CN107034312A - 核苷酸组合物、试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核苷酸组合物、试剂盒用途及意义。利用该核苷酸组合物能够在一次检测中同时高灵敏和精确地检测出我国目前存在的各种基因型HBV，并且可以一次检测样品中的全部核酸，包括HBV DNA和RNA。这对于HBV DNA+RNA检测在指导慢性乙型肝炎抗病毒治疗具有极其重要的意义。此外，本发明中的核酸组合物可避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合，进而防止了假基因的扩增，提高了检测的准确性。

Description

核苷酸组合物、试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于乙型肝炎病毒检测的核苷酸组合物及试剂盒以及它们的用途。

背景技术

在我国，乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染所致疾病仍是严重威胁国人健康的重大传染性疾病。全国现有慢性HBV感染者约7000万，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万。

慢乙肝难以治愈和引起停药后病毒学反弹的主要原因是存在于感染肝细胞核内的病毒复制模板-HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)难以清除。因此，肝组织内HBV cccDNA的清除被认为是慢乙肝患者最接近完全治愈的标志。但由于HBV cccDNA的检测需要进行肝组织活检，限制了其在临床上的应用。目前，临床上多以乙肝表面抗原(HBsAg)消失和/或其抗体阳转作为评价慢乙肝“临床治愈”的标准。但现有的药物和治疗手段很少能使慢乙肝患者血清HBsAg阴转。为减少停药带来的病毒学反弹和疾病复发，各国的慢乙肝防治指南多强调患者需要长期甚至终生用药，而实际上约20％的患者停药后不发生反弹。因此，临床上仍缺乏甄别和确定慢乙肝患者安全停药的可靠指标。近年的研究表明，血清中的HBsAg不仅来自感染肝细胞核内的cccDNA，而且整合的HBV DNA片段也能转录翻译产生HBsAg(Cornberg M,etal.J Hepatol 2017,66:398-411；Rivkina MB,et al.Gene 1988,64:285-296；Kaplan PM,et al.J Virol 1976,17:885-893.)。因此，HBsAg不能很好反映肝组织内cccDNA的活性。

目前临床上已经常规定量检测血液中的HBV DNA，为诊断HBV感染及评价其抗病毒疗效提供了重要的检测手段。然而，血液中除了存在HBV DNA外，也存在HBV RNA。我们和其它课题组证实血液中的HBV RNA为包裹在病毒样颗粒内的未经或部分逆转录的前基因组RNA(Wang J,et al.J Hepatol 2016,65:700-710；Jansen L,et al.J Hepatol 2016,213:224-232.)，并且血液中的HBV RNA能很好地反映肝细胞内cccDNA的活性(Wang J,et al.JHepatol 2017,66:462-463；Giersch K,et al.J Heptol 2017,66:460-462.)。随着核苷(酸)类药物在抗病毒治疗中的广泛应用，HBV DNA的合成被有效阻断，血液中的HBV DNA水平经过一段时间抗病毒治疗后迅速下降并消失。然而，由于核苷(酸)类药物主要作用于HBV复制的逆转录过程，对于cccDNA转录形成HBV RNA无明显影响，因此，即使血液中检测不到HBV DNA，由于cccDNA的持续存在，血液中仍存在HBV RNA。所以，血液中HBV DNA和RNA均为HBV cccDNA存在和复制的标志，血液中HBV总核酸(HBV DNA+RNA)的定量检测显得尤为重要。

然而，目前针对HBV的基因检测主要集中于HBV DNA的检测。如果能够一次性检测出样品中HBV总核酸(DNA+RNA)，则对于评价慢乙肝患者抗病毒治疗的疗效和预后以及指导安全停药非常有利。然而，目前HBV基因的检测，或者仅检测DNA，或者仅检测RNA，例如中国专利申请公布CN105907891A公开了只检测pgRNA的方法。现有技术中没有公开能够一次性检测样品中HBV总核酸(DNA+RNA)的任何有效试剂，因此，迫切需要高度灵敏和精确的新型血液HBV总核酸检测方法。

发明内容

为了解决至少部分上述技术问题，发明人在对我国存在的不同基因型HBV序列进行分析后，设计多条高度保守的核苷酸组合物。利用该核苷酸组合物能够在一次检测中同时高灵敏和精确地检测出我国目前存在的各种基因型HBV，并且可以一次检测样品中的全部核酸，包括HBV DNA和HBV RNA。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的一方面，提供核苷酸组合物，其包含序列分别为选自SEQ ID NO:1的连续的部分序列的第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸，其中：

所述第一核苷酸的序列长度为15-30bp；

所述第二核苷酸的序列如式：(N)xAGGCGAGGG(N)y所示，其中N选自A、T、G和C组成的组；x和y各自为选自0-21的整数，且6≤x+y≤21。

所述第三核苷酸的序列的长度为15-35bp，其5’端与所述第一核苷酸的序列3’端的距离为1-25bp，其3’端与所述第二核苷酸的序列5’端的距离为1-25bp；

在某些实施方案中，第一核苷酸的序列包含CCACCAAATGCCCCCT。在某些实施方案中，第三核苷酸的序列包含CAACACTTCCGGAAACTACTG。在某些实施方案中，第二核苷酸的序列中，x＝0，且y为3-7的整数；或者x为10-15的整数，且y＝0。

在某些实施方案中，所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以混合物的形式存在。在某些实施方案中，所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以各自独立的形式存在。

本发明的另一方面，提供试剂盒，其包含本发明所述的核苷酸组合物。

本发明的再一方面，提供检测样品中是否存在乙型肝炎病毒的非诊断性方法，其包括使用本发明的核苷酸组合物或试剂盒。

在某些实施方案中，本发明的非诊断性方法包括在一次反应中同时检测乙型肝炎病毒的DNA和RNA的步骤；或者包括在检测之前将样本中的RNA逆转录为cDNA的步骤。

在某些实施方案中，所述样品为血液样品，例如血清。

本发明的又一方面，提供本发明的核苷酸组合物或试剂盒在制备用于乙型肝炎病毒检测的试剂中的用途。

通过本发明的核酸组合物能够在一次检测中同时高度灵敏和精确地检测出我国目前存在的各种基因型的HBV，例如A-D四种基因型，包括我国主要存在的B型和C型HBV，在我国新疆、西藏等地分布的D型HBV、以及散发分布的A型HBV。可选地，可以一次检测样品中的全部核酸，包括DNA和RNA。这对于以HBV DNA+RNA检测在指导慢乙肝患者抗病毒治疗中的应用具有极其重要的意义。此外，本发明的核酸组合物还可以避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合，进而防止了假基因的扩增，提高了检测的准确性。

附图说明

图1本发明示例性引物和探针所在HBV基因组中的位置图。

图2不同引物组合的PCR产物凝胶电泳图，其中的数字表示序列号，例如，1表示SEQID NO:1的序列。

图3探针浓度梯度检测结果。

图4温度梯度检测结果。

图5检测A基因型HBV灵敏度检测结果。

图6检测B基因型HBV灵敏度检测结果。

图7检测C基因型HBV灵敏度检测结果。

图8检测D基因型HBV灵敏度检测结果。

图9特异度检测结果。

图10精密度检测结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限值以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料(例如，组合物或试剂盒)，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人员所已知的其等同物等等。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。

如本发明所用术语“核苷酸”是指长度为10-40bp之间的短核苷酸或寡核苷酸，优选单链核苷酸，更优选在反应条件下核苷酸保持单链状态，不会因核苷酸自身相互作用而形成环状结构或发卡结构。

在设计能够准确和灵敏地检测多种不同基因型的核苷酸时，通常选择不同基因型之间高度保守的区域作为核苷酸的结合区域。然而，发明人发现，虽然在HBV基因组2355位上游存在多个可变区域，例如2354位和约2280-2310之间的区域，但是在SEQ ID NO:1(2221-2401)所示序列对应的区域(可变区+保守区)中，仍然可以设计得到具有高准确性和灵敏度的引物和/或探针，这对于本领域技术人员而言是出乎意料之外的。

具体地，在SEQ ID NO:1所示的序列中选择包含AGGCGAGGG的约15-30bp的序列作为第二核苷酸，同时选择距离AGGCGAGGG的5’端约超过150bp，例如超过200bp的序列作为第一核苷酸，利用第一和第二核苷酸的组合可准确和灵敏地检测多种不同基因型的HBV是否存在及其浓度。

本领域技术人员在设计引物时，通常需要将核苷酸中GC的含量控制为40％-60％之间，优选45-55％。因此，尽量避免高GC含量。而发明人发现选择包含GC含量高达近78％的AGGCGAGGG区域的序列仍然可以作为有效引物。

此外，通过以(N)xAGGCGAGGG(N)y所示的结构作为第二核苷酸，并通过特定的位置关系来设计其它核苷酸可以避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合，进而防止了假基因的扩增，提高了检测的准确性。这对于当使用来源于人类的样品作为检测物时是特别有益的。

在某些实施方案中，第二核苷酸的序列为包含SEQ ID NO:1所示的部分连续序列，其具有式：(N)xAGGCGAGGG(N)y所示的结构，其中N选自A、T、G和C组成的组；x和y各自为选自0-21的整数，且6≤x+y≤21。在某些实施方案中，第二核苷酸的序列中的x＝0，且y为3-7的整数，例如6或7。在某些实施方案中，x为10-15的整数，例如13，且y＝0。在某些实施方案中，第二核苷酸的序列如SEQ ID NO:3所示。

在某些实施方案中，第一核苷酸的序列为SEQ ID NO:1所示的序列中的部分连续的序列，且包含CCACCAAATGCCCCCT，以便与第二核苷酸具有相似的Tm值。在某些实施方案中，第一核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

在某些实施方案中，进一步包含第三核苷酸，其长度为15-35bp，第三核苷酸序列的5’端与第一核苷酸的序列3’端的距离为1-25bp，第三核苷酸序列的3’端与第二核苷酸中AGGCGAGGG的距离为至少28bp。在某些实施方案中，第三核苷酸的序列如SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，第三核苷酸的序列为SEQ ID NO:1所示的序列中的部分连续的序列，且包含CAACACTTCCGGAAACTACTG，以便使第三核苷酸的Tm值高于第一和第二核苷酸。在某些实施方案中，第三核苷酸的序列如SEQ ID NO:4所示，其中在其5’端标记有FAM，在其3’端标记有BHQ1。

在某些实施方案中，第三核苷酸为探针。作为探针的实例包括，但不限于TaqMan探针、MGB探针、杂交探针。优选地，在探针5’端标记荧光发光基团。所述荧光发光基团的实例包括，但不限于FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX。在某些实施方案中，本发明可使用上述荧光发光基团中的一种或多种。另外，优选地，在探针3’端标记荧光猝灭基团。所述荧光猝灭基团的实例包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ。在某些实施方案中，本发明可使用上述荧光猝灭基团中的一种或多种。

在某些实施方案中，本发明的组合物中第一核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示(其中Y为简并碱基，本文中的序列中“Y”具有与此处相同的含义)，第二核苷酸的序列如SEQ IDNO:3所示，和第三核苷酸的序列如SEQ ID NO:4所示。此组合物的组合经过多轮筛选和优化，具有优异的灵敏度和特异度。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含其它核苷酸。所述其它核苷酸的实例包括，例如逆转录引物。在某些实施方案中，所述逆转录引物的序列如SEQ ID NO:5所示。在某些实施方案中，所述逆转录引物使用中国专利公布号CN20160706A中公开的引物。

在某些实施方案中，本发明的核苷酸序列如下表1所示，引物和探针所在位置如图1所示。

表1

Primer名称	SEQ ID NO	序列(5’to3’)
			2264P-F	1	TTYGGAGTGTGGATTCGC
2269P-F	2	GGAGTGTGGATTCGCACTCC
			2297P-F	3	AGACCACCAAATGCCCCT
2381P-R	4	CGTCTGCGAGGCGAGGG
			2374P-R	5	CGAGGCGAGGGAGTTCTT
2298-P	6	GACCACCAAATGCCCCTATCYTAT
			2312P-P	7	CCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTG
2322-P	8	CAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACG

在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列包含5’端引物。所述5’端引物可作为本发明中所述核酸扩增的特异性引物，其可用于扩增核酸内作为目标的特定区域，所述目标的特定区域根据不同需求而选定，并不特别限定。例如，特定区域一般为50-500pb长度，优选60-400pb，更优选70-300pb，还优选80-200pb。对于特定区域并不特别限定，只要所选定的区域对应的引物满足作为引物的基本条件即可，所述基本条件是本领域技术人员已知的条件。具体可参见，冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物。

在某些实施方案中，所述第二核苷酸序列包含3’端引物。3’端引物可作为核酸扩增的统一引物。

本发明中，所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列可包含其他序列，包括但不限定于，例如，索引序列、标记序列等。关于这些序列的连接方式，并不特别限定。例如，在第一核苷酸序列中，从5’端至3’方向，可以标记序列(例如，P7序列)、索引序列、5’端引物这样的顺序进行连接。

在某些实施方案中，核苷酸可分别提供，或者将两者作为混合物一起提供。核酸的浓度或含量并不特别限定，并且这些参数是本领域技术人员能够根据不同的需求而调整变化的。第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的浓度或含量通常情况下相同，本领域技术人员根据不同需求，也可将两者的浓度或含量配制为不同。

在某些实施方案中，在一次反应中同时检测乙型肝炎病毒的DNA和RNA的步骤中，可包括建立反应环境，从而使本发明核苷酸与靶序列结合。所述反应环境通常为水性环境，并且温度为20-40℃之间，优选37℃左右。所述环境条件是本领域技术人员能够确定的。

在某些实施方案中，检测步骤可采用本领域内通常使用的方法，例如各种类型的PCR方法。

本发明所述的组合物和试剂盒包含第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸。在某些实施方案中，任何上述物质之一可以与其他物质分离的状态单独存在，例如，第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸分别存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用时它们能够相互接触，从而作为一套或一组成分即可。另外，优选地，任何两种以上的上述物质可混合作为混合物存在。例如，将第一核苷酸和第二核苷酸两者作为混合物，而其他物质单独存在的状态；或者，将第一核苷酸、第二寡核苷酸和第二核苷酸三者的混合物作为一体而存在。

在示例性实施方式中，本发明的第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸分别以干燥粉末的形式提供。可选地，上述三种物质的至少之一为溶液，例如水溶液的状态存在。在以水溶液状态存在的情况下，这些物质的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，所述物质，例如核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

优选地，本发明的组合物或试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg²⁺等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。

优选地，本发明中的试剂盒还进一步包含使用说明书，其中在使用说明书中给出或教导了实施本发明所述方法或使用本发明所述组合物或试剂盒的指导、指引或教导。

实施例

在没有特别说明的情况下，本发明中使用的任何试剂均为市场购买的一般试剂。血液样本来自首都医科大学附属佑安医院收集的样本。

检测方法和体系的建立

采用的TaqMan探针法定量检测血液HBV核酸。其中第一核苷酸为正向引物，SEQ IDNO:1，第二核苷酸为反向引物，SEQ ID NO:5，第三核苷酸为探针，SEQ ID NO:6。

先利用逆转录引物HR-RT将所提样本中的RNA逆转录为cDNA。然后利用HBV特异性正、反向序列引物进行扩增，TaqMan探针序列紧靠正向引物。为了确定本发明所确定引物和探针的检测体系，发明人首先采用琼脂糖凝胶的方法检测了引物的特异性。结果显示，本发明中PCR产物条带单一，没有杂带，引物的特异性高(图2)。

此外，发明人分别尝试检测体系中探针用量和退火温度两个关键因素对荧光定量PCR反应的影响。结果显示，不同浓度的探针对于荧光定量PCR反应的扩增强度和灵敏度无明显影响，所得扩增曲线基本重叠。不同退火温度对荧光定量PCR反应的扩增强度和灵敏度有一定的影响，具体参见图3和图4。

实验步骤：

样本处理：血清或血浆常规制备方法。

HBV pgRNA的提取:使用病毒核酸提取试剂盒(全式金-EasyPure Viral DNA/RNAKit)，提取乙型肝炎(C型)患者血清或血浆中HBV RNA和DNA，得到检测样本。

采用一步法逆转录-荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测HBV总核酸(DNA+RNA)，将提取的病毒总核酸(HBV DNA+RNA)中的HBV RNA逆转成cDNA后进行荧光定量PCR扩增。

配制一步法qRT-PCR反应体系(20μl)

轻弹混匀，瞬离，在ABI Step One Plus荧光定量PCR仪中，25℃10分钟，50℃30分钟；94℃预变性5分钟；然后94℃25秒，55℃30秒，40个循环；在每个循环的延伸阶段(55℃)同步采集荧光。

构建诊断试剂标准品

取1.2×HBV DNA质粒，将质粒转入大肠杆菌进行培养，试剂盒提取质粒，Nanodrop检测所提质粒浓度，换算成拷贝浓度，然后稀释到特定浓度作为标准品使用。

试剂性能检测：

1.灵敏度：

将构建好的A、B、C和D基因型质粒标准品进行10倍倍比稀释，浓度分别为3.00E+09、3.00E+08、3.00E+07、3.00E+06、3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02copies/ml。用上述确定的检测体系和循环参数对倍比稀释的标准品进行定量检测。结果显示，本发明的荧光定量检测方法具有较高的灵敏度，在3.00E+02copies/ml时也可检出，结果如图5-8所示。

结果参见图3。

2.特异度：

选取感染HBV患者血液，提取HBV核酸样本，将之分成四组，一组经逆转录处理后上机检测(DNA+RNA)，一组用DNA酶处理后直接上机检测，第三组用DNA酶处理后，再经过逆转录后上机检测(RNA)，第四组为正常人血清样本直接上机检测(阴性样本)。结果如图9所示。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

3.精密度：

选取质粒浓度为3.00E+06copies/ml的标准品进行检测，重复10次。结果显示，10次重复检测的ct值的标准差(SD值)均小于2％，重复性较好。参见图10。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 核苷酸组合物、试剂盒及其用途

<130> 1700061CN

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Waldsteinia fragarioides

<400> 1

ttyggagtgt ggattcgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggagtgtgga ttcgcactcc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agaccaccaa atgcccct 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccctcgcctc gcagacg 17

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagaactccc tcgcctcg 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaccaccaaa tgcccctatc ytat 24

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctatcttat caacacttcc ggaaactact g 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caacacttcc ggaaactact gttgttagac g 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cacacgacac tttcccacct tatgagtcca a 31

<210> 10

<211> 240

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 10

tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggta tcttttggag tgtggattcg 60

cactcctcca gcttacagac caccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac 120

tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag 180

gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tctcaatgtt agtatccctt 240

Claims (10)

1.一种核苷酸组合物，其包含序列分别为选自SEQ ID NO:1的连续的部分序列的第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸，其中：

所述第一核苷酸的序列长度为15-30bp；

所述第二核苷酸的序列如式：(N)xAGGCGAGGG(N)y所示，其中N选自A、T、G和C组成的组；x和y各自为选自0-21的整数，且6≤x+y≤21；

所述第三核苷酸的序列的长度为15-35bp，其5’端与所述第一核苷酸的序列3’端的距离为1-25bp，其3’端与所述第二核苷酸中AGGCGAGGG5’端的距离为至少28bp。

2.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其中所述第一核苷酸的序列包含CCACCAAATGCCCCCT，和/或所述第三核苷酸的序列包含CAACACTTCCGGAAACTACTG。

3.根据权利要求1所述的核苷酸组合物，其中所述第二核苷酸的序列中，x＝0，且y为3-7的整数；或者x为10-15的整数，且y＝0。

4.根据权利要求1-3任一项所述的核苷酸组合物，其中所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以混合物的形式存在；或所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以各自独立的形式存在。

5.根据权利要求1-3任一项所述的核苷酸组合物，其进一步包含用于逆转录的核苷酸。

6.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物。

7.一种检测样品中是否存在乙型肝炎病毒的非诊断性方法，其包括使用根据权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物，或根据权利要求6所述的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的非诊断性方法，其包括在一次反应中同时检测乙型肝炎病毒的DNA和RNA的步骤；或者包括在检测之前将样本中的RNA逆转录为cDNA的步骤。

9.根据权利要求7或8所述的非诊断性方法，其中所述样品为血液样品。

10.根据权利要求1-5任一项所述的核苷酸组合物或根据权利要求6所述的试剂盒在制备用于乙型肝炎病毒检测的试剂中的用途。