CN110804652B - 一种快速检测dna的实时定量pcr的添加剂、试剂盒及反应方法 - Google Patents

一种快速检测dna的实时定量pcr的添加剂、试剂盒及反应方法 Download PDF

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Abstract

本申请基因检测领域，公开了一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。本发明所述添加剂由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween‑20、海藻糖组成，可以有效降低引物探针Tm值。本发明所述快速检测DNA的实时定量PCR，其反应体系含有所述的添加剂，引物Tm值在65‑70℃之间，探针Tm值在75‑85℃之间，反应程序为92‑95℃×1min‑3min；80‑85℃×5s‑15s，65‑75℃×10s‑22s，35‑45循环。通过优化PCR反应体系中引物探针Tm值和添加剂组分，减少PCR反应步骤，同时降低PCR不同步骤之间温度差，缩短PCR扩增时间，使PCR反应更加快速高效。

Description

一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应 方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。1983年，美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。PCR的原理是利用DNA在体外95℃高温时变性成为单链，低温(退火)(通常为55-60℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向以dNTP为原料合成互补链。
运用PCR技术在体外能将指定基因以及DNA序列迅速扩增，最先应用此技术是基因克隆以及检测转基因，随着人们对食物微生物遗传性质的不断了解，进一步明确大部分致病菌的遗传条件，PCR技术也逐渐应用在食品检测中。PCR检测技术在食品检测中的应用主要包括食品中成分种类的检测、食品中有效成分的检测、转基因食品的鉴定和食源性致病菌的检测。PCR检测技术可以用于水体微生物的检测。近几年来，人们广泛关注病原微生物，由此，PCR技术也逐渐应用于水体微生物的检测，尤其是对生活水的微生物检测。PCR检测技术还可以用于食品样品中致病菌的检测。
传统的PCR扩增模式主要有两种程序：(1)三段式。设置三个温度点，依次进行变性(95℃，20-30s)退火(50-60℃，30-50s)、延伸(72℃，1-2min)三个过程，三个温度间温差大，在经过多个循环此种模式的升降温过程中耗时长。(2)两段式。设置两个温度点，依次进行变性(95℃，20-30s)、退火+延伸(60-65℃，1-2min)两个过程，这两种PCR扩增模式由于不同步骤间温差大，在经过多个循环此种模式的扩增升降温过程中耗时长，完成整个PCR扩增普遍用时90min-120min。如果仅仅合成35～100bp左右的序列，引物退火温度的要求范围可以高于或者低于理论温度5～10℃，在保证特异性的前体下，合并退火与延伸温度，用两段式PCR可比用严格三温度转换更能提高反应速度。
实时定量PCR技术(Real-time RT-PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。实时荧光PCR反应具有检测方法灵敏度高、特异性强的优点，在体外诊断和食品检测中应用越来越广泛。但该方法在实际使用中出现工作效率不高，通常流程为反复升降温的PCR过程，反应时间通常需要1～2小时，耗时长，难以满足大批量快速检测的需求。因此，亟需一种快速的PCR扩增检测方法满足市场需求。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速检测DNA的PCR反应方法，实现高效、快速检测DNA的目的。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种实时定量PCR的添加剂，由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖组成；所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的浓度比为(1.25v/v％-6.25v/v％)：(0.002g/ml-0.113g/ml)：(1.25v/v％-3.75v/v％)：(8.786g/ml-25.597g/ml)：(0.015v/v％-0.09v/v％)：(20.538g/ml-77.18g/ml)。
在一些实施方案中，所述添加剂中当二甲基亚砜、甘油、Tween-20浓度为100％，甲酰胺、甜菜碱、海藻糖浓度为5M时，所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的体积比为(1.25-6.25)：(1-5)：(1.25-3.75)：(1.5-4.37)：(0.0015-0.009)：(1.2-4.5)。
本发明所述添加剂可以有效的降低引物、探针Tm值。本领域技术人员可以理解本发明所述添加剂中所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的体积比为(1.25-6.25)：(1-5)：(1.25-3.75)：(1.5-4.37)：(0.0015-0.009)：(1.2-4.5)是在二甲基亚砜、甘油、Tween-20浓度为100％，甲酰胺、甜菜碱、海藻糖浓度为5M时的体积比。当二甲基亚砜、甘油、Tween-20、甲酰胺、甜菜碱、海藻糖浓度发生变化时，本领域技术根据各组分的浓度对各组分的比例进行适当的调整，都属于本发明保护的范围。
在本发明一些实施方案中，所述添加剂由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖组成，二甲基亚砜、甘油、Tween-20浓度为100％，甲酰胺、甜菜碱、海藻糖浓度为5M，所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的体积比为1.25：1：1.25：1.5：0.0015：1.2。
在本发明一些实施方案中，所述添加剂由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖组成，二甲基亚砜、甘油、Tween-20浓度为100％，甲酰胺、甜菜碱、海藻糖浓度为5M，所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的体积比为6.25：5：3.75：4.37：0.009：4.5。
本发明还提供了一种实时定量PCR的试剂盒，包含上述的添加剂。
在本发明中，所述的试剂盒还包括MLV酶、Taq酶、MgCl2、dNTPs、Tricine缓冲液中的至少一种。
在本发明中，所述的试剂盒还包括DNA的扩增的引物组及探针。本领域技术人员可以根据待测DNA样品的具体序列设计其相应的引物组序列及探针序列。
在本发明中，所述的试剂盒中的引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间以达到降低PCR反应过程中不同扩增步骤之间温度差，缩短PCR扩增时间的目的。
本发明还提供了所述的添加剂和所述的试剂盒在快速检测DNA的实时定量PCR中的应用。
在本发明所述应用中，所述快速检测DNA的实时定量PCR的引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间。
在本发明所述应用中，所述快速检测DNA的实时定量PCR的反应程序为92-95℃×1min-3min；80-85℃×5s-15s，65-75℃×10s-22s，35-45循环。
在本发明所述应用中，所述快速检测DNA的实时定量PCR的反应体系中含有上述的添加剂。
在本发明所述应用中，所述添加剂中各成分占所述反应体系体积比分别为：1.25％-6.25％二甲基亚砜、1％-5％甲酰胺、1.25％-3.75％甘油、1.5％-4.37％甜菜碱、0.015‰-0.09‰Tween-20、1.2％-4.5％海藻糖。
在本发明一些实施方案中，所述添加剂中各成分占所述反应体系体积比分别为：1.25％二甲基亚砜、1％甲酰胺、1.25％甘油、1.5％甜菜碱、0.015‰Tween-20、1.2％海藻糖。
在本发明一些实施方案中，所述添加剂中各成分占所述反应体系体积比分别为：6.25％二甲基亚砜、5％甲酰胺、3.75％甘油、4.37％甜菜碱、0.09‰Tween-20、4.5％海藻糖。
本发明还提供了一种快速检测DNA的实时定量PCR，其反应体系含有所述的添加剂，引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间，反应程序为92-95℃×1min-3min；80-85℃×5s-15s，65-75℃×10s-22s，35-45循环。
在传统荧光定量PCR中引物Tm值通常为58-60℃，探针Tm值通常为68-70℃。本发明所述快速检测DNA的实时定量PCR采用两段式反应程序减少了PCR反应步骤，同时通过提高引物探针Tm值和添加降低引物探针Tm值的添加剂等手段降低各个反应阶段的之间的温度差，达到快速进行PCR扩增的目的，一般在40min之内完成DNA的快速检测。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。本发明所述添加剂由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖组成，可以有效降低引物探针Tm值。本发明所述试剂盒包含所述添加剂，还可以包括扩增引物组、探针以及PCR反应的酶反应缓冲液等成分。本发明所述快速检测DNA的实时定量PCR，其反应体系含有所述的添加剂，引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间，反应程序为92-95℃×1min-3min；80-85℃×5s-15s，65-75℃×10s-22s，35-45循环。本发明通过优化PCR反应体系中引物探针Tm值和添加剂组分种类，减少PCR反应步骤，同时降低PCR反应过程中不同扩增步骤之间温度差，缩短PCR扩增时间，使PCR反应更加快速高效，满足市场大批量快速检测DNA样本的需求，广泛适用于体外诊断及食品检测领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1不同浓度mecA核酸样本快速扩增核酸检测结果图，其中图中1为作为模板的核酸样本浓度为1.56×10ng/μL、2为作为模板的核酸样本浓度为1.56ng/μL、3为作为模板的核酸样本浓度为1.56×10-1ng/μL、4为作为模板的核酸样本浓度为1.56×10- 2ng/μL；
图2示实施例2所述快速PCR扩增体系检测结果；
图3示实施例1普通PCR扩增体系检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种快速检测DNA的实时定量PCR的添加剂、试剂盒及反应方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中金黄色葡萄球菌耐药菌株ATCC29213购自瑞典Orebroll中心医院微生物实验室。荧光定量PCR仪(美国安捷伦科技公司，MX300P)；核酸蛋白测定仪(美国热电公司，Nanodrop1000Thermal)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司，3-18K)。血液、细胞和动物组织的基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，引物和探针合成、人工全基因合成、DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
实施例1、快速扩增DNA方法体系构建及检测
1、样品制备与DNA提取
取金黄色葡萄球菌耐药菌株ATCC29213样本，按照DNA提取试剂盒说明书操作提取核酸，核酸溶解于100μL Tris-EDTA缓冲液中，测定于260nm和280nm处的吸光度值，并计算核酸的浓度为156ng/μL，将提取核酸原液10倍梯度稀释6个浓度，依次为1.56×10ng/μL、1.56ng/μL、1.56×10-1ng/μL、1.56×10-2ng/μL、1.56×10-3ng/μL、1.56×10-4ng/μL。分别取5μL作为检测体系中核酸的模板。
2、引物和探针设计
根据Genbank中已发表的人的金黄色葡萄球菌耐药菌株mecA基因(登录号为CP033505.1)，利用Primer Express 3.0(ABI)软件设计引物和Taqman探针，使用荧光基团HEX作为探针的发光基团，BQ1作为淬灭基团。引物与探针序列见表1。
表1荧光定量PCR引物与探针序列
3、PCR扩增体系构建和反应程序
添加剂组分及含量：1.25％二甲基亚砜、1％甲酰胺、1.25％甘油、1.5％甜菜碱、0.015‰Tween-20、1.2％海藻糖。按下表2配比构建PCR扩增体系。
表2 PCR扩增体系构建
扩增检测程序为：92℃×1min；80℃×5s，65℃×10s，40循环。选择HEX荧光通道检测人mecA基因。反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：
1)当HEX通道CT值≤35(一般为15-30)时，可报告检测结果为阳性。
2)当HEX通道CT值显示No Ct时，可报告mecA基因检测为阴性。
4、结果分析
将提取核酸原液10倍梯度稀释6个浓度，取5μL作为检测体系中核酸的模板，进行检测结果显示10倍梯度稀释的6个浓度的模板在第四个梯度及以前的梯度可检测，在梯度5和6中不能检出，表明该体系能检测mecA基因中0.0156ng/μL的模板量(图1)。
实施例2、快速扩增DNA方法与普通PCR方法的结果比较(终点法)。
1、样品制备与DNA提取
取金黄色葡萄球菌耐药菌株ATCC29213样本，按照DNA提取试剂盒试剂盒说明书操作提取核酸，核酸溶解于100μL Tris-EDTA缓冲液中，测定于260nm和280nm处的吸光度值，并计算核酸浓度的浓度为189ng/μL，取5μL核酸提取物作为检测体系中核酸的模板。
2、引物和探针设计
根据Genbank中已发表的人的金黄色葡萄球菌耐药菌株mecA基因(登录号为CP033505.1)，利用Primer Express 3.0(ABI)软件设计引物和Taqman探针，使用荧光基团HEX作为探针的发光基团，BQ1作为淬灭基团。引物与探针序列见表3。
表3荧光定量PCR引物与探针序列
3、PCR扩增体系构建和反应程序
添加剂组分及含量：6.25％二甲基亚砜、5％甲酰胺、3.75％甘油、4.37％甜菜碱、0.09‰Tween-20、4.5％海藻糖。按下表4和表5配比构建快速PCR扩增体系和普通PCR扩增体系。
表4快速PCR扩增体系构建
组分 每个反应体系中的体积
Tricine缓冲液(1M) 3μl
dNTPs(10mM) 2μl
MLV酶(200μ/μl) 0.1μl
Taq酶(5μ/μl) 0.5μl
MgCl2(50mM) 1.5μl
mecA正向引物(50μM) 0.8μl
mecA反向引物(50μM) 0.8μl
mecA正向探针(50μM) 0.4μl
核酸模板 5μl
二甲基亚砜(100％) 3.125μl
甲酰胺(5M) 2.5μl
甘油(100％) 1.875μl
甜菜碱(5M) 2.185μl
Tween-20(100％) 0.225μl
海藻糖(5M) 2.25μl
灭菌纯化水 补足至50μl
扩增检测程序为：95℃×3min；85℃×15s，75℃×22s，40循环，检测时间为37min。
表5普通PCR扩增体系构建
组分 每个反应体系中的体积
Tricine缓冲液(1M) 3μl
dNTPs(10mM) 2μl
MLV酶(200μ/μl) 0.1μl
Taq酶(5μ/μl) 0.5μl
MgCl2(50mM) 1.5μl
mecA正向引物(50μM) 0.8μl
mecA反向引物(50μM) 0.8μl
mecA正向探针(50μM) 0.4μl
核酸模板 5μl
灭菌纯化水 补足至50μl
扩增检测程序为：95℃×2min；95℃×10s，56℃×15s，60℃×20s，40循环，检测时间为93min。
4、结果分析
快速PCR扩增体系结果如图2，普通PCR扩增体系结果如图3。
结果显示本发明快速PCR扩增体系Ct值比普通PCR扩增体系提前2.5个值，其中快速PCR扩增体系扩增时间为37min，普通PCR扩增体系为93min，表明快速扩增体系在快速扩增程序下比普通PCR更加快速。

Claims (8)

1.一种实时定量PCR的添加剂，其特征在于，由二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖组成；二甲基亚砜浓度为100%、甘油、Tween-20浓度为100%，甲酰胺浓度为5M、甜菜碱浓度为5M、海藻糖浓度为5M，则所述二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、甜菜碱、Tween-20、海藻糖的体积比为1.25：1：1.25：1.5：0.0015：1.2。
2.一种实时定量PCR的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的添加剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括MLV酶、Taq酶、MgCl2、dNTPs、Tricine缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA的扩增引物组及探针。
5.权利要求1所述的添加剂、权利要求2-4任一项所述的试剂盒在快速检测DNA的实时定量PCR中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述快速检测DNA的实时定量PCR的引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述快速检测DNA的实时定量PCR的反应程序为92-95℃×1min-3min；80-85℃×5s-15s，65-75℃×10s-22s，35-45循环。
8.一种快速检测DNA的实时定量PCR，其特征在于，其反应体系含有权利要求1所述的添加剂，引物Tm值在65-70℃之间，探针Tm值在75-85℃之间，反应程序为92-95℃×1min-3min；80-85℃×5s-15s，65-75℃×10s-22s，35-45循环。
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