CN105734173A - 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血液乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(pregenome RNA，pgRNA)荧光定量PCR检测体系，以及利用该检测体系对HBV pgRNA进行检测的方法。所述检测体系包括正向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:1所示；反向引物，其核苷酸序列如SEQ NO:2所示；带有随机锚定序列的逆转录引物，其核苷酸序列如SEQ NO:3所示；以及探针，其核苷酸序列如SEQ NO:4所示。采用本发明的检测体系和方法，可用于制备HBV诊断试剂或试剂盒。本发明排除了在检测过程中HBV DNA或其他RNA带来的可能干扰，确保了血液HBV pgRNA检测的特异性。

Description

一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法

技术领域

本发明一般涉及乙型病毒性肝炎的诊断和治疗，以及感染病学、分子生物学、细胞生物学等领域。更具体地，本发明涉及一种血液中乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)pgRNA的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染呈世界流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。我国属于HBV感染中高流行地区。2006年全国HBV血液流行病学调查显示，我国1～59岁一般人群中HBsAg携带率为7.18％。据此推算，我国慢性HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万例。在我国，慢性HBV感染与肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生密切相关。目前治疗慢乙肝的药物主要为干扰素和核苷(酸)类似物两类。两类药物均可高效抑制HBV复制，但由于肝细胞内共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的持续存在，使得目前慢乙肝治疗的临床治愈率很低(<5％)，停药后慢乙肝复发率较高，因此慢乙肝患者需要长期甚至终身服药。长期服药会给患者甚至社会带来极大的负担，并且在治疗过程中有可能会导致HBV耐药株的出现。基于此，目前迫切需要一种更加灵敏和精确的血液学指标，用于监测慢乙肝治疗的疗效和安全停药。

多篇文章已经证实血液中存在HBVRNA，具体的，HBVRNA可以存在于血清和/或血浆中，并且其水平与慢乙肝治疗的疗效和预后密切相关。然而，目前用于检测血液HBVRNA的荧光定量PCR方法的灵敏度和特异度均有待改善。发明人在前期研究中系统证实了血液中HBVRNA的存在形式和产生机制，其是存在于核衣壳内的HBVPregenomeRNA(pgRNA)在未经逆转录或不完全逆转录的情况下分泌至细胞外的。由此可见，血液中的HBVRNA实际上为pgRNA。定量检测血液HBVpgRNA的水平可更好地监测肝细胞内HBVcccDNA的水平，不失为一种良好的检测慢乙肝治疗疗效和安全停药的预测指标。开发定量检测血液中pgRNA的诊断试剂或试剂盒对于临床上慢乙肝的有效治疗和安全停药具有重要的指导意义。

发明内容

本发明一方面提供了一种血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系包括：正向引物，其核苷酸序列如SEQNO:1所示；反向引物，其核苷酸序列如SEQNO:2所示；以及反向锚定引物，其核苷酸序列如SEQNO:3所示。

其中，正向引物SEQNO:1为AGACCACCAAATGCCCCT；反向引物SEQNO:2为(N)_16-30。(N)_16-30是指作为随机锚定序列的核苷酸序列，N可为A、T、C或G，且下角标处16-30表示碱基数目。反向锚定引物SEQNO:3为(N)_16-30-AGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA。SEQNO:2和SEQNO:3中的(N)_16-30表示相同的随机锚定序列。本领域技术人员知晓，虽然(N)_16-30为随机序列，但为了保证扩增的效率，其应避免设计成为与HR-F或Probe-HR形成引物二聚体。此外，为了增加扩增的效率，在引物两端添加随机碱基后形成的引物序列也涵盖在本发明中。

在本发明的一些实施例中，血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系还包括探针，其核苷酸序列如SEQNO:4所示。其中，探针SEQNO:4为CAACACTTCCGGARACTACTGTTGTTAGACG。

在本发明的一些具体实施例中，血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系中，所述探针为TaqMan探针、MGB探针、杂交探针中的一种。标记所述探针5’端的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；并且标记所述探针3’端的是一种荧光猝灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

本发明的另一方面还提供了如前所述的血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系在制备HBV诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明的又一方面还提供了一种血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测方法，包括：

步骤1.以待测血液HBVpgRNA为模板，用序列如SEQNO：3的引物进行逆转录；

步骤2.以获得的逆转录产物为模板，用序列如SEQNO：1和2的引物和序列如SEQNO：4的探针进行扩增，以定量检测血液中的HBVpgRNA。

在本发明的一些实施例中，步骤2还可以为以获得的逆转录产物为模板，用序列如SEQNO：1和2的引物进行扩增，并掺入荧光染料，以SYBRGreen法定量检测血液中的HBVpgRNA。

本发明的有益效果

本发明首次根据HBVpgRNA的特点在pgRNA的5’端设计了针对不同基因型HBV高度保守的特异性引物和探针，这样就排除了其它HBVRNA带来的可能干扰。除此之外，本发明还在逆转录引物上加上了一段人工设计的锚定序列用来排除在检测过程中HBVDNA带来的可能干扰，确保了血液HBVpgRNA检测的特异性。

本发明的特异性引物和探针可检测我国存在的所有基因型HBV，包括我国主要存在的B型和C型HBV、在我国新疆、西藏等地分布的D型HBV、以及散发分布的A型HBV。

本发明的引物、探针和锚定序列是在最初设计的多条序列的基础上，通过多轮筛选和优化后确定的特异性和灵敏度最优的序列。

附图说明

图1示出正方向引物，逆转录引物和对应的探针的设计，其中图1A通过MegAlign软件分析不同基因型HBV的保守序列，图1B和1C分别示出利用PrimerPremier5软件分析锚定序列(反方向引物)和正方向引物的发卡结构、二聚体和错配的分析情况。

图2示出利用本发明实施的血清HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系对血液HBVpgRNA进行检测的流程图。

图3A示出利用HR-F和HR-R扩增时的溶解曲线；图3B示出利用非专利文献1(vanF,etal.SerumHepatitisBVirusRNALevelsasanEarlyPredictorofHepatitisBEnvelopeAntigenSeroconversionDuringTreatmentWithPolymeraseInhibitors,Hepatology.2015；61:66-76.)中的引物扩增时的溶解曲线；图3C示出检测体系中探针用量对荧光定量PCR反应的影响，其中1为体系中加入0.6μl浓度为10μM的探针，2为体系中加入0.8μl浓度为10μM的探针，两者扩增曲线基本重叠；图3D示出检测体系中退火温度对荧光定量PCR反应的影响，其中分别利用56、58、60、62摄氏度的退火温度进行定量PCR反应，所得扩增曲线基本重叠。

图4示出诊断试剂标准品测序结果。

图5示出本发明的荧光定量PCR检测方法的灵敏度检测，其中图5A示出不同终浓度质粒经过检测后的Ct值，图5B示出利用浓度和Ct值构建的标准曲线，图5C示出荧光定量PCR最终得到的扩增曲线。

图6示出非专利文献1中报道的血清HBVRNA荧光定量检测方法的灵敏度评价，其中，图6A示出不同终浓度质粒经过检测后的Ct值，图6B示出利用浓度和Ct值构建的标准曲线，图6C示出荧光定量PCR最终得到的扩增曲线。

图7示出对不同基因型HBVpgRNA的水平检测，其中，图7A示出慢性乙肝患者血清中B基因型HBV的检测结果，图7B示出慢性乙肝患者血清中C基因型HBV的检测结果，图7C示出HepAD38细胞上清的检测结果，该种细胞分泌产生D基因型HBV。

图8示出本发明的荧光定量PCR检测方法对HBVpgRNA的特异性评价，其中，图8A示出利用本发明的定量PCR体系检测不同的模板，其中1为将提取出的HBV核酸混合物经DnaseI处理后利用引物HR-RT进行逆转录后的产物；2为提取出的、未经处理的HBV核酸混合物；3为经DnaseI处理后的HBV核酸混合物，图8B示出正常人血液经过核酸提取、逆转录处理后进行定量检测的结果，其中4为慢性乙肝患者血清的阳性对照；5和6为正常人血清的检测结果。

图9示出质粒浓度为1×10³copies/ml标准品的重复性检测结果。

具体实施方式

除非特别说明，本发明的术语具有本领域通常使用的含义。

术语“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基还含有经修饰的其他杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环化合物。此外，术语“核苷酸”包括那些含有半抗原或荧光标记以及可以不仅含有常规核糖和脱氧核糖还含有其他糖的部分。修饰的核苷或核苷酸还可以在糖部分上包含修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团取代，被官能化为醚、胺等等。

术语“引物”是指长度通常为约20至30个碱基的、短的、化学合成的寡核苷酸。它们与靶DNA杂交，然后靶DNA通过DNA聚合酶复制产生互补的DNA链。“正向引物”和“反向引物”构成PCR中所用的“PCR引物组”，其中它们与互补的DNA链杂交，并指导向着彼此复制，分别产生上链和下链，导致靶DNA片段以指数增长。

根据本发明的方法包含对RNA的(优选地3'聚腺苷酸)尾和用于反转录的(聚腺苷酸)尾上游的最近的1到10个核苷酸，优选地1到5个核苷酸，更优选地3到5个核苷酸特异的引物和/或一个对cDNA的相应的(5'聚胸苷酸)序列特异的扩增引物，该序列对RNA尾(3'聚腺苷酸)尾和cDNA的相应的(5'聚胸苷酸)序列下游的最近的的1到10个核苷酸，优选1到5个核苷酸，更优选3到5个核苷酸互补。相应地，除前述公开的引物外，可增加引物对的选择能力并因而增加被最接近末端序列锚点的特定核苷酸所确定的cDNA群的数目。

术语“锚定引物”是指在基因特异性引物的5’末端加入一段修饰序列(包括酶切位点、标签序列和人工设计的随机序列等)，然后通过逆转录或PCR扩增将该修饰序列锚定在目的基因上，最终以该锚定序列作为引物进行后续检测。在一定程度上可提高特定基因检测的特异性。

术语“探针”是指用捕获标记或检测标记来标记引物，检测引物产物。探针序列用于与引物序列所产生的序列进行杂交，并且通常与不包括引物序列的序列杂交。与引物序列类似，探针序列也用捕获标记或检测标记来标记，需说明的是当引物用捕获标记来标记时，用检测标记来标记探针，反之亦然。在本发明中探针可以为TaqMan探针、MGB探针、杂交探针中的一种。比如，所述探针为TaqMan探针，标记探针5’端的为一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；标记探针3’端为一种荧光猝灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不在于限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

1.引物和探针的设计

目前，HBV分为至少10种基因型，在我国存在A～D4种基因型。根据我国存在的HBV基因型，发明人从GenBank中下载多条A～D基因型HBV参考序列，通过MegAlign软件分析不同基因型HBV基因组的保守区域。遵循引物和探针的设计原则，在这些保守区域中通过PrimerPremier5软件设计出针对pgRNA检测的特异性引物和探针序列。为排除HBVDNA的干扰，发明人在逆转录引物的5’端加入了一段随机锚定序列。在上述引物、探针和随机锚定序列设计过程中，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成。此外，发明人通过NCBIBlast在线数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对上述设计的HBV特异性引物和探针序列以及随机锚定序列进行比对分析避免与其它病毒或人类基因发生非特异结合。通过多轮筛选和优化，最终确定一套灵敏度和特异度最优的引物、探针和随机锚定序列，序列如表1所示。HBV特异性序列均为A～D基因型HBV的高度保守序列(见图1A)。

表1.引物序列

其中，Probe-HR的5’端荧光探针为FAM，3’端荧光探针为BHQ1。HR-R1、HR-RT1序列的下划线部分为相同的随机锚定序列，HR-R2、HR-RT2序列的下划线部分为相同的随机锚定序列。如本领域技术人员所知，发明人通过实验进一步证实，随机锚定序列不影响检测的效率，只要尽量不与HR-F或Probe-HR形成引物二聚体即可。

2.检测方法及体系的建立

采用的TaqMan探针法定量检测血液HBVpgRNA的原理是：先利用加入锚定序列的特异性逆转录引物HR-RT将提取出的RNA逆转录为带有锚定序列的cDNA。

具体操作如下，提取后的核酸混合物利用DNaseI(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)处理。

DNaseI处理体系(10μl)为：

将混合物置于37℃孵育30分钟后再加入

EDTAlμl

HR-RT(10μM)lμl

65℃孵育10分钟

随后通过RevertAidFirstStrandDNASynthesisKit(ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)用将其逆转录成为cDNA。

逆转录反应体系(20μl)为：

反应条件为：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

然后利用HBV特异性正向序列和锚定序列分别作为定量PCR检测的正向和反向引物进行扩增，TaqMan探针序列紧靠正向引物(图2)。为了确定本发明所确定引物和探针的检测体系，发明人首先采用SYBRGreen的方法检测了引物的特异性，并将其扩增的溶解曲线与非专利文献1中报道的引物做了比较。结果显示，本发明中引物的特异性(图3A)优于非专利文献1中所使用的引物(图3B)。此外，发明人分别尝试了检测体系中探针用量和退火温度两个关键因素对荧光定量PCR反应的影响。结果显示，不同浓度的探针(图3C)和不同退火温度(图3D)对于荧光定量PCR反应的扩增强度和灵敏度无明显影响，所得扩增曲线基本重叠。

最终，采用的荧光定量PCR的反应体系(30μl)如下：

在ABIStepOnePlus荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增循环参数为50℃，5分钟，94℃，2分钟；然后94℃，15秒，58℃，45秒，45个循环；在每个循环的延伸阶段(58℃)同步多次采集荧光。

另外，可以使用SYBR-GreenI进行荧光染色。反应体系(20μl)如下：

在ABIStepOnePlus荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增循环参数为50℃，5分钟，94℃，2分钟；然后94℃，15秒，58℃，45秒，45个循环；在每个循环的延伸阶段(58℃)同步多次采集荧光。加设溶解曲线步骤：95℃，15秒，60℃，1分钟，然后从60℃梯度升温，每升高0.3℃采集一次荧光信号，直到温度升高到到95℃，95℃维持15秒。

3.构建诊断试剂标准品

提取HBV稳定复制细胞系HepAD38细胞培养上清中的HBVpgRNA，利用HR-RT逆转录引物进行逆转录后，用HR-F和HR-R进行扩增，将扩增后的目的片段切胶回收后连接至pEASY-Blunt克隆载体上。经测序验证为装入的目的片段后，作为实验室内部检测血液HBVpgRNA的标准品使用。

最终目的片段序列为：

AGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTGTGTCGTGTGTTACGGTGTGA(SEQNO:9)

测序验证的峰图如图4所示。

4.灵敏度的检测

将构建好的标准品进行10倍倍比稀释，浓度分别为1.00E+08、1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03、1.00E+02、1.00E+01copies/ml。用上述确定的检测体系和循环参数对倍比稀释的标准品进行定量检测。结果显示，本发明的荧光定量检测方法具有较高的灵敏度，线性范围可低至1.00E+01copies/ml；标准曲线的线性回归方程为：y＝-3.2645x+40.393，相关系数的平方R²＝0.9993(图5)。

与非专利文献1中报道的血液HBVRNA荧光定量检测方法进行比较，结果显示，非专利文献1所建立的荧光定量PCR方法的扩增标准曲线的线性回归方程为：y＝-3.4315x+45.463，相关系数的平方R²＝0.9952(图6)。以同等浓度的标准品，本发明的荧光定量PCR检测方法扩增的ct值较非专利文献1所建方法低3个循环以上，表明本发明的检测方法更加灵敏。

在检测质粒标准品的基础上，利用本发明建立的荧光定量PCR方法检测了不同基因型(B、C和D基因型)的HBVpgRNA的水平，并对其灵敏度进行了评价。

其中B、C型来源于病人的血液，HBVpgRNA经本发明的荧光定量PCR检测方法测量后的浓度分别为1.33E+06、1.50E+06copies/ml，以10倍倍比稀释，稀释后的浓度分别为1.33E+05、1.33E+04、1.33E+03、1.33E+02copies/ml，1.50E+05、1.50E+04、1.50E+03、1.50E+02copies/ml。

D型来源是HepAD38细胞的上清，HBVpgRNA经本发明的荧光定量PCR检测方法测量后的浓度为3.26E+05copies/ml，以10倍倍比稀释，稀释后的浓度为3.26E+04、3.26E+03、3.26E+02、3.26E+01copies/ml。

结果显示，在B、C和D基因型HBVpgRNA的定量检测中，本发明建立的荧光定量PCR方法仍显示出较高的灵敏度(图7)。

5.特异性的检测

使用EasyPureViralRNAKit(TransGen，货号：ER201-01)核酸提取试剂盒提取HBV感染者血液中的核酸(包括DNA和RNA)。该血液中HBVDNA载量为9.45E+07copies/ml，HBVpgRNA经本发明的荧光定量PCR检测方法测量所得载量为1.48E+06copies/ml，核酸提取后分为3组，第1组经DNaseI处理后进行逆转录反应，第2组不做任何处理，第3组进行DNaseI处理。3组同时利用本发明所建立的荧光定量PCR方法检测。

结果显示，在HBVDNA水平(9.45E+07copies/ml)高于HBVpgRNA(1.48E+06copies/ml)的血液中，即使提取的核酸不进行DNase的处理，其对HBVpgRNA检测的干扰很小(图8A中的2)，经DNase处理后干扰消失(图8A中的3)。

除此之外，还检测了两例正常人的血液，结果均低于检测下限(图8B中的5和6)。

上述结果表明，本发明建立的血液HBVpgRNA荧光定量检测方法具有较高的特异度，即使不经DNase预处理，HBVDNA对pgRNA检测的干扰微不足道。

6.重复性检测

选取质粒浓度为1.00E+03copies/ml的标准品进行检测，重复30次。结果显示，30次重复检测的ct值的标准差(SD值)为0.275537，重复性较好(图9)。

7.临床样本的检测

用本发明的荧光定量PCR方法对5例未经抗病毒治疗的慢乙肝患者血液HBVpgRNA进行了检测。同时，血液HBVDNA水平经商品化的HBVDNA定量检测试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)检测。

结果显示，未经抗病毒治疗的慢乙肝患者血液中存在一定水平的HBVpgRNA，其水平低于HBVDNA水平(表2)。

随后，将上述血液进行10倍倍比稀释，然后用本发明的荧光定量PCR检测方法对不同稀释度的血液样本进行检测。结果如表3所示，本发明的荧光定量PCR检测方法对于临床样本的检测应显示出较高的灵敏度。

表2.未经抗病毒治疗的慢乙肝患者血液中HBVDNA和HBVpgRNA水平

表3.梯度稀释后的慢乙肝患者血液中HBVpgRNA水平

同样可用SYBR-Green法定量检测血清HBVpgRNA水平。首先用SYBR-Green法检测标准品，并绘制标准曲线，然后按照上述步骤检测临床样本，即可定量检测血液中的HBVpgRNA水平。

Claims (6)

1.一种血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系，包括：

正向引物，其核苷酸序列如SEQNO:1所示；

反向引物，其核苷酸序列如SEQNO:2所示；以及

反向锚定引物，其核苷酸序列如SEQNO:3所示。

2.如权利要求1所述的血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系，还包括：

探针，其核苷酸序列如SEQNO:4所示。

3.如权利要求2所述的血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系，其中，

所述探针为TaqMan探针、MGB探针、杂交探针中的一种。

4.如权利要求3所述的血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系，其中，

标记所述探针5’端的是一种荧光发光基团，其是FAM、VIC、TET、JOE、ROX、CY3、CY5、HEX中的一种；并且

标记所述探针3’端的是一种荧光猝灭基团，其是BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL、NFQ中的一种。

5.如权利要求1-4任一项所述的血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测体系在制备HBV诊断试剂或试剂盒中的应用。

6.一种血液HBVpgRNA荧光定量PCR检测方法，包括：

步骤1.以待测血液HBVpgRNA为模板，用序列如SEQNO：3的引物进行逆转录；以及

步骤2.以获得的逆转录产物为模板，用序列如SEQNO：1和2的引物和序列如SEQNO：4的探针进行扩增，以定量检测血液中的HBVpgRNA；或者以获得的逆转录产物为模板，用序列如SEQNO：1和2的引物进行扩增，并掺入荧光染料，以SYBRGreen法定量检测血液中的HBVpgRNA。