CN107475444A

CN107475444A - 一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增rna的pcr引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN107475444A
Application number: CN201710661443.9A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 高鸣; 冯成千
Original assignee: Guangzhou City No8 People's Hospital
Current assignee: Guangzhou Da'an gene Co.,Ltd.
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN107475444B

Abstract

本发明提供了一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法。采用该PCR引物可以广谱检测所有基因型HBV病毒中的RNA，该PCR引物与探针组合可以保证在HBV DNA与RNA基因组混合核酸中选择性地只针对HBV RNA进行特异性扩增，并且适用于所有基因型，具有广谱扩增的特性。用于RNA检测中，提取的HBV总核酸可以直接用于检测，无需进行DNaseI消化以降解其中的DNA。

Description

一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，缩写HBV)是一种DNA病毒，属于嗜肝 DNA病毒科(Hepadnaviridae)。HBV基因组全称约3.2kb。HBV有多个基因型 A-H(ref)。全世界约有2.4亿感染HBV，中国有9700万HBV感染者，其中慢性 HBV感染约有2000万。

HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV的复制模板，虽然目前临床上所有的治疗策略(包括核苷类似物药物与干扰素)并不能直接达到清除cccDNA 的效果，但是，一部分患者在经过治疗(特别是干扰素治疗)后，可以实现临床治愈或者HBV病毒载量可以降低到很低的水平，这些病人需要每隔一定时间 (3到6个月)进行定期检测。在HBV领域仍旧需要更为灵敏的检测方法。

即使在核苷类药物的有效抑制下，由于HBV cccDNA长期存在于细胞内，仍旧有源源不断的病毒RNA产生。日本学者最早在2006年发文章报道，在HBV患者血清中可检测到RNA核酸，并且初步证明HBV RNA被病毒颗粒包裹，最早提出了HBV RNA可以作为抗HBV药物拉米夫定治疗效果检测的病毒标记物(J Gastroenterol 2006，41：785-790,DOI：10.1007/S00535-006-1856-4)。几乎同时，日本学者Kazuaki Chayama研究团队，通过比较两种不同的HBV核酸检测方法，发现在HBV患者血清中有DNA和RNA核酸，血清中HBV RNA水平可以作为拉米夫定经治病人出现耐药突变的早期监控指标之一(Hepatology 2007,45:1179-1188，DOI：10.1002/hep.21581)。六年后，Kazuaki Chayama研究团队进一步表文章报道，血清中HBV RNA与HBeAg是慢行乙肝患者经治后可以停止治疗的重要参考标志物之一(JGastroenterol 2013，48：1188-1204,DOI：10.1007/S00535-012-0737-2)。两年后，德国研究小组发表文章证明，HBV RNA 可以作为HBV聚合酶抑制剂抗病毒治疗过程中出现HBeAg血清转换的重要标志，HBeAg阳性患者如果其血清中RNA水平出现明显降低将预示着该患者可以获得HBe血清转换(Hepatology 2015,61:66-76，DOI：10.1002/hep.27381)。稍后，芬兰科学家证明，慢性乙肝患者血清中的HBV RNA是pgRNA(Pregenomic RNA，可以作为HBV病毒逆转录过程模板，以产生病毒颗粒的全长 RNA),pgRNA被病毒包裹，其水平与现有已知的病毒标志物(HBV DNA， HBeAg，HBeAb，HBsAg，HBsAb，HBcAg)的表达特征有明显不同的变化特征，在干扰素治疗和核苷类似物治疗过程中，如果HBV RNA水平降低将预示着更好的临床治疗效果，并提出HBV RNA可以作为独立的检测指标用于评价慢性 HBV患者治疗效果(J InfectDiseases 2016,213:224-232, DOI:10/1093/infdis/jiv397)。2016年，我国学者也报道了，血清中HBV RNA即为 HBV pgRNA，并直接证明HBV pgRNA存在HBV病毒颗粒之中。同时将此概念更提前一步，提出HBV RNA可以作为有效治愈后或者治愈后复发的重要病毒学指标(J Hepatology,2016,DOI:10.1016/j.jhep.2016.05.029)。由此可见，HBV RNA 可以作为HBV临床治愈的一个参考指标，其水平的高低与变化可以在一定程度上预示HBV cccDNA的活动状态。

上述研究中的检测手段也都不同，鉴于上述研究主要是为了科学发现，并没有追求检测方法的特异性、灵敏度和通用行。为了能够达到临床检测的目的，需要对检测的方法学进行系统优化。

另外，从患者血清中提取的HBV总核酸包括DNA与RNA。RNA全长3.5kb，包含了基因型DNA(3.2kb)的全部序列，现有使用的PCR引物都可同时与RNA 和DNA相结合，不能选择性的扩增HBV RNA。因此在检测过程中，通常先提取HBV病毒全核酸(DNA+RNA)，然后利用DNase消化去掉DNA，再进行 RNA提取检测。由此可见，现有检测过程涉及多个步骤，其缺点是耗时长、成本高、需要设定及其严格的对照。因此，急需开发一种选择性从HBV全核酸 (DNA+RNA)中选择性扩增RNA的一步法检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的 PCR引物、试剂盒和方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物，所述PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

上游引物序列：5’-GCAACTTTTTCACCTCTGCCTA-3’，

下游引物序列：

5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAC-3’。

本发明提供了一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的PCR引物，以及Taqman探针，所述Taqman探针的5’端标记有报告荧光基团，所述Taqman探针的3’端标记有淬灭荧光基团，所述 Taqman探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

优选地，所述报告荧光基团包括FAM，所述淬灭荧光基团包括BHQ。Taqman 探针序列：5’FAM-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGG-BHQ1-3’。

上述所述的定量PCR引物在制备从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA 的试剂盒中的用途。

上述所述的定量PCR引物在制备定量检测乙型肝炎病毒RNA的试剂盒中的用途。

本发明提供了一种采用上述所述的定量PCR引物或采用上述所述的试剂盒从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的方法。

本发明提供了一种采用上述所述的试剂盒定量检测乙型肝炎病毒RNA的方法。

优选地，所述乙型肝炎病毒的基因型为中国流行株B或C基因型。

本发明的方法是开发一种灵敏、通用的HBV RNA检测方法。本发明分析了已有HBV病毒的保守序列，针对高度保守区和RNA的特殊结构设计了引物和探针。建立了基于Taqman探针的定量PCR检测方法，可以HBV总核酸 (DNA+RNA)直接作为模板进行扩增检测，无需使用DNase事前对其中的 DNA进行消化处理以降低DNA对检测的干扰造成的非特异扩增。本发明适用于HBV核酸RNA的检测，不扩增病毒DNA。本发明在检测RNA方面更有优势，所设计的引物和探针直接针对所有病毒RNA共有的保守区域，具有通用型特征。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法。采用该PCR引物可以广谱检测所有基因型HBV病毒中的RNA，其中，一条引物针对的是HBV基因组最为保守序列序列，另外一条引物针对 HBV RNA特异结构序列，以保证只扩增HBV RNA序列，同时，Taqman探针结合序列为HBV保守序列，HBV A-F、H基因型扩增产物长162bp，HBV G基因型扩增长度198bp。该PCR引物对与探针组合可以保证在HBV DNA与RNA 基因组混合核酸中选择性地只针对HBV RNA进行特异性扩增，并且适用于所有基因型，具有广谱扩增的特性。用于RNA检测中，提取的HBV总核酸可以直接用于检测，无需进行DNaseI消化以降解其中的DNA。

附图说明

图1为本发明实施例1中HBV检测引物与探针结合位点图；

图2为本发明实施例1中使用不同引物组检测HBV RNA的标准曲线对比图；

图3为本发明实施例2中HBV RNA临床检测数据。

具体实施方式

实施例1

实施例1：HBV病毒RNA标准品检测

HBV RNA标准品制备。带有T7启动子的HBV质粒DNA，经过线性化处理后，通过体外转录得到单链RNA。通过计算拷贝数，然后，将RNA稀释为2e5拷贝/μl,2e4拷贝/μl,2e3拷贝/μl,2e2拷贝/μl,20拷贝/μl,2拷贝/μl,0.5拷贝/μl, 0.125拷贝/μl。

定量PCR检测，使用试剂盒(One step PrimeScript RT-PCR Kit货号： RR064A)，反应体系如表1。

表1反应体系

	体积
		2×one-step RT-PCR buffer	10μl
上游引物(10μM)	0.6μl
		下游引物(10μM)	0.6μl
Taqman探针(10uM)	0.2μl
		PrimeScript RT Enzemy Mix II	0.4μl
Takara Ex Taq(5U/μl)	0.4μl
		ROX(50×)	0.4μl
H₂O	2.4μl
		模板	5μl
总体积	20μl

定量PCR反应程序如下：

回Step3，运行45个循环。

本发明对定量PCR的上游引物、下游引物和Taqman探针进行了设计，HBV 检测引物与探针结合位点图如图1所示，设计的Taqman探针序列： 5’FAM-TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGG-BHQ1-3’(SEQ IN NO:3)，将设计的许多引物组中效果较好的三组引物对的扩增效率进行比较：

引物组1：

上游引物：5’-GCAACTTTTTCACCTCTGCCTA-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物1：

5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAC-3；(SEQ ID NO:2)

引物组2：

上游引物：5’-GCAACTTTTTCACCTCTGCCTA-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物2：

5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTCCACAGAAG-3(SEQ ID NO:4)；

引物组3：

上游引物：5’-GCAACTTTTTCACCTCTGCCTA-3’(SEQ ID NO:1)，

下游引物3：

5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3。(SEQ ID NO:5)

所得结果见附图2。

从图2的结果可以看出，引物组1具有良好的检测灵敏度(图2A)，可以有效扩增2.5拷贝/反应，检测曲线也比较标准，斜率-3.653，截距43.93。引物组 2的特异性较差(图2B)，检测时在3’端可能造成非特异扩增，导致在低浓度的检测非特异，并且没有线性特征。引物组3的扩增效率较低(图2C)，在100 拷贝一下已经检测不到信号。而且斜率(-4.9)和截距(52.9)都很差。

实施例2：HBV感染者血清中特异性RNA检测。

HBV总核酸提取：选取DNA浓度已知的HBV患者血清(6份)。200ul HBV 患者血清经过经过Qiagen病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit 货号：52904)提取HBV病毒核酸，洗脱体积为100μl，留取10μl洗脱下的核酸。

定量PCR检测：检测分为HBV DNA与HBV RNA两种。使用相同的检测试剂盒(Onestep PrimeScript RT-PCR Kit货号：RR064A)，反应体系如表2所示。唯一不同的是单独检测HBV DNA的孔不加入PrimeScript RT Enzemy Mix II，也就是说不进行反转录。只有检测HBV RNA是才加入PrimeScript RT Enzemy Mix II。同时为了检测HBV RNA样品中残留的DNA。

表2反应体系

定量PCR反应程序如下：

回Step3，运行45个循环。

检测过程中使用的上游引物和探针均相同，下游引物如下：

下游引物1：

GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTCCAC

下游引物2：

GACCRATCCTGTCACCTCTGACTTTTTTTTTTTCCACAGAAG

此实验使用了6个不同病人血清样本，参照标准曲线，计算出所得病毒的 DNA与RNA，检测结果见附图3。

使用效果最好的下游引物1的反应体系中，在混合DNA+RNA模板中，如果不加反转录酶，检测不到信号；只有加入反转录酶的反应孔中才有扩增信号 (图3A)。该结果说明，下游引物1可以选择性扩增HBV RNA，而不能以DNA 为模板进行扩增。

使用下游引物2的反应体系中，在混合DNA+RNA模板中，即使不加反转录酶，也可以检测到扩增信号；加入反转录酶的反应孔中扩增信号变强，但是检测结果数值低于图3A中使用优化下游引物所得的结果(图3B)。该结果说明，下游引物2选择性扩增HBV RNA的能力较差(图3B)，可以混合模板中DNA为模板进行扩增。

同时也发现，HBV感染者1,2,3,4,5中，HBV DNA水平高于RNA水平，在6 号感染者中发现，HBV RNA高于HBV DNA。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州市第八人民医院

<120> 一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物、试剂盒和方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacttttt cacctctgcc ta 22

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaccratcct gtcacctctg actttttttt tttttttttc cac 43

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcaagcctc caagctgtgc cttgg 25

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaccratcct gtcacctctg actttttttt tttccacaga ag 42

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaccratcct gtcacctctg actttttttt ttttttttt 39

Claims

1.一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的PCR引物，以及Taqman探针，所述Taqman探针的5’端标记有报告荧光基团，所述Taqman探针的3’端标记有淬灭荧光基团，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述报告荧光基团包括FAM，所述淬灭荧光基团包括BHQ。

4.如权利要求1所述的定量PCR引物在制备从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的试剂盒中的用途。

5.如权利要求1所述的定量PCR引物在制备定量检测乙型肝炎病毒RNA的试剂盒中的用途。

6.一种采用如权利要求1所述的定量PCR引物或采用如权利要求2或3所述的试剂盒从乙型肝炎病毒总核酸中选择性扩增RNA的方法。

7.一种采用如权利要求2或3所述的试剂盒定量检测乙型肝炎病毒RNA的方法。

8.如权利要求4或5所述的用途或者如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒的基因型为中国流行株B或C基因型。