CN107022651A

CN107022651A - 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN107022651A
Application number: CN201710407670.9A
Authority: CN
Inventors: 王绍成; 康伟; 马南; 赵�卓; 李淑君; 李萍; 苏加忱; 张绍峰; 吕志
Original assignee: Liaoning Base Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Liaoning Base Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2017-08-08
Anticipated expiration: 2037-06-02
Also published as: CN107022651B

Abstract

本发明公开了一种快速一步法检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，包括核酸提取液、RT‑qPCR反应液、阴性对照、阳性对照、阳性参考品。本发明主要解决了目前市场上已有试剂盒的核酸检测用时较长的缺点。本发明是在常规RT‑qPCR基本反应原理基础上，通过对反应缓冲液成分的改变和引物、探针的独特设计、合成来实现在较低温度下核酸变性，进而缩短PCR时变性和复性温度差值，结果大大缩短整个反应时间。本发明所述试剂盒具有较高的检测灵敏度、特异性和重复性，可以检出丙型肝炎病毒常见的六个基因型，同时，也适用常规定量PCR仪，为丙型肝炎病毒感染的辅助诊断和其感染者药物治疗监测提供了准确依据。

Description

一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物医学检测领域,具体涉及一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，直径为30～60纳米有包膜的球形病毒颗粒，其基因组为单股正链RNA，全基因组长约9.6kb。HCV的基因编码区可分为结构区与非结构区两部分，其非结构区易发生变异。根据HCV基因组异质性特征，可以将其分成6个基因型及90多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示丙型肝炎病毒的基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b、3a等)，在我国主要以1b和2a基因型为常见，其中1b型为主，某些地区有1a、2b和3b型报道。HCV主要经输血、针刺、吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。未来20年内与HCV感染相关的死亡率(肝衰竭及肝细胞癌导致的死亡)将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。所以，丙型肝炎的检测对临床诊断和治疗至关重要。

目前临床上常用的HCV检测方法主要有两类：血清学方法(EIA或RIA)测定HCV抗体或HCV编码蛋白和PCR法检测血清/血浆HCV核酸RNA。

血清学方法是基于检测人体对HCV产生的抗体或是HCV蛋白抗原，在病毒感染早期，即“窗口期”，人体内虽有病毒感染但还未产生抗体或者产生的抗体数量未达到抗体反应的最低检测限，此时，血清学抗体检测结果一般为阴性。同时，目前HCV病毒的分离尚不成功，目前所制备的抗原均为人工合成，其特异性方面仍然存在不足，在低危人群中发现大量的不确定结果，对于某些免疫球蛋白水平高的患者，也可能出现假阳性，而且该方法操作较为复杂，往往需要特定的仪器和操作人员以及相关的检测试剂，检测的周期较长，使得酶联免疫法在临床上应用具有一定的局限性，不能满足对于病毒感染“早发现，早诊断，早治疗”的需要。

基于聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术的核酸分子检测方法,其检测对象是病毒本身遗传物质(DNA或RNA)，以血清/血浆中病毒核酸的存在作为病毒感染和复制的直接标志物，大大缩短了病毒检出的“窗口期”，适用于病毒感染的早期诊断。目前，荧光定量PCR技术是目前市场上核酸检测主要方法，不仅可以对病毒进行定性检测，还可以进行定量分析，并且具有较高的灵敏度、特异性和准确性。

荧光定量PCR技术基本原理是基于DNA聚合酶的体外核酸指数扩增，应用荧光检测扩增的拷贝数。PCR过程主要分三步：第一步是核酸变性，即通过高温(如，95℃)使双链DNA解链，形成单链；第二步是核酸退火，即引物在较低温度下与单链DNA杂交；第三步是核酸延伸，即在DNA聚合酶作用下杂交的引物依赖模板延伸，产生新的复制链，反复经过多个循环产生大量原始模板拷贝数。具体说，一般反应过程是：在90～95℃变性10～30秒，45～60℃退火10～30秒，最后70～75℃延伸10～90秒，30～45个循环。

荧光定量PCR一般通过荧光分子来实时定量检测PCR产物量，荧光分子可以是DNA结合染料，如SYBR Green，或者是荧光标记引物或探针。最常用的DNA结合染料是SYBRGreen I，其易于结合双链DNA,而单链DNA则不易结合，一旦结合能够产生荧光，且荧光信号强度与双链DNA数量呈正比。但是，DNA结合染料的最大不足是缺乏检测特异性，即PCR非特异扩增产物也会产生荧光，另外，DNA结合染料也不适合多重PCR多个靶标同时检测。

相比于DNA结合染料，荧光标记引物或探针能够特异地检测靶标DNA的数量，常见包括水解探针(TaqMan)、分子信标探针(Molecular Beacons)、双杂交探针(DualHybridization Probes)和引物探针组合等。

最常见的荧光标记探针是水解探针(TaqMan)，一般在探针的5’端和3’端分别标记荧光基团和相应的淬灭基团，在探针链完整情况下，荧光基团和淬灭基团之间距离较近，荧光基团发出的荧光大部分被淬灭基团所吸收，故背景荧光较低，在PCR扩增过程中，水解探针与靶序列特异杂交，在引物延伸时，利用Taq DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性，降解杂交的水解探针，结果荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光，且荧光强度与扩增产物的数量呈正比。另外，应用水解探针同时还可以检测多个靶标或检测基因变异等。

荧光定量PCR检测虽然具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但其检测用时较长，如40循环，一般需要用时1.5～2.0小时，仔细分析，主要是需要多次高温和低温循环，且高温和低温的差值较大，一般为30～45℃，所以，一个循环下来，升降温所消耗时间就需要30～45秒(按照PCR仪平均升降温2℃计算)，这样如果40循环下来，升降温所消耗的时间约为20～30分钟，更重要的是，此时间内对核酸扩增数量的增加没有起到直接的贡献。一般引物或探针长度为16～25核苷酸，退火温度(Tm)一般在50～60℃，所以，为缩短扩增时间可考虑降低变性温度或提高仪器的升降温速度等。

目前市场上出现了一些快速的定量PCR检测方法，其中，罗氏公司Liat检测系统和Cephied公司的Xpress均主要是通过提高PCR仪的升降温速度来实现的，也就是说，必须依赖特定的荧光定量检测仪器才能完成快速检测，更进一步说，在常规的定量PCR仪上是很难实现其快速扩增的。另外，市场上也出现了利用等温(或恒温)扩增等方法来实现快速核酸扩增和检测的产品，其主要是通过去除了升降温所需时间来实现快速检测的，如，NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)、SDA(Strand-DisplacementAmplification)和LAMP(Loop Mediated Isothermal Amplification)等技术，虽然其扩增和检测速度可能会加快，但是所有这些也必须应用特定的检测仪器，并且检测通量很低。综上所述，现需要一种方法，能够利用现有的常规荧光定量PCR仪实现核酸快速扩增和检测，这样，可以充分利用现有设备，节省大量工作时间，提高每日的工作量，同时更有利于快速给出患者检测结果，有利于医生做出及时诊断和治疗，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够利用现有的常规荧光定量PCR仪实现快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒和检测方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：核酸提取液、RT-qPCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、阳性参考品，所述RT-qPCR反应液包括反应缓冲液、一对检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、一条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、一对检测人珠蛋白的特异性引物、一条检测人珠蛋白的特异性探针；

其中，反应缓冲液含有终浓度为1-5％促核酸变性的变性剂和终浓度是0.1-0.5mM化学修饰碱基试剂的缓冲液。

所述促核酸变性的变性剂为易于破坏双链DNA氢键的变性剂；进一步说是易于使核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，双链DNA易于变成单链DNA，使双链DNA在较低温度下解链变性；化学修饰碱基试剂为能够改变引物或探针的杂交动力学、并且能够改变合成的双链DNA稳定性的化学修饰碱基试剂。

所述促核酸变性的变性剂为强酸、强碱、一元醇、尿素、AgCl、DMSO、甜菜碱、甲酰胺中的一种或几种；所述化学修饰碱基试剂为5-硝基吲哚(5-Nitroindole)、脱氧肌苷(deoxyInosine)、2-氨基-脱氧腺苷(2-Amino-dA)、脱氧核糖核苷(super dNTPs)、锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)中的一种或几种。

所述缓冲液为以Tris-HCl缓冲液为基础获得；进一步说是200mM(PH8.0)Tris-HCl、500mMKCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。

所述酶混合液为热启动Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶和UNG酶等。

所述一对检测丙型肝炎病毒的特异引物：上游引物为具有SEQ ID NO.1(5’-ACTGCTAGCCGAGTAGTGTTG-3’)所示核苷酸序列的引物，下游引物为具有SEQ ID NO.2(5’-TCTACGAGACCTCCCGGGGCA-3’)所示核苷酸序列的引物；一条检测丙型肝炎病毒的特异探针：具有SEQ ID NO.3(5’-AGGCCTTGTGGTACTGCCTGA-3’)所示核苷酸序列；一对检测β-珠蛋白特异性引物：上游引物为具有SEQ ID NO.4(5’-CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTG-3’)所示核苷酸序列的引物，下游引物为具有SEQ ID NO.5(5’-CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCA-3’)所示核苷酸序列，一条检测β-珠蛋白特异探针，具有SEQ ID NO.6(5’-GTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGG-3’)所示核苷酸序列。

所述丙型肝炎病毒核酸提取试剂是由RNA提取溶液I、RNA提取溶液II和RNA提取溶液III组成；

RNA提取溶液I配方：异硫氰酸胍4～6g/L，乙二胺四乙酸二钠0.74～1.49g/L，曲拉通X-100 3～5％(v/v)，将所述各组分按比例称量后加入20mmol/L(pH7.0)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，终体积为20-50mL，另外，单独包装有200～800μg/mL的磁珠；

RNA提取溶液II配方：盐酸胍3～5g/L，异丙醇30～50％(v/v)，将所述各组分按比例称量后加入DEPC处理超纯水中，终体积为40-50mL；

RNA提取溶液III配方：量取无水乙醇35～40mL，加入DEPC处理超纯水中使终体积为50-100mL。

所述检测丙型肝炎病毒的特异探针5’端采用荧光基团标记，3’端采用相应的淬灭基团标记。

所述荧光基团为FAM、Yakima Yellow、ROX、CY5、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、HEX和JOE中的任意一种，淬灭基团为BHQ、TAMRA、DABCYL和MGB中的任意一种。

所述的阳性参考品为含有HCV靶序列的重组质粒，其浓度分别为:S1(1×10⁷IU/ml)，S2(1×10⁶IU/ml)，S3(1×10⁵IU/ml)，S4(1×10⁴IU/ml)，S5(1×10³IU/ml)，S6(1×10²IU/ml)，S7(2×10¹IU/ml)。

所述的阴性对照为市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆。

所述的阳性对照为含有HCV特异性扩增片段的假病毒颗粒，制备方法参考发明专利CN 106119415A。

一种快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒检测方法，利用所述试剂盒在进行RT-qPCR时，反应条件为：

本发明的有益技术效果是：

本发明提供了一款灵敏度高、假阴性率低、线性范围广、定量准确且精密度高的丙型肝炎病毒核酸快速检测试剂盒，更重要的是本发明提供了一种更快速、高效检测丙型肝炎病毒核酸的方法，可在常规定量PCR仪上较短时间内(约25分钟)完成其扩增和检测。同时本发明通过降低PCR循环中的变性温度，即缩小变性温度和退火温度的差值来实现在较短时间内完成核酸扩增和检测。具体说，可在PCR混合液中加入不同的变性剂和/或化学修饰的碱基掺入，使DNA双链在较低温度下不稳定，易于解链变性。并且，所述试剂盒成本低，操作简单，适用于临床不同实验室推广使用。

附图说明

图1是本发明所述的快速扩增和检测丙型肝炎病毒核酸反应原理示意图。

图2是实施例3所述的不同温度下，变性剂A对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

图3是实施例4所述的在80℃下，不同浓度变性剂A对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

图4是实施例5所述的不同变性温度下，化学修饰碱基试剂的掺入对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

图5是实施例6所述的在不同变性温度下，变性剂A和化学修饰碱基试剂共同对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

图6是实施例7中所述的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒中阳性标准品的扩增曲线。

图7是实施例7中所述的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒中定量分析的标准曲线图。

图8是实施例7中所述的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒中阳性样品重复性的扩增曲线。

图9是实施例7中所述的丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒阳性样品特异性的扩增曲线。

图10是实施例7中不同基因型丙型肝炎病毒阳性样品特异性的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合实例对本发明试剂盒进行解释说明，应理解以下的实例仅用于解释本发明而不是用于限制本发明。

实施例1、试剂盒的制备

本发明所述的应用一步法荧光定量RT－qPCR技术快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒，包括核酸提取液、RT－qPCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、阳性参考品。

1、依据不同基因型的丙型肝炎病毒基因组数据库序列信息，利用Clustal Omega软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)做多序列比对分析，寻找不同基因型的保守区域，设计用于特异检测丙型肝炎病毒核酸的引物序列和探针序列，并做BLST比对，最后人工合成上述所设计的引物和探针，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-ACTGCTAGCCGAGTAGTGTTG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5’-TCTACGAGACCTCCCGGGGCA-3’(SEQ ID NO.2)；

探针：5’-AGGCCTTGTGGTACTGCCTGA-3’(SEQ ID NO.3)。

2、同理，设计并合成检测人珠蛋白的特异引物和探针，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTG-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物：5’-CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCA-3’(SEQ ID NO.5)；

探针：5’-GTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGG-3’(SEQ ID NO.6)。

3、丙型肝炎病毒核酸标准品制备

①、WHO定量标准品：购买WHO定量标准品(NIBSC code：06/102)，按照说明书要求用0.5ml DEPC水将标准品复溶，得到260000IU/ml的样本，然后将该样本用市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆稀释至合适的浓度。

②、WHO不同基因型标准品：购买WHO丙型肝炎病毒基因型盘(NIBSC code：12/172)。采用WHO定量标准品进行定量，然后将该样本用市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆稀释至合适的浓度。

4、阴性对照品和阳性对照品的制备

阴性对照品制备：市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆，外观澄清。

阳性对照品制备：使用市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆对丙型肝炎假病毒颗粒样本进行稀释，使其浓度在50IU/ml～1000IU/ml(采用WHO定量标准品进行定量)。

5、阳性参考品制备：为含有HCV靶序列的重组质粒，用市售的丙型肝炎病毒核酸阴性标准血浆做10倍梯度稀释(采用WHO定量标准品进行定量)，其浓度分别为:S1(1×10⁷IU/ml)，S2(1×10⁶IU/ml)，S3(1×10⁵IU/ml)，S4(1×10⁴IU/ml)，S5(1×10³IU/ml)，S6(1×10²IU/ml)，S7(2×10¹IU/ml)。

6、丙型肝炎病毒核酸样本RNA提取和纯化

所述丙型肝炎病毒核酸提取试剂由RNA提取溶液I、RNA提取溶液II和RNA提取溶液III组成。

RNA提取溶液I配方：异硫氰酸胍5g/L，乙二胺四乙酸二钠1g/L，曲拉通X-100 4％(v/v)，将所述各组分按比例称量后加入20mmol/L(pH7.0)的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，终体积为20mL，另外，单独包装有400μg/mL的磁珠。

RNA提取溶液II配方：盐酸胍4g/L，异丙醇40％(v/v)，将所述上述各组分按比例称量后加入DEPC处理超纯水中，终体积为40mL。

RNA提取溶液III配方：量取无水乙醇40mL，加入DEPC处理超纯水中使终体积为50mL。

7、丙型肝炎病毒核酸检测用RT-qPCR反应液

包括10×RT-PCR缓冲液、引物对、探针，根据下述表1配置RT-PCR反应液

表1

试剂名称	1个测试(μL)	终浓度
			10×RT-PCR缓冲液	5	1×
HCV上游引物(10μM)	2.5	0.5μM
			HCV下游引物(10μM)	2.5	0.5μM
HCV探针(10μM)	1.25	0.25μM
			β-珠球蛋白上游引物(10μM)	2.5	0.5μM
β-珠球蛋白下游引物(10μM)	2.5	0.5μM
			β-珠球蛋白探针(10μM)	1.25	0.25μM
酶混合液	5	---
			DEPC水	2.5	---

上表中10×RT-PCR缓冲液包括：200mMTris-HCl(PH8.0)、500mMKCl、0.8％(v/v)NP-40、变性剂A(甲酰胺)50％(v/v)和化学修饰碱基试剂(脱氧肌苷(deoxyInosine)。酶混合液为热启动Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶和UNG酶，浓度分别为5U/μL、200U/μL和1U/μL。

上述成分配制完成后，按25μl/管分装到PCR反应管中，并加入25μl提取纯化好的样本。采用的荧光定量PCR仪为Stratagene Mx3005p，扩增检测程序为：

实施例2、试剂盒的使用

1、样本的处理：待检测血液1500g离心20分钟，弃去下部的血细胞，将上部黄色的液体移到新的保存管里，-20℃保存备用。

2、HCV RNA提取

1)分别取200μl上述样本、阳性对照、阴性对照及阳性参考品至1.5ml离心管中，做好标记。

2)向离心管中加入50μl蛋白酶K和20μl磁微球。

3)向离心管中各加入400μl RNA提取液I，室温震荡孵育5分钟。

4)将离心管放置于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。

5)将离心管从磁力架上取下，加入600μl RNA提取液II，振荡混匀30秒。

6)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

7)重复步骤5和6一次

8)将离心管从磁力架上取下，加入800μl RNA提取液III，振荡混匀30秒。

9)将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。

10)重复步骤8和9一次。

11)将离心管从磁力架上取下，加入100μl洗脱液(TE缓冲液)，小心混匀后70℃孵育3分钟，将离心管放置于磁力架上静置1分钟，磁珠完全吸附后，小心转移上清于一新的离心管中，做好标记。

将上述获得样品通过实施例1记载的试剂盒进行检测，结果判定如下：

同时，上述试剂盒中变性剂可由强酸(如，盐酸、硫酸、硝酸等)、强碱(如，氢氧化钠、氢氧化钾等)、一元醇(如，甲醇、乙醇)、尿素、AgCl、DMSO、甜菜碱进行替换，通过加热、极端pH的改变、有机试剂的诱导，能够使双链DNA氢键断裂，即核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，双链DNA易于变成单链DNA，进而可促使双链DNA在较低温度下解链变性。

同时，化学修饰碱基试剂可由5-硝基吲哚(5-Nitroindole)、脱氧肌苷(deoxyInosine)、2-氨基-脱氧腺苷(2-Amino-dA)、锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)替换，可通过改变或增加、减少碱基基团的化学组成来增强或减弱碱基对的氢键键能，进而改变引物或探针的杂交动力学，同时合成的双链DNA的稳定性也发生改变。

两者的结合来实现在较低温度下核酸变性，进而缩短PCR时变性和复性温度差值，结果大大缩短整个反应时间，同时仍保证试剂盒具有较高的检测灵敏度、特异性和重复性，可以检出丙型肝炎病毒常见的六个基因型，也适用于常规定量PCR仪。

下述仅以变性剂A为甲酰胺，化学修饰碱基B试剂为脱氧肌苷为例阐述本发明试剂盒具有相应的特性，实现意想不到的效果，具体为：

实施例3、不同温度下，变性剂A(5％)对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响

按照上述试剂盒的使用方法，以丙型肝炎病毒核酸阳性标本(1000IU/ml)为模板，提取核酸RNA，RT-PCR扩增，荧光定量PCR反应程序设定时只是在第3部分(快速部分)改变变性温度，分别为：95℃(泳道2)、90℃(泳道3)、85℃(泳道4)、80℃(泳道5)和75℃(泳道6)，将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离、染色(EB)，结果如图2所示。从图中可清楚看出：变性剂A(5％)的加入可以使变性温度下降，其中，在85～95℃范围内能够很好扩增，没有明显差别，而在80℃时，虽然能够扩增，但产量明显下降，在75℃时未见有扩增产物，说明单独变性剂A的加入最低变性温度不能低于80℃，而在不加入变性剂A下，常规PCR在80℃时是没有扩增产物的(结果未给出)。

实施例4、在80℃下，不同浓度变性剂A对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响

按照上述试剂盒的使用方法，以丙型肝炎病毒核酸阳性标本(1000IU/ml)为模板，提取核酸RNA，RT-PCR扩增，配制RT-PCR反应液时改变变性剂A的浓度，分别为：0％(泳道2)、1％(泳道3)、2.5％(泳道4)、5％(泳道5)、7.5％(泳道6)和10％(泳道7)，荧光定量PCR反应程序设定时，在第3部分(快速部分)变性温度设为80℃，其余不变。将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离、染色(EB)，结果如图3所示。从图中可清楚看出：在80℃下，不同浓度的变性剂A对丙型肝炎病毒核酸扩增效率有明显影响，其中，在不加入变性剂A时是没有扩增产物的，进一步说明实施例三中变性剂A(5％)加入的确可以使变性温度下降；随变性剂A浓度的改变，PCR扩增产物量不同，其中，在浓度为5％时扩增产物量最高，即最适变性剂A浓度为5％，提高浓度，产物量反而下降，可能是较高的变性剂A使酶活性下降所致。

实施例5、不同温度下，化学修饰碱基B的掺入对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

按照上述试剂盒的使用方法，以丙型肝炎病毒核酸阳性标本(1000IU/ml)为模板，提取核酸RNA，RT-PCR扩增，配制RT-PCR反应液时加入一种化学修饰碱基B，使其在扩增时掺入到新合成链中。荧光定量PCR反应程序设定时只是在第3部分(快速部分)改变变性温度，分别为：95℃(泳道2)、85℃(泳道3)、80℃(泳道4)、75℃(泳道5)和70℃(泳道6)，将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离、染色(EB)，结果如图4所示。从图中可清楚看出：化学修饰碱基B的加入可以使变性温度下降，其中，在75～95℃范围内能够很好扩增，没有明显差别，而在70℃时未见有扩增产物，说明单独化学修饰碱基B的加入最低变性温度不能低于75℃。

实施例6、在不同变性温度下，变性剂A和化学修饰碱基B的同时加入对丙型肝炎病毒核酸扩增效率的影响。

按照上述试剂盒的使用方法，以丙型肝炎病毒核酸阳性标本(1000IU/ml)为模板，提取核酸RNA，RT-PCR扩增，配制RT-PCR反应液时加入变性剂A和化学修饰碱基B，荧光定量PCR反应程序设定时只是在第3部分(快速部分)改变变性温度，分别为：80℃(泳道2)、75℃(泳道3)、72℃(泳道4)、70℃(泳道5)、65℃(泳道6)和60℃(泳道7)，将扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离、染色(EB)，结果如图5所示。从图中可清楚看出：变性剂A和化学修饰碱基B的同时加入可以使变性温度继续下降，其中，在72～80℃范围内能够很好扩增，没有明显差别，而在70℃时，虽然能够扩增，但产量明显下降，在65℃时有很少量扩增产物，在60℃时无扩增产物，说明变性剂A和化学修饰碱基B的同时加入最低变性温度不能低于72℃。

实施例7、本发明试剂盒的性能分析

1、本发明所述的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的最低检出限。

将WHO定量标准品(NIBSC code：06/102)用阴性血浆稀释到50、20、10IU/ml。采用本试剂盒所提供的RNA提取试剂对丙型肝炎病毒核酸的提取纯化，并使用实施例六试剂盒进行扩增检测，每个浓度的样本重复检测25次。计算各浓度下样本的检出率，从而确定最低检出限(按照最低检出限的定义，将检出率≥95％的最低浓度定为最低检出限)，结果如表2所示。由结果可知，20IU/ml样本的检出率可达到100％，10IU/ml样本的检出率可达到92％，说明本发明试剂盒的最低检出限为20IU/ml。

表2

2、本发明所述的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的线性范围

取经过WHO定量标准品标定的丙型肝炎假病毒颗粒，用阴性血浆对其进行梯度稀释，浓度分别为：1×10⁷IU/ml、1×10⁶IU/ml、1×10⁵IU/ml、1×10⁴IU/ml、1×10³IU/ml、1×10²IU/ml、2×10¹IU/ml。采用实施例六试剂盒所提供的RNA提取试剂对丙型肝炎病毒核酸提取纯化，并使用本发明试剂盒进行扩增检测，每个浓度作3个重复，且三个重复样本间的对数值的CV不高于10％，则此浓度样本的准确度符合要求，可用于线性范围分析。然后以符合要求的样本浓度标示值的对数值和Ct值，以浓度为X轴，Ct值为Y轴，进行线性拟合，计算其线性相关系数r，若|r|≥0.980，则该系列浓度处于本试剂盒的线性范围之内。检测数据结果如表3所示。

表3

表3中可知，当样本浓度为10IU/ml时，其检测结果不符合准确度要求(CV％>10)，故其不纳入线性范围之内。将20IU/ml～1×10⁸IU/ml各浓度的数据进行拟合，结果如图6、7、8所示。结果显示，R2＝0.999。因此，得到本试剂盒的线性范围为20IU/ml～1×10⁸IU/ml。

3、本发明所述的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒的特异性和重复性

本实例利用上述试剂盒对艾滋病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、流感病毒、腮腺炎、脊髓灰质炎等进行检测，结果显示，本发明试剂盒只能特异性扩增丙型肝炎病毒，结果如表4和图9。

表4

病种	检测例数	检出例数	检出率(％)
				HCV	45	45	100
HIV	20	20	0
				HBV	43	43	0
流感病毒	35	35	0
				腮腺炎	20	20	0
脊髓灰质炎	25	25	0

4、本发明所述的用于检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒对不同基因型的覆盖

将WHO的丙型肝炎病毒基因型盘(NIBSC code：12/172)中的不同基因型样本，采用WHO定量标准品定量。用HCV RNA阴性的血浆将各样本稀释至20IU/ml，采用实施例六试剂盒所提供的RNA提取试剂对丙型肝炎病毒核酸提取和纯化，并使用本发明试剂盒进行扩增和检测，每个浓度作25个重复。计算每个基因型的检出率。结果如表5和图10所示。从结果中可以看出，本发明试剂盒对1a、2a、3a、1b、2b、和3b基因型样本的检出率均在95％以上，说明本发明试剂盒对1～6基因型均能检出，且检测限均为20IU/ml。

表5

由上述各实施例说明：本发明提供了一种高灵敏度、高特异性的用于检测丙型肝炎病毒核酸试剂盒和高效、快速检测丙型肝炎病毒核酸的方法。本发明采用RT-qPCR一步法对丙型肝炎病毒核酸进行检测，既减少了操作步骤也缩短了操作时间，且RT-PCR反应体系中采用了UNG酶去除可能存在的污染产物，这样可以避免假阳性结果产生，也使检测结果更为准确。本发明中还设计了内标，内标参与样本检测的整个过程，避免了假阴性结果的发生。本领域的技术人员应该明白，本文所述发明除明确阐述的内容外，还容许变化和修改，特别是等同的变化和修改。应该理解，所有这样的变化和修改均落入本发明。

SEQUENCE LISTING

<110> 辽宁润基生物科技有限公司

<120> 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 1

actgctagcc gagtagtgtt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 2

tctacgagac ctcccggggc a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 3

aggccttgtg gtactgcctg a 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 4

ctgttatggg caaccctaag gtg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 5

cttgaggttg tccaggtgag cca 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> gene

<222> (1)..(23)

<223>

<400> 6

gtgctcggtg cctttagtga tgg 23

Claims

1.一种快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：核酸提取液、RT-qPCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照、阳性参考品，其特征在于：所述RT-qPCR反应液包括反应缓冲液、一对检测丙型肝炎病毒核酸的特异引物、一条检测丙型肝炎病毒核酸的特异性探针、一对检测珠蛋白的特异性引物、一条检测珠蛋白的特异性探针，其中，反应缓冲液含有终浓度为1-5％促核酸变性的变性剂和终浓度为0.1-0.5mM化学修饰碱基试剂的缓冲液。

2.按权利要求1所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述促核酸变性的变性剂为易于破坏双链DNA氢键的变性剂；化学修饰碱基试剂为能够改变引物或探针的杂交动力学、并且能够改变合成的双链DNA稳定性的化学修饰碱基试剂。

3.按权利要求1或2所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述促核酸变性的变性剂为强酸、强碱、一元醇、尿素、AgCl、DMSO、甜菜碱、甲酰胺中的一种或几种；所述化学修饰碱基试剂为5-硝基吲哚(5-Nitroindole)、脱氧肌苷(deoxyInosine)、2-氨基-脱氧腺苷(2-Amino-dA)、脱氧核糖核苷(super dNTPs)、锁定核酸(LNA)或肽核酸(PNA)中的一种或几种。

4.按权利要求1所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为200mM(PH8.0)Tris-HCl、500mMKCl、0.8％(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。

5.按权利要求1所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述一对检测丙型肝炎病毒的特异引物：上游引物为具有SEQ ID NO.1(5’-ACTGCTAGCCGAGTAGTGTTG-3’)所示核苷酸序列的引物，下游引物为具有SEQ ID NO.2(5’-TCTACGAGACCTCCCGGGGCA-3’)所示核苷酸序列的引物，一条检测丙型肝炎病毒的特异探针，具有SEQ ID NO.3(5’-AGGCCTTGTGGTACTGCCTGA-3’)所示核苷酸序列；一对检测珠蛋白的特异性引物：上游引物为具有SEQ ID NO.4(5’-CTGTTATGGGCAACCCTAAGGTG-3’)所示核苷酸序列的引物，下游引物为具有SEQ ID NO.5(5’-CTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCA-3’)所示核苷酸序列，一条检测珠蛋白的特异探针，具有SEQ ID NO.6(5’-GTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGG-3’)所示核苷酸序列。

6.按权利要求1所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述丙型肝炎病毒核酸提取试剂是由RNA提取溶液I、RNA提取溶液II和RNA提取溶液III组成；

7.按权利要求5所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述检测丙型肝炎病毒的特异探针5’端采用荧光基团标记，3’端采用相应的淬灭基团标记。

8.按权利要求7所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为FAM、Yakima Yellow、ROX、CY5、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET、HEX和JOE中的任意一种，淬灭基团为BHQ、TAMRA、DABCYL和MGB中的任意一种。

9.按权利要求1所述的快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒，其特征在于：所述的阳性参考品为含有HCV靶序列的重组质粒，其浓度分别为:S1(1×10⁷IU/ml)，S2(1×10⁶IU/ml)，S3(1×10⁵IU/ml)，S4(1×10⁴IU/ml)，S5(1×10³IU/ml)，S6(1×10²IU/ml)，S7(2×10¹IU/ml)。

10.一种权利要求1所述快速检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸的试剂盒检测方法，其特征在于：利用所述试剂盒在进行RT-qPCR，反应条件为：