CN114381550A - 用于hpv分型的多靶标核酸检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于HPV分型的多靶标核酸检测试剂盒及检测方法,试剂盒包括RPA扩增体系,Cas12a‑crRNA的酶及缓冲液体系,以及显示信号的报告分子,检测方法以多通道微流控芯片为载体,针对HPV不同亚型的对应区域设计RPA引物并进行等温扩增,然后针对不同亚型的扩增子设计出crRNA组合,crRNA识别样品中的HPV靶标后激活CRISPR‑Cas12a并剪切报告基团释放信号,从而实现HPV多亚型的精准检测。本方法灵敏度高、成本低、操作方便,有望广泛用于HPV感染的筛查。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域,具体涉及一种用于HPV多亚型检测和分型 的试剂盒和检测方法。通过结合微流控芯片、多重RPA核酸扩增以及多重 CRISPR/Cas12a实现样本中HPV多亚型的检测和分型。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种无被膜包被的、环状 双链DNA病毒,含有大约7900对碱基,分为3个基因区:早期区(Early Region, E区)、晚期区(LateRegion,L区)和非编码区(Uncoding Region,UCR)或 上游调控区(URR)。E区分为E1-E7共7个基因,参与病毒DNA的复制、转 录、翻译调控和转化等功能,其中E6和E7基因是HPV的主要致癌基因。L区 编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2,HPV的分型主要依据L1区的DNA 同源性,因此进行HPV分型时常以该区域为目标设计引物。非编码区含有HPV 基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。
目前已经发现的HPV有170多种亚型之多,其中40多种可以感染生殖腔。 1974年Zur Hausen提出HPV感染与宫颈癌有密切关系,1995年WHO和IARC 将HPV确定为宫颈癌的病因。HPV亚型分为高危型和低危型,高危型包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73、82 等型别,其中HPV 16和HPV 18是全球最常见的基因型,约占所有侵袭性宫颈 癌病例的70%;低危型包括HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、81等型别, 主要引起尖锐湿疣。
需要强调的是,人类感染HPV后不一定会致病,因为机体的免疫系统可清 除HPV,所以绝大多数生殖道HPV感染可能并不会产生没有临床症状,是一 过性的;据统计,约90%HPV感染在2年内会消失,其消失的具体时间主要 由所感染的HPV型别所决定,低危型较快会消失(约5-6个月),高危型可能 需要8-24个月,少数HPV感染者无法消灭体内的HPV而造成临床可见的生 殖道疣、鳞状上皮内病变;若女性持续受到HPV感染,则最终可能会发展为宫 颈癌。正由于不同HPV亚型的危害程度不同,需要及时对其筛查、鉴别和防治。HPV疫苗,简称宫颈癌疫苗,又称人类乳头瘤病毒疫苗,目前主要有二价、四 价和九价三种;它是人类第一个预防恶性肿瘤的疫苗,能预防子宫颈癌及其他因 感染HPV而引致的癌症和疾病。接种了二价宫颈癌疫苗(针对HPV 16/18),可 使得女性今后患上宫颈癌的风险大大减少;四价宫颈癌疫苗在HPV 16/18基础上 增加了HPV 6/11二种低危型亚型,从而可预防更多的HPV感染,不但可减少宫 颈癌的风险,还可以预防男女性常见的性病皮肤病,因为低危型的HPV也会引 起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫 颈上皮内瘤样变等;九价宫颈癌疫苗,是在四价苗的基础上又增加了属于高风险 组的HPV31/33/45/52/58五种亚型,是目前功能最强大的宫颈癌疫苗。
宫颈癌的发病率居全球女性恶性肿瘤的第2位,仅次于乳腺癌,每年约有 50万宫颈癌的新发病例,其中1/3为死亡病例,而90%以上的宫颈癌都是由HPV 感染引起的,除了上述提到的及时注射宫颈癌疫苗之外,针对HPV的检测也具 有重要意义且刻不容缓,不仅如此,由于不同亚型HPV的致病机制、致癌危险 性及感染后的预后各不相同,因此对HPV各亚型进行分型检测可以用于辅助临 床的诊断及治疗。
传统的宫颈癌早期筛查主要依靠宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查,在 宫颈细胞取样过程中容易导致病变细胞脱离,制片过程中也容易发生病变细胞形 态发生变化或者被炎症细胞和血细胞覆盖,同时结果的判断依靠医生个人经验判 定,容易造成疾病漏诊。现在也出现了一些现代分子检测技术,目前美国FDA 批准了4个宫颈癌高危HPV检测产品,依次分别为基于杂交捕获技术的Hybrid Capture 2、基于酶切信号放大技术的Cervista HPV、基于实时荧光PCR技术的 Cobas HPV和基于转录介导等温扩增技术(LAMP)的Aptima HPV,但是这些 技术都具有操作繁琐、检测通量低、鉴别亚型有限的缺点。如PCR技术,需要 利用变温实现核酸靶标的扩增,热循环仪是必不可少的设备;由于热循环仪体积 大、价格较高,使其应用场合受到一定局限(如难以普及至基层医院、诊所、现 场诊断的场景等);此外,PCR的检测一般基于荧光,由于荧光基团间普遍存在 发射波长的重叠,实际检测过程中很难单纯依靠分辨不同荧光超越6种以上靶标 的检测,所以难以实现更多HPV亚型的集成式、高通量检测。LAMP是一种恒 温扩增技术,靶标的扩增只需在65℃就可以完成,因此利于简化检测系统。然 而,LAMP对单一靶标的扩增一般需要设计3对引物,因此LAMP引物设计较 为复杂,尤其当靶标数目较多时,会进一步增加引物设计的难度和引物的复杂度。 近些年来的多项研究表明,基于LAMP的检测方式由于太灵敏,易受气溶胶问 题干扰,交叉污染的概率较大,存在普遍的假阳性和假阴性问题。
RPA(Recombinase Polymerase Amplification)技术是近年兴起的另一种恒温扩增,靶标一般只需在37℃左右、最快可在15分钟内扩增实现单分子核酸检 测。该技术对硬件设备的要求很低,适合于进行较长靶标序列的扩增,因此已在 临床医学、检验医学、分子生物学、基因组学、食品安全等不同领域中的发挥着 重要作用,特别是在致病菌、病毒等微生物的检测中。然而,虽然RPA的扩增 方式较为简单,但是它的引物设计常常会存在失败的风险,其原因在于:它不像 传统PCR一样,只要根据引物设计原则即可大概率获得合适的引物达到成功扩 增靶标的目的。RPA引物设计也有一个普遍的规则,比如,引物长度为一般30-35 nt;5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤,3’末端的3个核苷酸如果为鸟嘌呤 和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合,可以提升引物的扩增性能;引物中最好不要 出现长串的聚嘌呤或聚嘧啶,GC含量过高(>70%)或过低(<30%)都不利于 RPA扩增;此外,引物设计时应当尽量避免二级结构的形成、引物-引物互作、 发夹结构的序列等,尽量减少引物二聚体的形成。然而,即使有上述引物设计规 则的指导,至今仍然没有专门用于其引物设计的软件,效果良好的引物主要靠大 量的合成与筛选;目前我们还不能仅根据序列即可判断出引物的扩增性能和效率, 因此一般都需要对候选引物进行预测试和进一步筛选;尤其是检测多靶标的场合, 更需要较多的测试才能确保每一个靶标都能被成功扩增。进一步,对具有高度相 近序列的亚型进行分型时,尤其需要花费更多的时间进行引物的优化,其原因在 于既需要成功扩增对应的靶标,又要避免相似靶标间的交叉干扰。目前国际上应 用最广泛的RPA商业试剂盒厂家在它们的产品(DNA 扩增试剂盒) 分析设计手册中指出:“不同序列的寡核苷酸在反应中有不同的表 现,但没有固定的规则可根据核苷酸的顺序和组成来预测特定扩增引物的性能”, “即使寡核苷酸序列的微小变化有时也会导致引物活性出现显著变化”。可见, 要获得扩增效果好的RPA引物必须经过诸多尝试。
RPA的引物筛选主要有以下几步:靶标区域选择,候选引物设计,靶标扩 增及检测,根据结果再次筛选。值得一提的是,RPA靶标区域的选择也有相应的 要求,既尽量选择核苷酸组成相对“平均”的模板序列,GC含量最好处于40% 到60%,避开长串的聚嘌呤或聚嘧啶和基因组中的重复元件,尽量不含正/反向 重复和回文序列等。因此,虽然RPA这一扩增方式具有很多优势,广泛地被应 用于单靶标扩增和检测,但真正实现多靶标(≥3)扩增和检测的并不多见,如近 期报道的可同时扩增3-4个靶标的文献有:Foods,2020,9,278;Biosensors and Bioelectronics,2021,189,113328;Biosensors and Bioelectronics,2021,182,113167。 我们确实也发现有一篇文献(Scientific Reports,2021,11,12800)报道称基于 RPA实现了13个HPV亚型的检测,但作者在文章中明确提到他们所设计的13 对引物中只有3对可以正常扩增,而其他的引物扩增效率很低或无法扩增;文章 最后仍是参考PCR引物设计调整RPA的引物设计从而达到HPV对应亚型的的 扩增和检测,但仍然没有真正实现样本中HPV多亚型的扩增和严格分型(临床 病人样本中存在同时出现两种或以上亚型的情况),而是通过PCR检测样本确定 样本为单亚型后,再加入对应的引物进行扩增,即他们并未测试当样本中存在多 种亚型时,是否存在引物交叉扩增非靶标的情况。
综上所述,目前要真正实现RPA多靶标(>4个)扩增和检测还具有较大的 困难。除了上述引物设计和靶标区域选择,在进行多靶标扩增时还需要注意RPA 反应的引物总量;只要反应中使用两个以上的扩增引物,就应该对不同引物的量 进行控制和优化,否则易出现引物聚集导致扩增失败。而HPV具有几十种亚型, 常见高危亚型多达十多种,若能建立一种简便、快速、灵敏的HPV多亚型分型 方法将具有重要意义。
CRISPR/Cas作为细菌或古细菌的适应性免疫系统可以对外源基因进行剪 切以保护它们免受噬菌体、病毒或外界质粒的侵扰。利用CRISPR-Cas12a体系 中的CRISPR RNA(crRNA)识别靶标核酸后可剪切非靶标核酸(用作报告分子), 已经有多种体外检测的方法被开发出来(Biosensors and Bioelectronics,2021, 187,113292;Nature ReviewsMolecular Cell Biology,2019,20,490),均表明 这种方式具有灵敏度高、检测精准、操作方便等优点;进一步将其与恒温扩增等 技术结合,可以在非实验室环境实现对靶标核酸低至10-18M水平的检测。但是 对于多靶标的检测,尤其是靶标序列比较接近的亚型,在设计crRNA时也需要 特别注意,以避免针对一种亚型而设计的crRNA交叉识别另外一种亚型,造成 错误的检测。因此,针对HPV多亚型的crRNA设计既要满足crRNA本身的一 些要求,也需要保证其高度的特异性,因此需要克服一定的困难以达到预期目标。 此外,微流控芯片具有耗样少、通量高、便于集成化操作等特点,它可以帮助实 现检测过程的自动化,目前已被广泛应用于体外诊断领域。
发明内容
本发明的目的是克服现有HPV检测技术仪器复杂、操作繁琐、成本高、难 以进行多靶标检测的缺陷或不足,提供一种HPV多亚型快速、低成本检测和分 型的试剂盒和方法,通过研究找出多个HPV亚型的特定区域,既可区别不同亚 型,又满足RPA引物和CRISPR-Cas12a的crRNA设计要求,从而结合RPA扩 增、CRISPR-Cas12a以及微流控芯片实现高灵敏、高精度、低成本的HPV多亚 型检测和分型,该方法具有操作简单、样品用量少、分析速度快,且不依赖昂贵 仪器等优点,适合于各种医疗机构尤其是基层医院和诊所对HPV感染相关的筛 查和诊断。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种HPV多亚型检测和分型试剂盒,包括RPA引物组合,Cas12a蛋白, crRNA组合,报告分子,所述的RPA引物组合的核苷酸序列如SEQ ID 1-18所 示,crRNA的核苷酸序列如19-27所示。
进一步地,上述试剂盒还包括多通道微流控芯片,所述的微流控芯片的中心 为进样孔,进样孔与多个微通道连通,微通道的另一端与出口孔相连。微流控芯 片既可用作扩增反应的载体,又可以利用其空间分布完成流体的分流和HPV多 亚型的鉴别,微流控芯片的基底进行疏水修饰以防止在出口孔预装载试剂时溶液 倒流至入口孔,出口孔还可以预装载冻干的试剂(如Cas蛋白和crRNA)以方 便运输和存储。
进一步地,所述的报告分子为Cas12a剪切前后可促使反应体系产生信号变 化的生化分子,包括单链DNA(优选4-15个碱基),或者DNA发夹结构,或 DNA G-三链体(如TTAGGGTTAGGGTTAGGG,GGTTGGTGTGG, TGGGTAGGGCGGG,CTGGGAGGGAGGGA等)、DNA G-四链体(PS2.M,PS5.M, 端粒G-四链体,cMYC G-四链体,BCL-2G-四链体,TBA等),报告分子的两 端分别标记一个能发生荧光共振能量转移的荧光基团或者两端分别标记一个荧 光基团和一个淬灭基团,或者两端标记基于试纸条方式检测的基团(比如一个荧 光基团和一个biotin基团),或者可进行电化学检测的分子或基团(如亚甲基蓝), 或者可通过表面等离子体等光学检测的分子、基团或微纳米粒子(如金纳米粒子), 优选荧光检测的方式。
进一步地,上述试剂盒还包括扩增反应液和酶切缓冲液(10mM Tris,pH 7.9, 5-20mM镁离子,以及50-500mM钠离子或0.5-500mM钾离子)。优选地,扩 增时RPA引物组合总的终浓度优选为0.5-1.5μM,最优值为1μM。
上述试剂盒用于HPV多亚型检测和分型的方法:利用上述RPA引物组合对 待测样本进行扩增,将扩增产物与Cas12a蛋白、报告分子和每种HPV亚型的 crRNA混合后进行酶切反应,根据报告分子的信号变化检测HPV的亚型。
优选地,扩增产物从多通道微流控芯片的进样孔注入并分流至不同的出口孔, 扩增产物与预装载在出口孔的Cas12a蛋白、报告分子和每种HPV亚型的crRNA 混合后进行酶切反应;或者待测样本、RPA引物组合及扩增反应液直接从多通道 微流控芯片的进样孔注入并分流至不同的出口孔,与预装载在出口孔的Cas12a 蛋白、报告分子和每种HPV亚型的crRNA混合后边扩增边进行酶切反应。
本发明实现HPV多亚型的鉴定主要涉及三个核心部分:1)RPA引物的设计, 我们从HPV基因序列里找出可以鉴别多个亚型的区域,再针对性地设计RPA引 物,既需要有效扩增对应的亚型片段,又不能交叉扩增出非目标的亚型,同时还 需要满足下游CRISPR-Cas12a的crRNA设计原则;2)CRISPR-Cas12a检测体系, 需要在所扩增的多个亚型的片段区域里找出合适区域设计出crRNA的组合,由 于crRNA也存在交叉识别其他靶标的可能(尤其当亚型间核酸序列相似度较高 时),且要求其靶标识别区域的上游存在PAM序列(TTTN),因此也需要进行 大量的比对和优化设计;3)发散型多通道微流控芯片,作为反应溶液的载体, 一方面通过空间分布将每个亚型的检测隔离到芯片的每条微通道和反应孔处,利 用位置坐标实现对应亚型的检测,由于空间位置数目方便调节和设计(不像单纯 依赖不同荧光基团获得不同靶标检测的方式易受颜色波段间的重叠影响),只需 要利用一种荧光报告分子即可获得很高的亚型检测通量,另一方面微流控芯片可 以大幅减少样本的需求量,也可减少扩增产物的转移步骤,有利于减少气溶胶问 题。
本发明的有益效果体现在:(1)针对HPV多亚型,利用RPA这一恒温扩增 技术,无需复杂的PCR仪,仅需简单的加热装置实现多靶标的特异性扩增,避 免交叉扩增;(2)针对靶标序列设计CRISPR-Cas12a的crRNA组合,利用crRNA 对靶标的特异性识别,可以进一步提高检测的特异性,同时Cas12a酶作为剪切 报告基团的主体在检测过程中具有放大信号的效果,所以灵敏度和特异性都得到 了很大的提高;(3)发散型多通道微流控芯片的结合,起到了分流和提供反应、 检测场所,分流带来的益处是可以简化反应体系的复杂性,让每个出口孔只装载 一种crRNA,而微流控芯片的多个出口孔最大的特色是其作为一种空间编码, 利用一种报告分子就可以实现多个靶标的检测,且检测靶标还可方便地进行扩展, 与利用多种荧光分子进行多靶标检测(荧光编码)相比,不仅大大简化了检测装 置,也极大提高了靶标通量和信号的准确性,不存在光谱重叠的问题;(4)与常 规核酸检测先扩增再检测不同,本发明可以将扩增和检测反应同时在芯片上进行, 有利于简化操作,缩短检测时间;(5)相关试剂,如Cas12a和crRNA,可预先 转载在出口孔中并冻干,从而方便存储、运输和现场使用。
附图说明
图1 PAGE分析HPV 9种亚型首轮RPA引物的扩增产物。
图2 HPV 6和HPV 45第二轮引物扩增产物PAGE图。
图3 9种HPV亚型的RPA扩增产物PAGE图。
图4 HPV亚型为9种(14个条带分别为单独的9种亚型和一些混合的亚型以及 空白对照),RPA引物总浓度为10μM时的扩增结果。最底下的条带应该为引物 二聚体的条带。
图5针对三种亚型的质粒进行RPA扩增引物浓度摸索,其中0.5、1和1.5μM 分别为几组扩增反应实验中的引物总浓度。
图6针对HPV 16亚型设计crRNA。先根据crRNA基本原则设计了5条crRNA, 然后将其与其他8种HPV亚型的序列比对。
图7 9种crRNA与9种亚型以矩阵形式进行交叉测试以验证所设计crRNA的特 异性。
图8针对1-3种HPV亚型同时扩增和crRNA识别检测。
图9发散型30通道微流控芯片设计。该芯片含有一个中心的进样孔、30条连接 通道和30个出口孔。
图10发散型30通道微流控芯片装载色素溶液后不同角度所拍图片。
图11微流控芯片上3次从进样孔注入240μL溶液后30个出口孔中所获得的溶 液体积。
图12通过荧光分析来证实从进样孔注入的液体可均匀分流到30个出口孔并实 现剪切反应。HPV 16质粒从进样孔注入,出口孔预先装载有crRNA和Cas12a。
图13证实HPV 16或HPV 18不存在crRNA间的相互交叉识别。
图14证实针对HPV 16或HPV 18设计的crRNA具有高特异性。
图15实验证实随着HPV 16质粒浓度的增高反应体系产生的荧光更强。
图16芯片上边扩增边检测后的荧光分析结果。进样孔注入HPV 18的RPA扩增 溶液,1-15号出口孔为未加Cas12a和crRNA的对照组,16-30号出口孔为加了 Cas12a和HPV 18亚型的crRNA。
图17临床样本1在芯片上的检测结果。
具体实施方式
试剂:Cas12a蛋白购买于广州美格生物技术有限公司;HPV L1基因质粒、引物、TBA11-FQ、crRNA由北京擎科新业生物技术有限公司提供。
实施例1:RPA引物设计与优化
本实施例首先针对9种HPV亚型的基因找出了L1基因上的相应区域,据 此设计了10对RPA引物(由于HPV 11与HPV 6在引物设计区域高度相似,为 避免可能存在的交叉扩增和后续检测过程中的交叉识别,我们对HPV 11设计了 两对引物以备用,如表1所示)。根据RPA试剂盒(TwsitDx基础款)的说明, 对9种HPV亚型靶标进行了扩增(39℃加热20min),然后利用凝胶电泳(PAGE) 对其扩增产物进行分析(图1),发现HPV 6和HPV 45的引物对模板扩增的效 果并不理想,于是进一步在前面设计的引物基础之上,针对这两种亚型重新又分别设计了三对引物(表2)。经过PAGE分析(图2),发现其中引物HPV 6a和 6b扩增效果较好,但引物HPV 6c的扩增失败;而HPV 45的三个引物均可正常 扩增。综合考虑后,我们在多靶标扩增时选用了HPV 6b和HPV 45a的正反引物。 最终选取的9对引物如SEQ ID 1-18所示,所扩增的产物PAGE图如图3所示。 由此可见,RPA引物首先应该尽量按其规则进行设计,其次针对初始引物扩增效 率有欠缺的亚型重新进行优化,甚至可以考虑在优化时多设计几对引物并从中挑 出综合效果较好的一对用于下游实验;当然,有时还需要根据下游实验的结果再 返回来挑选和优化引物。
表1针对9种HPV亚型的L1区设计的RPA引物序列
HPV 6Forward | CCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCC |
HPV 6Reverse | CCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCC |
HPV 11Forward a | CCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTA |
HPV 11Reverse a | CTGACCAGGATTACCACCATACCCACCAC |
HPV 11Forward b | CCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTG |
HPV 11Reverse b | CATCCGATTTATTGGTTTGTAAGTCTGCAA |
HPV 16Forward | CTGTCCCAGTATCTAAGGTTGTAAGCACGG |
HPV 16Reverse | CTAATGGCTGACCACGACCTACCTCAACAC |
HPV 18Forward | CACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCG |
HPV 18Reverse | CAACTGGGAGTCAGAGGTAACAATAGAGCC |
HPV 31Forward | CTGTCCCAGTGTCTAAAGTTGTAAGCACGG |
HPV 31Reverse | CACTAATACCTACACCTAATGGCTGCCCGC |
HPV 33Forward | CTTGAAATAGGTAGAGGGCAGCCATTAGGC |
HPV 33Reverse | CCTCAATAATAGTATTTATAAGTTCTAAAGGTGG |
HPV 45Forward | CCAGTGGCTCTATTATTACTTCTGATTCTC |
HPV 45Reverse | CCAAACTTGTAGTAGGTGGTGGAGGGACAC |
HPV 52Forward | CCTGTCTCTAAGGTTGTAAGCACTGATGAG |
HPV 52Reverse | CCCACTAATACCCACACCTAAAGGCTGTCC |
HPV 58Forward | CTCCTGTGCCTGTGTCTAAGGTTGTAAGCA |
HPV 58Reverse | CCAATGGCTGTCCTCTACCTATTTCAAGGC |
表2针对HPV 6和HPV 45的第二轮引物设计
实施例2:引物浓度优化
已有研究表明,在进行多靶标RPA扩增时,引物浓度是否合适直接影响到 最终效果。比如,当扩增体系中只有一个靶标时,引物终浓度一般为1μM;但 当靶标大于2个时,其引物总浓度不能直接以相对应的倍数增加,而应作适当调 整。如图4所示,当扩增反应体系中总引物终浓度太高(10μM)时,会导致引 物二聚体的形成,造成扩增失败。进一步,我们对引物浓度进行了摸索。我们猜 测即使待扩增靶标增多,引物总浓度可能只需要和单个靶标存在的引物总浓度相 当,因此我们将总引物终浓度分别选用了0.5、1和1.5μM。靶标选用了HPV 6、 16和45三种亚型的组合(除了摸索引物浓度,后续还会进行靶标分型以测试其 特异性),引物为这三种亚型对应的引物的混合物,然后进行RPA扩增。从图5 可以看出,三种引物浓度均可以实现扩增;但是当引物浓度为0.5μM时,产物 浓度相对较低;而当引物浓度为1.5μM时,产物浓度虽然较高,但也可以看出 泳道最底下出现了一些引物二聚体条带;因此,综合这些结果,我们优选1μM 作为扩增时的引物总浓度。
实施例3:针对9种HPV亚型的crRNA设计与优化
将靶标核酸进行RPA扩增后,我们采取CRISPR技术对靶标进行检测。具 体来说,利用CRISPR-Cas12a系统在crRNA与靶标配对后可以激活其反式剪切 的活性,将荧光和淬灭基团双标记的报告分子进行剪切,从而释放出强荧光实现 检测。
由于本发明针对的是HPV多种亚型的检测,针对每一个靶标扩增区域找出 符合crRNA设计基本原则(即在靶标链上含有PAM序列“TTTN”)的多个备选 序列;然后检查PAM序列后的20个核苷酸是否不含有“AAA”,据此在L1基因 上5685-5993之间选出了如图6所示的5个针对HPV 16的crRNA;然后再将这 5个crRNA与其他8个HPV亚型进行序列比对,在确保除了3’端外,至少与其 他亚型间有三个不同的碱基,从而从5个crRNA中找出crRNA1和crRNA5满 足这一要求,且考虑到crRNA 1与其他的亚型差别更大,所以优先选取crRNA 1, 而将crRNA 5作为备用。此外,由于crRNA是针对扩增区域进行设计和识别, 因此crRNA设计和前文所说的引物设计也需要综合考虑。比如前文提过,我们 在第一轮针对HPV 6亚型设计RPA引物时,发现其扩增效果不好,从而在第二 轮设计了三对引物HPV 6a、6b和6c,其中HPV 6c的扩增效果不好,而HPV 6a 和6b扩增效果较好,但是我们发现在HPV 6a正向、反向引物之间的L1基因片 段无法设计出满足上述要求的crRNA,所以最终选择了HPV 6b。
确定好每个亚型的crRNA后,我们采取了9×9的正交实验对其识别效果进 行了验证。在96孔板中,将1μL Cas12a(2μM)与27μL缓冲液(10mM Tris, pH 7.9,70mM KCl,10mMMgCl2)分别与2μL HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52和HPV58的crRNA(1μM)混合(每 个亚型均配置3个重复孔),于37℃下孵育10min;然后往上述体系中对应加入 10μL HPV 61、HPV 1、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 45、HPV 52 和HPV58的L1片段(合成的质粒,40ng/μL)和10μL TBA11-FQ(100μM), 在37℃孵育15分钟;其后于65℃下加热10分钟使Cas12a失活;最后用酶标 仪测得荧光值(488nm激发,500-600nm收集),然后将518nm处荧光取出(每 个亚型的3个重复孔取平均值)作图。如图7所示,当crRNA与对应的HPV亚 型同时存在时(即对角线处),荧光值很强;而在其他二者非对应的情况下,荧 光值非常低(虽然有极少数的值略微偏高一点,但不影响判断)。由此可见,我 们针对9种亚型所设计的crRNA具有很好的特异性。
此外,我们进一步将含有1种、2种和3种HPV亚型的样本(这些样本在 临床已经通过PCR方式进行过HPV分型测试)分别利用与其对应的1种、2种 和3种或9种引物进行RPA扩增(每个扩增反应的总引物浓度均为1μM),再 利用9种crRNA进行识别。如图8所示,荧光测试结果表明当反应体系中存在 相应的靶标时可以被与之对应的crRNA特异识别出。该结果再次证明我们所设 计的引物可以对临床样本中HPV含有的亚型进行准确扩增,且所设计的crRNA 能够实现高的特异性识别,不存在明显的交叉识别情况。
实施例4:发散型多通道微流控芯片的设计、制作与测试
为实现HPV多亚型的高效分型,本发明进一步引入微流控芯片,将其与RPA 扩增和CRISPR检测进行结合,通过微流控芯片微通道的空间布局实现液体的分 流和反应控制。微流控的引入非常重要,是实现多靶标高效分型的关键点,通过 微流控芯片分布在空间不同位置的多个出口孔与待测样品的多个亚型对应,在只 利用一种荧光报告分子的前提下可以实现多个靶标的检测,且检测通量可以非常 方便地增加。常规方法中,为了实现多靶标,很多借助不同颜色的荧光基团(color coding),或者不同尺寸或不同barcode标记的磁珠(size coding、barcoding),从 而去鉴别不同靶标;这些方法虽然可以实现靶标间的鉴别,但是操作复杂,靶标 间的分辨率不高,且难以制备、成本高。本实施例中,我们设计的芯片为发散型 的30路微通道芯片,如图9所示,芯片中间设计有进样孔、30条连接通道和30 个出口孔,出口孔编号为1号至30号,从而达到空间标记(space coding)。我 们通过经典的软光刻法制得了带有微结构的PDMS,并将进样孔和30个出口孔 分别利用打孔器打上对应的孔(30个出口孔不一定全部打孔,也可根据实验需 要进行选择性地打孔)。在将打有孔的PDMS贴上玻璃底板前,我们对玻璃板先 进行了一层疏水修饰,即将约0.5mL Aquapel滴加到洗净吹干的玻璃板上(75 mm×50mm×1mm),然后用产品自带的毛刷涂抹均匀,其后将玻璃板晾干,再 用无尘纸擦除多余的Aquapel即可。该疏水修饰的方法简单、方便、有效且成本 非常低,当然也可以采用其他的疏水试剂对玻片进行预处理。之后,可以将PDMS 贴至玻璃板上。
其后我们表征了从进样孔注入的液体可以均匀分流到外周30个出口孔中。 具体操作方法如下:
取240μL溶有绿色色素的超纯水,用注射器从进样孔注入芯片,液体可通 过30个连接通道分配到芯片外周的30个出口孔中(如图10所示),再用微量注 射器小心抽取每个孔中的液体并通过注射器刻度读数,重复三次,记录数据如图 11所示;可见每个孔的体积都在8μL左右,表明该芯片能很好的实现液体的均 匀分配。
实施例5:
本实施例为表征从进样孔注入芯片的试剂可以和预先加在出口孔中的试剂 充分混合并反应。具体操作方法如下:
将Cas12a(37.5μL,2μM)、HPV 16crRNA(75μL,1μM)和34.5μL缓 冲液于37℃下孵育10min,然后往上述体系中加入TBA11-FQ(3μL,100μM), 将之混匀后往30个出口孔中分别加入4μL。请注意,由于我们对芯片基底做了 疏水修饰,出口孔中的溶液不会倒流入至连接通道或者进样孔。之后,用注射器 将120μL HPV 16DNA(40ng/μL)从中间进样孔加入并分流至每一个出口孔中; 然后将芯片在温控装置上进行恒温金属浴(37℃,15min),之后再取出在显微 镜下拍摄每个孔进行的绿色荧光的采集,再用Image J进行荧光值提取,得到的 结果如图12所示,表明30个出口孔中的荧光值非常均一(除了第一个孔由于打 孔原因造成荧光略微偏弱一点)。该结果进一步表明从进样孔注入的液体可以均 匀地分配至每一个出口孔中,此外也说明每一个孔中的反应液体可以充分混合并 反应。
实施例6:
本实施例为证实微流控芯片上HPV 16和HPV 18的crRNA不会交叉识别非 对应靶标,具体操作方法如下:
将Cas12a(25μL,2μM)、HPV 16crRNA(50μL,1μM)和20μL缓冲 液混合并于37℃下孵育10min,然后往上述体系中加入TBA11-FQ(5μL,40 μM),混匀后分别加入至芯片1-15号出口孔中,每孔4μL;将TBA11-FQ(5μL, 40μM)与95μL缓冲液混合,分别加入至16-30号孔中,每孔4μL,作为阴性 对照。用注射器把含HPV 18质粒的溶液(120μL,40ng/μL)从中间的进样孔注 入进芯片,溶液分流至每个出口孔中,再将芯片放入温控装置中进行金属浴(37 ℃,15min),取出后在显微镜下拍摄每个孔的绿色荧光照片,使用Image J分析 荧光值并作图,如图13a所示。其结果表明含有Cas12a+HPV 16crRNA(RNP16) 的1-15号出口孔中的荧光值和阴性对照组16-30号出口中荧光值接近,说明这 些1-15号出口孔中没有发生明显的剪切事件,由此可证明HPV 16的crRNA不 能识别HPV 18质粒。
与上述溶液配置方式一样,我们测试RNP18是否可以识别HPV 16的质粒, 结果如图13b所示,说明HPV 18的crRNA不能识别HPV 16质粒。
上述结果表明在芯片上没有出现crRNA交叉识别非对应亚型的情况。
实施例7:
本实施例为测试本发明可实现微流控芯片上HPV 16和HPV 18的分型,具 体操作方法如下:
将Cas12a(5μL,2μM)、HPV 16crRNA(10μL,1μM)和5μL缓冲液 于37℃下孵育10min,然后往上述体系中加入TBA11-FQ(1μL,40μM), 混匀后往4-6号出口孔中分别加入4μL;同样地配置含Cas12a、HPV 18crRNA 和TBA11-FQ的反应液并将之加入到7-9号出口孔中;配置TBA11-FQ(1μL, 40μM)与19μL的缓冲液并往1-3号出口中分别加入4μL,作为阴性对照。请注意,该实施例中10-30号出口孔并未打孔。用注射器将含HPV 16(20μL)和 HPV 18(20μL)质粒的溶液从中间的进样孔注入至芯片并分流到出口孔中,将 芯片放入37℃恒温金属浴,15min后取出在显微镜下拍摄每个孔的绿色荧光照 片,使用Image J分析1-9号出口孔中荧光值并作图,如图14所示。结果表明没 有RNP16/18存在的1-3号阴性孔中,荧光值非常低;而含有RNP 16或18的4-6 号孔和7-9号孔中荧光值远高于阴性对照孔,证明注入的两种质粒在对应的出口 孔中被准确识别出来。
该实例和上述实例6综合,表明本技术方案可以准确地实现HPV 16/18的分 型,具有很强的特异性。
实施例8:
本实施例为表征本发明可以实现不同浓度HPV质粒的检测,具体操作方法 如下:
将HPV 16质粒稀释成不同的浓度(10nM、5nM、1nM、0nM),然后将 这4种浓度的质粒溶液分别加入到1-12出口孔中(每个浓度分别加入3个孔, 每孔4μL),剩下的13-30号用4μL缓冲液填充以使得整个芯片的出口孔在加样 时保持压力均匀分布;将Cas12a(30μL,2μM)、HPV 16crRNA(60μL,1μM) 和24μL缓冲液于37℃下孵育10min,然后往上述体系中加入TBA11-FQ(6μL, 40μM),混匀后用注射器把该混合液从中间进样孔注入芯片并均匀分流到外周 出口孔中;再将芯片放入温控装置中进行恒温金属浴(37℃,15min),之后取 出并在显微镜下拍摄每个孔的绿色荧光照片,用Image J分析荧光值,对四个浓 度下的荧光值取求平均值后作图如图15所示,可见荧光值随着浓度的增大而逐 渐增加,由此可证实本发明可以检测不同浓度的HPV DNA。
实施例9:
对于靶标的检测,先扩增再检测是常规思路;若能实现边扩增边检测将有可 能大大简化操作,有效缩短检测时间。本实施例为表征本发明可以实现核酸边扩 增边检测,具体操作方法如下:
将Cas12a(25μL,2μM)、HPV 18crRNA(50μL,1μM)和20μL缓冲液 于37℃下孵育10min,然后往上述体系中加入TBA11-FQ(5μL,40μM),混 合后往16-30号出口孔中分别加入4μL溶液;将TBA11-FQ(5μL,40μM)和 190μL缓冲液混合后往1-15号出口孔中分别加入4μL作为阴性对照。然后配制 如下RPA反应溶液:A Buffer(40μL),酶反应混合液(14μL),Forward引物 (4μL,10μM),Reverse引物(4μL,10μM),纯水27μL,B Buffer(5μL), HPV 18质粒(6μL,1μM);将这一扩增反应溶液从中间进样孔一次性注入进 芯片中,再将芯片放入37℃金属浴孵育30min;之后取出在显微镜下拍摄每个 孔的绿色荧光照片并进行荧光分析,结果如图16所示,表明16-30号出口孔中 荧光远高于阴性对照1-15号出口孔的荧光值,由此证实本发明可以实现核酸扩 增和检测同时进行,可以有效减少样本的整体检测时间。
实施例10:
本实施例为表征本发明可以通过微流控芯片实现临床样本中HPV亚型的分 型,具体操作方法如下:
按照RPA试剂盒中说明配置扩增溶液,其中HPV 6、HPV 11、HPV 16、HPV 18、HPV31、HPV 33、HPV 45、HPV 52和HPV 58等9种亚型的引物使用前 文中确定下来的9对引物(以相同浓度混合,使得扩增溶液中引物总浓度为1μM), 待测样本为临床收集的子宫颈刮片经过热裂解后取5μL加入扩增体系中,然后 在39℃加热20min进行扩增。然后将Cas12a(5μL,2μM)和9种HPV亚型 的crRNA(10μL,1μM)以及5μL缓冲液于37℃下孵育10min,再往9种溶 液中加入TBA11-FQ(1μL,40μM),混匀后往1-27号出口孔中依次加入4μL 反应溶液(如1-3号出口孔中加入HPV 6亚型的溶液,4-6号孔中加入HPV 16 亚型的溶液);28-30号出口孔中加入4μL不含任何Cas12a/crRNA、但含有等浓 度TBA11-FQ报告分子的溶液作为阴性对照。然后,将上述RPA扩增后的样本 溶液从中间进样孔注入进芯片中,再将芯片放入37℃金属浴孵育15min;之后 取出在显微镜下拍摄每个孔的绿色荧光照片并进行荧光分析。我们初步在芯片上 检测了两个临床样本。图17展示的是第一个样本的结果,表明1-3号出口孔中 荧光值远高于其他出口孔的荧光值,说明该样本中含有HPV 16亚型的病毒,而 不存在其他8种亚型的病毒。图18展示的第二个样本的检测结果,表明1-3、7-9 以及19-21号出口孔中信号要明显高于其他出口孔的信号,说明二号样本中同时 含有HPV 6、HPV 16和HPV 45亚型的病毒。我们将芯片上这两个样本的HPV 分型结果与临床经过PCR检测的结果对照,两种结果完全吻合,表明本发明的 技术方案具有很高的准确性。
序列表
<110> 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
<120> 用于HPV分型的多靶标核酸检测试剂盒和检测方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagccattag gtgtgggtgt aagtggacat cc 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtaataa gttctaaggg cgggcagtca cc 32
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctttaggcg ttggtgttag tgggcatcca ttg 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catccgattt attggtttgt aagtctgcaa 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtcccagt atctaaggtt gtaagcacgg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctaatggctg accacgacct acctcaacac 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cactgggcta aaggcactgc ttgtaaatcg 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caactgggag tcagaggtaa caatagagcc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgtcccagt gtctaaagtt gtaagcacgg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cactaatacc tacacctaat ggctgcccgc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttgaaatag gtagagggca gccattaggc 30
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cctcaataat agtatttata agttctaaag gtgg 34
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccttctccc agtggctcta ttattacttc 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccaaacttgt agtaggtggt ggagggacac 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctgtctcta aggttgtaag cactgatgag 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccactaata cccacaccta aaggctgtcc 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcctgtgcc tgtgtctaag gttgtaagca 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaatggctg tcctctacct atttcaaggc 30
<210> 19
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
crrnauaauu ucuacuaagu guagauccuu uaccccaaug cucgccc 47
<210> 20
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
crrnauaauu ucuacuaagu guagauauag ggccgguacu gugggg 46
<210> 21
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
crrnauaauu ucuacuaagu guagaucuac accuaguggu ucuaug 46
<210> 22
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
crrnauaauu ucuacuaagu guagaugaau agagcaggua cuaugg 46
<210> 23
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
crrnauaauu ucuacuaagu guagauauag aucaggcgcg guuggu 46
<210> 24
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
crrnauaauu ucuacuaagu guagauccac ucccagugga ucaaug 46
<210> 25
<211> 46
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
crrnauaauu ucuacuaagu guagauuugg cauaaucagu uguuug 46
<210> 26
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
crrnauaauu ucuacuaagu guagauuuag gguccggcaa uuuaauu 47
<210> 27
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
crrnauaauu ucuacuaagu guagaucaac uccuaguggc ucuau 45
Claims (9)
1.一种HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,包括RPA引物组合,Cas12a蛋白,crRNA组合以及报告分子,所述的RPA引物组合的核苷酸序列如SEQ ID 1-18所示,crRNA组合的核苷酸序列如19-27所示。
2.根据权利要求1所述的HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,还包括多通道微流控芯片,所述的微流控芯片中心为进样孔,进样孔与多个微通道连通,微通道的另一端与出口孔相连。
3.根据权利要求1所述的HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,所述的报告分子为Cas12a剪切前后可促使反应体系产生信号变化的生化分子,包括单链DNA、DNA 发夹结构、DNA G-三链体或DNA G-四链体,报告分子的两端分别标记一个能发生荧光共振能量转移的荧光基团或者两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团,或者两端标记基于试纸条方式检测的基团,或者标记可以发生电化学反应或等离子体共振的基团、分子或微纳米粒子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,扩增时RPA引物组合总的终浓度为0.5-1.5 µM。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的所述的HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,扩增时RPA引物组合总的终浓度为1 µM。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的HPV多亚型检测和分型试剂盒,其特征在于,还包括扩增反应液和酶切缓冲液。
7.权利要求1所述的试剂盒用于HPV多亚型检测和分型的方法,其特征在于,包括以下方法:利用权利要求1所述的RPA引物组合对待测样本进行扩增,将扩增产物与Cas12a蛋白、报告分子和每种HPV亚型的crRNA混合后进行酶切反应,根据报告分子的信号变化检测HPV的亚型。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,扩增产物从多通道微流控芯片的进样孔注入并分流至不同的出口孔,扩增产物与预装载在出口孔的Cas12a蛋白、报告分子和每种HPV亚型的crRNA混合后进行酶切反应。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,待测样本、RPA引物组合及扩增反应液直接从多通道微流控芯片的进样孔注入并分流至不同的出口孔,与预装载在出口孔的Cas12a蛋白、报告分子和每种HPV亚型的crRNA混合后边扩增边进行酶切反应。
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