ImageJsoftware测定荧光强度进行评价。
结果显示，在上游C/T(1:2)和下游A/G(2:1)时，对四种基因谱系的PPRV核酸进行检测的得到的荧光强度均超过100,000，具体见表4。由此，确定上游引物的简并碱基Y中C/T的比例为1:2，而下游引物的简并碱基R中A/G的比例为2:1。
表4、简并引物配比优化结果
由此，本发明确定RT-MIRA-CRISPR-Cas12a可视化检测小反刍兽疫病毒核酸的试剂盒主要步骤、反应条件和体系如下：
1)提取小反刍动物病料核酸
2)RT-MIRA扩增，依次加入41.5uLAbuffer、2uL特异性上游引物、2uL特异性上游引物、2uL马属动物病料核酸和2.5uLMg2+(250nM)等，混匀后瞬时离心，37℃反应10min。
3)CRISPR-Cas12a反应，按照总体系7uL：0.5μLCas12a蛋白溶液(含10pmol蛋白)、0.75μLRNA酶抑制剂、0.25μL特异crRNA(含200pmol)、0.5μL报告探针(5'6-FAM–TTATT-BHQ13')(200pmol)、5μL10×buffer。将7uL反应体系加入到(2)RT-MIRA反应管中，混匀，37℃反应10min；
4)结果判定，将反应管置于蓝光下，出现绿色荧光，即为小反刍兽疫阳性。
同时，本申请还提供了一种通过侧向流试纸实现监测结果的可视化方法，其主要步骤、反应条件和体系如下：
1)提取小反刍动物病料核酸
2)RT-MIRA扩增，依次加入41.5uLAbuffer、2uL特异性上游引物、2uL特异性上游引物、2uL马属动物病料核酸和2.5uLMg2+(250nM)等，混匀后瞬时离心，37℃反应10min。
3)CRISPR-Cas12a反应，按照总体系7uL：0.5μLCas12a蛋白溶液(含10pmol蛋白)、0.75μLRNA酶抑制剂、0.25μL特异crRNA(含200pmol)、0.5μL报告探针(5'6-FAM–TTATT-Biotin3')(200pmol)、5μL10×buffer。将7uL反应体系加入到(2)RT-MIRA反应管中，混匀，37℃反应10min；
4)结果判定：将100μLddH2O加入反应管，随后侧向流试纸条(北京宝盈同汇生物技术有限公司产品)插入到反应液中，2～5min后观察T线和C线显现情况，T线出现明显条带，即为小反刍兽疫阳性。
同时，本申请将上述体系制备成相应的检测试剂盒，该检测试剂盒中包含小反刍兽疫病毒特异性引物对5’-TGGTGCTGATTTGGACAAYGAGGCAGAYAT-3’和5’-TGTGCTAAGATGGAGGCTAACAACATRTTGAACT-3’；crRNA5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGA ACAGAGAAAUAAUAGAC-3’，以及用于MIRA扩增的酶组合和反应所必需的buffer等，以及用于CRISPR-Cas12a反应的Cas12a蛋白、RNA酶抑制剂、报告探针和反应所必需的buffer等组分。
实施例4.兼容性和特异性评价
为确定本申请能否检出4种谱系的小反刍兽疫病毒。本实施例制备了4种谱系的小反刍兽疫病毒的RNA片段，并分别以本申请的方法及试剂盒进行检测。
检测结果如图9和图10所示，均为阳性，说明本试剂盒对小反刍兽疫病毒的4个谱系均有效。
为确定本申请的特异性，以本发明对蓝舌病毒(BTV)、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、猪水泡病毒(SVDV)、伪狂犬病毒(PRV)等病毒核酸进行检测，结果见图11-12，试纸法(图11)和蓝光法(图12)均未检出前述病毒核酸，说明本发明有良好的特异性。
实施例5.敏感性评价
为确定本发明的敏感性，将小反刍兽疫病毒核酸稀释至4.30×106-4.30×100，同时以本发明和WOAH推荐的实时荧光RT-PCR方法进行检测，结果如图13-14所示：试纸法(图13)和蓝光法(图14)的最低检出线均能达到病毒核酸4.30×101，而且与国家标准《小反刍兽疫诊断技术》推荐的实时荧光RT-PCR方法相当(结果见图15)。
实施例6.符合性试验
为确定本方法与国家标准《小反刍兽疫诊断技术》推荐的实时荧光RT-PCR方法的符合性，申请人制备了60份模拟样品，由其他未知情的实验人员分别以前述两种方法进行检测。结果显示，Kappa值为0.918＞0.75，说明本研究建立的小反刍兽疫病毒可视化检测方法与国家标准《小反刍兽疫诊断技术》推荐的实时荧光RT-PCR方法具有高度一致性(表5)。
表5、符合性试验结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种核酸组合物，其特征在于，所述组合物包括小反刍兽疫病毒特异性引物对和特异性crRNA，所述特异性引物对和特异性crRNA是针对小反刍兽疫病毒N基因；
所述特异性引物对序列如下：
上游引物：5’-TGGTGCTGATTTGGACAAYGAGGCAGAYAT-3，
下游引物：5’-TGTGCTAAGATGGAGGCTAACAACATRTTGAACT-3’，
其中， Y是C/T，R是A/G；
所述特异性crRNA序列如下：
5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAGAGAAAUAAUAGAC-3’；
所述特异性引物对中，上游引物简并碱基Y中C/T比例为1:2,下游引物简并碱基R中A/G比例为2:1。
2.一种用于检测小反刍兽疫病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的核酸分子组合物；所述试剂盒中还包括Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液；所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol，所述buffer溶液的pH值为7.5-8，所述buffer中Mg2+浓度为5-10mM。
3.权利要求1所述的核酸组合物在制备检测小反刍兽疫病毒的试剂盒中的应用；
所述检测包括如下具体步骤：
1）使用核酸快速释放剂快速提取小反刍动物病料核酸；
2）加入权利要求1所述核酸组合物中的游特异性引物进行MIRA扩增反应，反应条件为：37-39℃，10-15min；
3）加入权利要求1所述核酸组合物中的特异性crRNA，以及添加Cas12a蛋白、报告探针和反应所需buffer溶液，进行CRISPR-Cas12a反应；反应条件为：37-42℃，10-15min；所述crRNA使用终浓度为100-400pmol，所述Cas12a蛋白使用终浓度为5-20pmol，所述报告探针使用终浓度为100-400pmol；所述buffer pH值为7.5-8，buffer中Mg2+浓度为5-10mM；
4）结果判定，将反应管置于蓝光下，出现绿色荧光，即为小反刍兽疫阳性；或将侧向流试纸条插入反应管中，T线显现，即为小反刍兽疫阳性。
CN202310070988.8A 2023-01-12 2023-01-12 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒 Active CN116042926B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310070988.8A CN116042926B (zh) 2023-01-12 2023-01-12 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310070988.8A CN116042926B (zh) 2023-01-12 2023-01-12 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116042926A CN116042926A (zh) 2023-05-02
CN116042926B true CN116042926B (zh) 2023-09-15

Family

ID=86129338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310070988.8A Active CN116042926B (zh) 2023-01-12 2023-01-12 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042926B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116676407A (zh) * 2023-06-25 2023-09-01 新乡医学院 一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676697A (zh) * 2012-05-15 2012-09-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒
CN105567872A (zh) * 2016-01-19 2016-05-11 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速检测小反刍兽疫病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途
CN112159854A (zh) * 2020-10-28 2021-01-01 上海市食品药品检验所 一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法
CN114774565A (zh) * 2022-03-30 2022-07-22 吉林大学 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法
CN115029459A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 华南农业大学 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676697A (zh) * 2012-05-15 2012-09-19 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 检测小反刍兽疫病毒的引物和探针及试剂盒
CN105567872A (zh) * 2016-01-19 2016-05-11 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速检测小反刍兽疫病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途
CN112159854A (zh) * 2020-10-28 2021-01-01 上海市食品药品检验所 一种大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a检测用引物组合物和检测方法
CN114774565A (zh) * 2022-03-30 2022-07-22 吉林大学 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法
CN115029459A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 华南农业大学 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116042926A (zh) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
CN111593141A (zh) 基于rpa的恒温可视化新型冠状病毒快速检测试剂盒及检测方法
CN112725537A (zh) 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111518960A (zh) 一种用于冠状病毒分型检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN105603123B (zh) 快速检测猪细小病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途
CN113201594A (zh) 一种食源性唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测方法
CN116042926B (zh) 一种小反刍兽疫病毒核酸可视化快速检测方法及其试剂盒
CN113462820A (zh) 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN112239794B (zh) 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
CN111534514A (zh) 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒
CN115852052A (zh) 一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法
CN110408727B (zh) 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用
CN106434989B (zh) 烟草赤星病菌的lamp快速检测方法
CN110157837B (zh) 一种检测小反刍兽疫病毒和蓝舌病病毒的引物及方法
CN116064963B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a的非洲马瘟病毒可视化快速检测方法及其试剂盒
CN102154487A (zh) 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
CN111471800A (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN111304364B (zh) 检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
CN110129460B (zh) 超级细菌两种耐药基因的双重qPCR试剂盒及检测方法
CN115449563A (zh) 一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒
KR102076343B1 (ko) 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도
CN112391493A (zh) 柑橘黄龙病亚洲种的raa荧光检测方法、引物探针及试剂盒
CN112899385A (zh) 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用
CN111996272A (zh) 耐药基因mcr-8的RPA检测引物组、试剂盒和方法
CN112662811A (zh) 一种新型冠状病毒4基因区段多重核酸检测试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant