CN116676407A - 一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法，涉及生物检测领域。本发明利用恒温快速扩增技术和CRISPR‑Cas技术偶联，建立阴道毛滴虫快速检测方法，并使用胶体金侧流层析试纸条将检测结果快速可视化，克服了常规PCR技术对精密热循环仪和琼脂糖水平电泳仪的需求，敏感性高，最低检测限为0.1pg/μL。

Description

一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法。

背景技术

阴道毛滴虫是寄生于人体阴道和泌尿道的鞭毛虫，主要引起滴虫性阴道炎和尿道炎，是一种常见的性传播寄生虫。目前，对于阴道毛滴虫的诊断方法大概可以分为三类，分别是常规诊断，免疫诊断，分子诊断。

常规诊断主要包括湿片镜检法和培养法；其中，湿片镜检法主要在临床诊断中采用，由于湿片镜检法敏感度仅有60-70％，经常出现漏检情况，需要与培养法结合进行诊断，除需要显微镜和体外培养设备等条件外，还需要较长的时间，难以进行快速诊断。

免疫诊断，主要是检测阴道毛滴虫的特异性抗原，方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光法等方法。在快速诊断领域中表现出比湿片镜检法和培养法更好的敏感性和特异性，但诊断费用相对较高，临床未大规模应用。

分子生物学诊断是阴道毛滴虫的常规诊断方法之一。其中，以PCR为代表的分子生物学诊断技术在物种鉴别检测中愈发常用和普及，该方法具有高度敏感性和特异性，尤其是在种间鉴别诊断方面具有独特优势。但是，PCR需要专门的设备，包括精密的热循环仪器、专业技术人员和冷链来保存热不稳定试剂，一般是在专门的检测中心来完成检测，通常远离感染高风险人群，现场检测有一定局限性，限制了其推广应用。因此，PCR检测通常只在实验室中使用，很少用于临床初始诊断。

因此，需要找到一种更加快速简便、准确度高的检测方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阴道毛滴虫的检测试剂及其试剂盒和检测方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂组合，其包括第一试剂和第二试剂；所述第一试剂包括用于恒温扩增阴道毛滴虫或其靶基因的引物对，所述引物对的上游引物包括SEQ ID NO:5～10所示序列中的任意一种或多种，下游引物包括SEQ ID NO:11～14所示序列中的任意一种或多种；所述第二试剂包括：用于靶向所述引物对的扩增产物或所述扩增产物的转录产物的CRISPR/Cas系统。

第二方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述实施例所述的试剂或试剂组合。

第三方面，本发明实施例提供了前述实施例所述的检测试剂或试剂组合在制备阴道毛滴虫检测试剂盒中的应用。

第四方面，本发明实施例提供了一种阴道毛滴虫的检测方法，其包括：采用前述实施例所述的试剂或试剂组合或前述实施例所述的试剂盒对样本进行检测；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

本发明具有以下有益效果：

本发明利用恒温快速扩增技术和CRISPR-Cas技术偶联，建立阴道毛滴虫快速检测方法，并使用胶体金侧流层析试纸条将检测结果快速可视化，克服了常规PCR技术对精密热循环仪和琼脂糖水平电泳仪的需求，敏感性高，最低检测限为0.1pg/μL。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为不同上游引物和下游引物的效果验证；其中，A为上游引物的相关结果，序号1为TV-F1和TV-R1，扩增片段183bp；序号2为TV-F2和TV-R1，扩增片段210bp，序号3为TV-F3和TV-R1，扩增片段235bp，M为2000bp Marker，N为阴性对照；B为下游引物的相关结果，序号1为TV-F1和TV-R1，扩增片段235bp；序号2为TV-F1和TV-R2，扩增片段266bp，序号3为TV-F1和TV-R3，扩增片段299bp，M为2000bp Marker，N为阴性对照；C为TV-F3和TV-R1引物组合的性能测试，序号1～6分别代表模板浓度10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL和0.1fg/μL，M为2000bp Marker，N为阴性对照；D为TV-F5和TV-R6引物组合的性能测试，序号1～6分别代表模板浓度10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL和0.1fg/μL，M为2000bpMarker，N为阴性对照；

图2为MIRA反应时间验证，其中，序号1～6分别代表孵育时间为15、20、25、30、35、40min，M为2000bp Marker，N为水(阴性对照)；

图3为MIRA反应温度验证，其中，序号1～4分别代表孵育温度为25、37、39、45℃，M为2000bp Marker，N为水(阴性对照)；

图4为CRISPR/Cas13a-LF体系验证；其中，A为反应体系一，序号1～2为阴性对照组，3～4为10fg/μL阳性质粒模板组；B为反应体系二，1-2为阴性对照组；3-4为10fg/μL阳性质粒模板组；C为RNA胶体金型reporter1和RNA胶体金型reporter2的效果对比；序号1、4为水，2～3为RNA胶体金型reporter1(1μM，13U)，模板浓度依次为10pf/μL和1pf/μL，5～6为RNA胶体金型reporter2(1μM，6U)，模板浓度依次为10pf/μL和1pf/μL；

图5为特异性测试结果；其中，A为MIRA恒温扩增后的核酸电泳图，序号1～7的模板名称依次为阴道毛滴虫样本DNA、乳酸杆菌样本DNA、大肠杆菌样本DNA、弓形虫样本DNA、金黄色葡萄球菌样本DNA、蓝氏贾第虫样本DNA、白色念珠菌样本DNA、M为2000bp Marker，N为水(阴性对照)；B为试纸条的结果，序号1～7的模板名称依次为阴道毛滴虫样本DNA、乳酸杆菌样本DNA、大肠杆菌样本DNA、弓形虫样本DNA、金黄色葡萄球菌样本DNA、蓝氏贾第虫样本DNA、白色念珠菌样本DNA；

图6为灵敏度检测结果；其中，A以含有靶基因序列的载体作为模板；B以阴道毛滴虫基因组DNA作为模板；

图7为临床样本实验结果；其中，A为巢氏PCR临床样本检测，1-30为样本编号，+：阳性DNA对照；-：阴性对照；(B)MIRA-CRISPR/Cas13a-LFD可视化检测方法结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明公开了一种基于阴道毛滴虫多拷贝序列(GenBank:L23861.1)的快速检测方法，并进行了一系列条件优化实验和特异性、敏感性检测，最终在临床样本中进行了验证，发明了一种简便、准确、快捷的阴道毛滴虫分子生物学检测方法。

一方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂组合，其包括第一试剂和第二试剂；

所述第一试剂包括用于恒温扩增阴道毛滴虫或其靶基因的引物对，所述引物对的上游引物包括SEQ ID NO:5～10所示序列中的任意一种或多种，下游引物包括SEQ ID NO:11～14所示序列中的任意一种或多种；

所述第二试剂包括：用于靶向所述引物对的扩增产物或所述扩增产物的转录产物的CRISPR/Cas系统。

在一些实施方式中，所述上游引物包括SEQ ID NO:8所示序列，所述下游引物包括SEQ ID NO:13所示序列。

在一些实施方式中，所述第一试剂还包括：恒温扩增试剂和/或RNA转录试剂。

在一些实施方式中，所述恒温扩增试剂包括：MIRA恒温扩增试剂、RPA恒温扩增试剂和RPA恒温扩增试剂中的任意一种或多种。

在一些实施方式中，所述恒温扩增试剂为MIRA恒温扩增试剂。

在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas系统包括CRISPR-Cas13a。

在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas13a的crRNA的核苷酸如SEQ ID NO:15所示。在一些实施方式中，所述第二试剂还包括：Cas蛋白和RNA探针中的至少一种。

在一些实施方式中，所述RNA探针包括：RNA探针1和RNA探针2中的任意一种或两种，所述RNA探针1的核苷酸序列为：UUUUUUUUUUUUU，所述探针2的核苷酸序列为：UUUUUU。

在一些实施方式中，所述RNA探针的序列5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团或Bio。

所述荧光报告基团包括FAM、VIC、NEX、ROX、TAMRA、JOE、CY3、CY5、Texas Red和TET中的任意一种。

在一些实施方式中，所述试剂或试剂组合还包括：侧向流试纸条。

本发明利用多酶恒温快速扩增技术(MIRA)和CRISPR/Cas13a-LFD(LFD:Lateralflow device测流层析/测流层析试纸条)技术偶联，建立阴道毛滴虫快速检测方法，并使用胶体金侧流层析试纸条将检测结果快速可视化。该方法克服了常规PCR技术对精密热循环仪和琼脂糖水平电泳仪的需求，在25～45℃温度范围内均可完成扩增反应；大大缩短了检测时间。

与现有检测阴道毛滴虫(RPA-CRISPR-Cas12a)的方法相比，本申请优化了检测的靶基因，通过阴道毛滴虫多拷贝序列(基因组中存在该序列100个拷贝以上，GenBank:L23861.1)为靶基因进行检测，敏感性高，最低检测限为0.1pg/μL。同时，本申请设计的引物中包含T7启动子序列，进一步提高了特异性，即使MIRA步骤中可能存在非特异性扩增，CRISPR-Cas13a也能够精准识别阴道毛滴虫特征性序列，可鉴别检测出金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、蓝氏贾第鞭毛虫、刚地弓形虫。

另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的试剂或试剂组合。

另一方面，本发明实施例还提供了前述任意实施例所述的检测试剂或试剂组合在制备阴道毛滴虫检测试剂盒中的应用。

此外，本发明实施例还提供了一种阴道毛滴虫的检测方法，其包括：采用前述任意实施例所述的试剂或试剂组合或前述任意实施例所述的试剂盒对样本进行检测；

所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。不以疾病的诊断或治疗为目的的情况包括：当待测样本为阴性对照、环境样本或人工制备的样本时，检测的直接目的并未是疾病的诊断与治疗。

在一些实施方式中，所述检测的步骤包括：对样本进行恒温扩增，获得扩增产物；将所述扩增产物作为CRISPR/Cas的反应底物进行核酸切割。

在一些实施方式中，其包括：所述恒温扩增的时间为20～40min，具体可以为20、25、30、35min中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述恒温扩增的时间为25～35min。

在一些实施方式中，所述恒温扩增的时间为30min。

在一些实施方式中，所述恒温扩增的温度为37～45℃，具体可以为37、38、39、40、41、42、43、44、45℃中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述恒温扩增的温度为39℃。

在一些实施方式中，所述核酸切割的反应体系包括：4～6μM LwaCas13a0.5～2μL，扩增产物1～3μL，0.1～2μM crRNA1.5～3μL，0.1～2μM RNA探针0.5～2μL，8～12U RNase抑制剂0.5～2μL，10×Transcription Buffer 1～3μL，40～60U/μL T7 RNA聚合酶1～3μL，80～120mM ATP 0.1～1μL，80～120mM CTP 0.1～1μL，80～120mM GTP 0.1～1μL，80～120mMUTP 0.1～1μL，水6～8μL。

在一些实施方式中，所述核酸切割的反应条件为：30～40℃，10～30min。该时间具体可以为30、32、34、36、38、40℃中的任意一种或任意两种之间的范围；该时间具体可以为10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30min中的任意一种或任意两种之间的范围。

在一些实施方式中，所述核酸切割的反应条件为：27℃，20min。

在一些实施方式中，所述检测方法还包括：将切割反应的产物至于测流层析试纸条中显色或直接进行凝胶电泳检测。

在一些实施方式中，所述样本的类型可以包括：环境样本、阴性对照、标准品、质控品和临床样本中的任意一种。所述临床样本具体可以为阴道分泌物样本。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例涉及到的材料和试剂

材料：阴道分泌物样品(每份约1g)，阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、乳酸杆菌(Lactobacillus taiwanensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Monilia albican)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialambila)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)基因组DNA(金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫从阴道分泌物中分离获得；刚地弓形虫从血液中分离获得；蓝氏贾第鞭毛虫从粪便中获得。)。

试剂：NTP套装；T7 RNA Polymerase；Murine Rnase Inhibitor；LwaCas13a；cas13专用核酸检测试纸条；DNA恒温快速扩增试剂盒；基因组提取试剂盒；DNA分子量标准Marker(100～2000bp)；琼脂糖；电泳缓冲液；Gelred核酸染料(10000×)。2×Taq Plus MasterMix(Dye Plus)酶(南京诺唯赞)。

实施例1

一、实验方法

(1)核酸提取：收集临床检测为阴道毛滴虫阳性的阴道分泌物样品，使用基因组提取试剂盒提取阴道毛滴虫基因组DNA，-20℃保存，备用；

(2)引物和探针设计：根据GeneBank提供的阴道毛滴虫L23861.1多拷贝基因序列信息，设计并合成多组引物和探针序列；

(3)引物筛选：根据待测样本、阴性和阳性对照的数量准备的恒温扩增试剂，并配置好反应Mix(A buffer，29.4μL；上游引物，2μL；下游引物，2μL；ddH₂O，4.1μL；共37.5μL)，每个干粉反应管加入37.5μL反应Mix复融；向复融后的体系中加入10μL模板，并在管盖中加入2.5μL BBuffer后扣好管盖；上下甩动复融后的干粉10～20下，随后离心，并去除气泡后，立即将反应管放入金属浴中37℃孵育30min；反应结束后，加入50μL抽提反应溶液，12000rpm离心5min，取1μL 6×loading buffer与5μL上清液混合后在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳程序为120V 35min，根据目的条带扩增情况筛选出扩增效率高、特异性最好的引物对；

(4)恒温扩增反应时间验证：以提取的阴道毛滴虫因组DNA为模板，按照(3)中的反应体系、步骤以及引物组合进行MIRA扩增，在不同的反应时间(15、20、25、30、35、40min)点终止反应，通过琼脂糖凝胶电泳验证恒温扩增的最优检测时间；

(5)恒温扩增反应温度验证：以提取的阴道毛滴虫因组DNA为模板，按照(3)中的反应体系、步骤以及引物组合进行MIRA扩增，在不同温度(25、37、39、45℃)下扩增，通过琼脂糖凝胶电泳验证恒温扩增的最优检测温度；

(6)CRISPR-Cas13a-LF体系验证：使用最优引物，(引物序列TV-F5:5'-ACTTGCAATGACACTCAAATTGCTTATGAA-3',TV-R6:5'-AATGTTCGACAATAGGTTTTAATGTGGTTACTAAGCCAC-3')，以及最优温度和时间(39℃，30min)进行恒温扩增，恒温扩增的产物直接在T7转录、CRISPR-Cas13a和探针体系(体系一，体系二)中反应，最终反应产物通过胶体金侧流层析试纸条中显色，观察C线与T线是否出现条带，T线与C线同时出现条带或只有T线出现条带为阳性，只有C线出现条带为阴性，若无条带为失效。验证CRISPR-Cas13a-LF体系各成分的占比对反应的影响；

二、实验结果

(1)MIRA恒温扩增优选引物

本发明针对阴道毛滴虫多拷贝基因序列(GeneBank:L23861.1)，共设计7对引物和2个探针，所设计的引物及探针序列信息如表1所示。

阴道毛滴虫多拷贝基因序列(5’-3’)：

CACACCCCAAACTTGCAATGACACTCAAATTGCTTATGAATTCGACATGGGATATTCCATTAAGAAACCTCAAGAGATGACAAGAGTAAATTATGAGAAGGTCGACAACTTTGTTGAAAGGTTTTCTCCTTTTGTTTTGAAGTACGAATTCACTCAAGGTCAAAGTGGCTTAGTAACCACATTAAAACCTATTGTCGAACATTGGTCTTACCCTCAGTTCGCAAAGGCAGTCCTTGACAACTACAACAAATTCTTCTCCGAAGTCAAATCCAAAGTGAAGGTTTACTATGAGAACATTGACGCACTCATGACGAACGAAGAAGGGTACAACAAACTCATTGAAATGGGAATGGTCGCTGAAAAGATGGGTGTTTTAAGCTAGATAAGGTATTTTCCGAAGTTCATGTCCTCTCCAAGCGTAAGTACTGGGGCATACTTGAAGACGGCACAGAAATAAAACATTGCATGAAATAAAAAATTTTTAGTTCTGAATTTGAATGTGGTATGGGTAGGCTTGGGAAGGGAATAGGCATGGTGGAGGAGGAGGGTACAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAACAGTCCATTTTTATATTCCTTCCTAGCTAATTTCCGTTTAATTTCATGGTCGCCCTCGGAGTCTTTGAATCGGATAGGTCGAGTTACACCATTCTTGGTCTCAAACTCATATATAACCTGTTTGTCTGTATTTTGCTCGACTATGGCACGAGACACAAACATTGACCACACGGACAAAAAGTGTCATTTCGGATGGTCAAGCAGCCAATCGCATTCGAGCACTTCGAAGAAGCCTTTACGTTCCAAGGGAGAGGGTGTCTGGTGCAAGGCAGAGGTCATGCCACTCTACGAGCAGTACAGTTCCCCTGGGAGAACATTTCGTCCTTGGATTGGCAATACTACCAACTCCTCTGGGACGACCTCCTACGCAACTGGGTTAACGATTGTGTCCACTTCAAAGGTCGGGAACTAATTTGGAAAATTACCCTTAATTTCCCATCC。

表1引物和探针的序列信息

备注：1、下划直线标出T7启动子序列；2、下划波浪线标出crRNA的结构序列。

初始设计3对引物，TV-F1/F2/F3+TV-R1/R2/R3，以10fg/μL克隆有阴道毛滴虫多拷贝基因L23861.1的质粒作为模板，以TV-R1为反向引物，筛选正向引物MIRA恒温扩增效率，以37℃和40min扩增条件进行扩增。结果显示，TV-F3的扩增效率较高(图1中A)，使用TV-F3作为正向引物筛选反向引物TV-R1/R2/R3，结果显示TV-R1的扩增效率较高(图1中B)，因此以10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL的质粒作为模板，进行TV-F3和TV-R1引物组合的性能测试，结果显示灵敏度有10fg/μL，并且有非特异性杂带(图1中C)。

然后，又设计了4对引物，使用上述相同的方法进行验证，结果显示，TV-F5和TV-R6引物组合特异性非常优秀，并且能够达到0.1fg/μL的模板质粒灵敏性(图1中D)。

(2)MIRA恒温扩增优选反应时间

以10fg/μL克隆有阴道毛滴虫多拷贝基因L23861.1的质粒作为模板，以TV-F5和TV-R6引物组合进行MIRA扩增，在不同的反应时间(15、20、25、30、35、40min)点终止反应，通过琼脂糖凝胶电泳评估恒温扩增的最优检测时间；结果显示，在MIRA反应15min时即可检测到目标条带，反应30min时，检测条带达到亮度阈值(图2)。

(3)MIRA恒温扩增优选反应温度

以10fg/μL克隆有阴道毛滴虫多拷贝基因L23861.1的质粒作为模板，以TV-F5和TV-R6引物组合，在不同温度(25、37、39、45℃)下进行MIRA扩增，通过琼脂糖凝胶电泳评估恒温扩增的最优检测温度；结果显示，在39℃时检测条带亮度最强(图3)。

(4)CRISPR-Cas13a-LF优选体系

以10fg/μL克隆有阴道毛滴虫多拷贝基因L23861.1的质粒作为模板，以TV-F5和TV-R6引物组合，在39℃，30min的条件下进行MIRA恒温扩增，扩增结束后，进行CRISPR-Cas13a-LF体系验证。

4.1、验证反应体系一(根据表1中设计的crRNA序列和RNA胶体金型-reporter1设计获得，如下表)，见图4中A。

4.2、反应体系二(优化体系，如下表)，将产物置于胶体金侧流层析试纸条中显色，结果显示阳性组出现明显的条带(图4中B)。

4.3、基于反应体系二，验证探针RNA胶体金型-reporter1和探针RNA胶体金型-reporter2对反应的影响；其中，探针RNA胶体金型-reporter2将切割核酸链缩短至6U。

结果显示，两个探针并没有显著区别均可以使用(图4中C)。

实施例2

一种阴道毛滴虫的检测方法，其包括：

1.MIRA恒温扩增

准备DNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来，货号：WLB8201KIT)，根据待测样本、阴性和阳性对照的数量准备冻干粉，并配置好反应Mix(Abuffer，29.4μL；上游引物(TV-F5)，2μL；下游引物(TV-R6)，，2μL；ddH₂O，4.1μL；共37.5μL)，每个干粉反应管加入37.5μL反应Mix复融。模板使用1×TE缓冲液稀释，向复融后的体系中加入10μL模板，并在管盖中加入2.5μLB buffer后扣好管盖。

提前将金属浴打开并设置好温度。上下甩动复融后的干粉10～20下，随后离心，并去除气泡后，立即将反应管放入金属浴中39℃孵育30min。

2.CRISPR-Cas13a体系中底物探针切割反应

恒温扩增反应结束后，吸取2μL扩增产物，加至装有18μLCRISPR-Cas13a体系中共20μl，体系成分如下表：

3.试纸条显色反应

反应结束后，将上述反应液稀释10倍(6μL反应液+54μL无菌水)，混匀后置于胶体金侧流层析试纸条中显色，观察C线与T线是否出现条带，T线与C线同时出现条带或只有T线出现条带为阳性，只有C线出现条带为阴性，若无条带为失效。

实施例3

特异性验证。

使用本发明实施例2所建立的检测方法对阴道毛滴虫及金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、白色念珠菌、蓝氏贾第鞭毛虫、刚地弓形虫基因组DNA进行检测，评估本发明所建立方法的特异性；

该方法可以将阴道毛滴虫、乳酸杆菌、大肠杆菌、刚地弓形虫、金黄色葡萄球菌、蓝氏贾第鞭毛虫和白色念珠菌进行区分鉴别，即使MIRA恒温扩增中有明显的非特异性条带，但CRISPR-Casl3a复合物不能够识别非靶基因序列，从而不能切割探针，具有非常优秀的特异性(图5)。

实施例4

灵敏度验证。

验证实施例2的检测方法具有良好的特异性后，进行了灵敏度检测。

以含有靶基因序列的载体作为模板的检测结果如下。

编号	模板浓度	结果
			1	水	0/1
2	0.1fg/μL	4/4
			3	0.01fg/μL	4/4
4	0.001fg/μL	3/4

备注：编号1～4对应为图6中A的标记。

以阴道毛滴虫基因组DNA作为模板的检测结果如下。

编号	模板浓度	结果
			1	水	0/1
2	10pg/μL	4/4
			3	1pg/μL	4/4
4	100fg/μL	3/4

备注：编号1～4对应为图6中B的标记。

结果显示，该方法用于人工合成质粒检测时，最低可检出0.001fg/μLDNA样本，当用于阴道毛滴虫样本核酸提取物检测时，最低可检出100fg/μL DNA样本，具有较高的灵敏度(图6)。

实施例5

临床样本实验验证。

以阴道毛滴虫DNA作为阳性对照，无菌水作为空白对照，通过本发明实施例2建立的检测方法，对临床上获得的30份女性阴道分泌物样本(样本来源为新乡医学院第三附属医院，年龄为24-59岁女性，阴道炎患者，的阴道分泌物样本)进行检测，评估本方法的实际应用效果。

将已经过湿片法检测后的30份临床样本通过本发明实施例2的检测方法进行检测，同时使用巢氏PCR验证(巢氏PCR针对阴道毛滴虫Actin基因，引物见表1)。

湿片法：在含有阴道分泌物的试管中加数滴生理盐水制成分泌物悬液，取一滴置载玻片上，加盖玻片，用显微镜放大400倍进行观察，扫描整个玻片区域，观察到滴虫则为阳性，未观察到则为阴性。

巢式PCR：巢式PCR分为两轮进行,一轮PCR扩增体系:2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)酶12.5μL,上下游引物各1μL,模板1μL,用ddH2O补充至25μL。一轮PCR扩增程序:95℃预变性3min；95℃变性15s,55℃退火15s,72℃延伸1min,共35个循环；72℃再延伸5min。取一轮扩增产物2μL作为二轮PCR扩增的模板,2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)酶25μL,上下游引物各2μL,用ddH2 O补充至50μL。二轮PCR扩增程序:95℃预变性3min；95℃变性15s,50℃退15s,72℃延伸1min,共35个循环；72℃再延伸5min。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

其中，第一轮扩增使用引物为TV-8S/TV-9R，第二轮扩增使用引物为TV-10S/TV-11R。

结果通过本发明方法检测出样本1、4、5、9、10、11、15、16、21、22、28、29均为阳性，与巢氏PCR方法完全一致，而10、11号临床样本为湿片法未检出样本，通过巢氏PCR法和本方法均呈现阳性，以上说明本发明方法具有与巢氏PCR同样的灵敏度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂或试剂组合，其特征在于，其包括第一试剂和第二试剂；

所述第一试剂包括用于恒温扩增阴道毛滴虫或其靶基因的引物对，所述引物对的上游引物包括SEQ ID NO:5～10所示序列中的任意一种或多种，下游引物包括SEQ ID NO:11～14所示序列中的任意一种或多种；

所述第二试剂包括：用于靶向所述引物对的扩增产物或所述扩增产物的转录产物的CRISPR/Cas系统。

2.根据权利要求1所述的试剂或试剂组合，其特征在于，所述上游引物包括SEQ ID NO:8所示序列，所述下游引物包括SEQ ID NO:13所示序列；

可选地，所述第一试剂还包括：恒温扩增试剂和/或RNA转录试剂；

可选地，所述恒温扩增试剂为MIRA恒温扩增试剂。

3.根据权利要求1所述的试剂或试剂组合，其特征在于，所述CRISPR/Cas系统包括CRISPR/Cas13a；

可选地，所述CRISPR/Cas系统的crRNA的核苷酸如SEQ ID NO:15所示；

可选地，所述第二试剂还包括：Cas蛋白和RNA探针中的至少一种；

可选地，所述RNA探针包括：RNA探针1和RNA探针2中的任意一种或两种，所述RNA探针1的核苷酸序列为：UUUUUUUUUUUUU，所述探针2的核苷酸序列为：UUUUUU；

可选地，所述RNA探针的序列5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团或Bio；

可选地，所述荧光报告基团包括FAM、VIC、NEX、ROX、TAMRA、JOE、CY3、CY5、Texas Red和TET中的任意一种。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂或试剂组合，其特征在于，所述试剂或试剂组合还包括：侧向流试纸条。

5.一种试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1～3任一项所述的试剂或试剂组合。

6.权利要求1～4任一项所述的检测试剂或试剂组合在制备阴道毛滴虫检测试剂盒中的应用。

7.一种阴道毛滴虫的检测方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1～4任一项所述的试剂或试剂组合或权利要求5所述的试剂盒对样本进行检测；

所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测的步骤包括：

对样本进行恒温扩增，获得扩增产物；

将所述扩增产物作为CRISPR/Cas的反应底物进行核酸切割。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，其包括：所述恒温扩增的时间为20～40min；

可选地，所述恒温扩增的时间为25～35min；

可选地，所述恒温扩增的时间为30min；

可选地，所述恒温扩增的温度为37～45℃；

可选地，所述恒温扩增的温度为39℃；

可选地，所述核酸切割的反应体系包括：4～6μM LwaCas13a 0.5～2μL，扩增产物1～3μL，0.1～2μM crRNA 1.5～3μL，0.1～2μM RNA探针0.5～2μL，8～12U RNase抑制剂0.5～2μL，10×Transcription Buffer 1～3μL，40～60U/μLT7 RNA聚合酶1～3μL，80～120mM ATP0.1～1μL，80～120mM CTP 0.1～1μL，80～120mM GTP 0.1～1μL，80～120mM UTP 0.1～1μL，水6～8μL；

可选地，所述核酸切割的反应条件为：30～40℃，10～30min；

可选地，所述核酸切割的反应条件为：27℃，20min。

10.根据权利要求7～9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：将切割反应的产物至于测流层析试纸条中显色或直接进行凝胶电泳检测。