CN101506362B

CN101506362B - Ugt1a1基因扩增用引物对、含有其的ugt1a1基因扩增用试剂及其用途

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Publication number: CN101506362B
Application number: CN2007800303163A
Authority: CN
Inventors: 平井光春; 间岛智史
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-11-29
Also published as: CN102168140B; EP2463365B1; WO2008066136A1; KR20080101922A; CN102168140A; JP5307538B2; EP2071025A1; US20090208954A1; CN101506362A; KR101107911B1; CN102168141A; KR101153058B1; KR20110026025A; JPWO2008066136A1; EP2071025A4; EP2463365A1; US8357516B2; US9175272B2; CN102168141B; US20110281265A1

Abstract

提供用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因中含有检测目标部位的目标区域的引物对，该引物对可以特异性扩增前述区域。使用3对引物对，各个引物对分别包含含有序列号4或序列号81、序列号21和序列号42的碱基序列的正向引物、和含有序列号13或序列号91、序列号29和序列号48的碱基序列的反向引物。通过使用这种引物对，可以在同一反应液中，同时扩增UGT1A1基因的分别含有3种多态性(UGT1A1*6，UGT1A1*27，UGT1A1*28)发生部分的3个目标区域。

Description

UGT1A1基因扩增用引物对、含有其的UGT1A1基因扩增用试剂及其用途

技术领域

本发明涉及用于扩增UGT1A1基因的引物对，含有该引物对的UGT1A1基因扩增用试剂及其用途。

背景技术

已知葡糖醛酸转移酶(UDP-葡糖醛酸基转移酶：UGT)是一种已知的药物代谢酶，是一种催化将葡糖醛酸结合到药物、异物、作为内源性物质的胆红素、甾类激素、胆汁酸等上的反应的酶。已报道了UGT有被分类为UGT1家族和UGT2家族的多种同工酶。这些同工酶中，编码属于UGT1家族的UGT1A1的基因(UGT1A1基因)存在基因多态性，一般而言认为这与抗癌剂盐酸伊立替康(Irinotecan)的副作用的表现相关。具体而言，据报道，患者UGT1A1基因具有多态性时，通过UGT将具有高抗肿瘤活性的伊立替康水解物(SN-38)解毒的能力下降，因而发生白血球减少和腹泻等严重的副作用。与这种副作用相关的代表性的基因多态性已知有启动子区域的多态性UGT1A1*28，外显子1的多态性UGT1A1*6和UGT1A1*27。尤其是据报道：包括日本人在内的亚洲人中，由于除了最重要的多态性UGT1A1*28，还同时具有多态性UGT1A1*6和UGT1A1*27的至少一种，因而容易出现更强的副作用。另外，UGT1A1由于与生物体内的由葡糖醛酸产生的结合胆红素相关，因此其多态性也是吉伯综合症等体质性黄疸的成因。因此，研究UGT1A1基因的多个多态性对于预测抗癌剂所产生的副作用的程度，预测副作用的发生十分重要。

另一方面，作为在基因水平分析所有疾病的成因、个体间疾病易感性(容易患病性)、个体间药效差异等的方法，现在广泛使用点突变，即所谓单核苷酸多态性(SNP)的检测。作为点突变的一般的检测方法，可以列举(1)对于试样的目标DNA，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，分析其全基因序列的直接测序(Direct Sequencing)法，(2)对于试样的目标DNA，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增相当于检测对象序列的区域，用根据前述检测对象序列有无目标突变而切断作用不同的限制酶将其扩增产物切断，通过电泳进行分型的RFLP分析，(3)使用目标突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过扩增的有无来判断突变的ASP-PCR法等。

但是，这些方法例如由于必须纯化从试样中提取的DNA、电泳、限制酶处理等，因此麻烦又费钱。而且，进行PCR后，反应容器需要开封一次，因此就存在前述扩增产物混入下一个的反应体系中，分析精确度降低的担忧。而且，由于难以自动化，因此无法分析大量试样。而且，就前述(3)的ASP-PCR法而言，也存在特异性低的问题。

从这些问题出发，近年来，作为点突变的检测方法，分析由目标核酸与探针形成的双链核酸的融解温度(Tm：meltingtemperature)的方法正得到实际的应用。这种方法由于通过例如Tm分析或者前述双链的融解曲线的分析来进行，因此被称为融解曲线分析。其就是以下这种方法。即，首先，使用与含有检测目标的点突变的检测对象序列互补的探针，使检测试样的目标单链DNA与前述探针形成杂交体(双链DNA)。然后，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动来检测伴随温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，基于该检测结果确定Tm值，由此判断是否存在点突变。杂交产物的同源性高，则Tm值高，同源性低，则Tm值低。因此，预先求出含有点突变的检测对象序列和与之互补的探针的杂交产物的Tm值(评价基准值)，再测定检测试样的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)。如果前述测定值与评价基准值程度相同，则可以判断为匹配，即在目标DNA中存在点突变，如果测定值比评价基准值低，则可以评断为不匹配，即在目标DNA中不存在点突变。而且，通过该方法可以实现基因分析的自动化。

但是，对于这种利用Tm分析的检测方法而言，存在着在PCR中必须要特异性且高效地扩增含有检测目标部位的区域的问题。尤其是，由于UGT存在许多同工酶，编码这些酶的序列又极为类似，因此就有这样的担忧，即在PCR中连UGT1A1之外的同工酶的编码基因也被扩增。而且，这种连UGT1A1之外的同工酶的编码基因也被扩增的情况，也成为例如UGT1A1基因的特定多态性(UGT1A1*28，UGT1A1*6或UGT1A1*27)分析(非专利文献1)中，分析结果的可信度降低的原因。而且，这样一来，由于分析1个样本时伴随过多劳动力，因此存在着实际上不能实现大量分析试样的问题。

非专利文献：PMID：11156391 Cancer Res.2000 Dec 15；60(24)：6921-6。

发明内容

因此，本发明以提供用于通过基因扩增法特异性扩增UGT1A1基因的目标区域的引物对作为目的。

为了实现上述目的，本发明的引物对，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因的引物对，且含有选自以下引物对(1)～(3)所组成的组中的至少一种。

引物对(1)：

包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对

(F1)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2120位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基朝着5’方向直至第18～22个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端

和

与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中、以第2140位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着5’方向直至第18～34个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

中的至少一个

(R1)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2226位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基朝着3’方向直至第17～27个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第2226位的鸟嘌呤碱基(G)互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

和

与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2198位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着3’方向直至第22～39个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第2198位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

中的至少一个

引物对(2)：

包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对

(F2)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2622位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基朝着5’方向直至第15～27个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

(R2)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2687位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着3’方向直至第17～26个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第2687位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

引物对(3)：

包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对

(F3)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第1863位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着5’方向直至第17～31个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

(R3)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第1928位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着3’方向直至第16～20个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第1928位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

而且，本发明的基因扩增用试剂，其特征在于，其为一种用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因的试剂，含有前述本发明的UGT1A1基因扩增用引物对。

本发明的扩增产物的制备方法，其特征在于，其为一种通过基因扩增法制备UGT1A1基因扩增产物的方法，含有下述(I)步骤。

(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，在反应液中扩增前述UGT1A1基因的步骤

本发明的多态性分析方法，其特征在于，其为分析UGT1A1基因中的检测对象部位的多态性的方法，包括以下步骤(i)～(iv)。

(i)通过本发明的扩增产物的制备方法，在反应液中扩增UGT1A1基因中包含检测对象部位的区域的步骤

(ii)准备含有所述步骤(i)中的扩增产物和能与所述检测对象部位杂交的探针的反应液的步骤

(iii)改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物和所述探针的杂交产物显示融解状态的信号值的步骤

(iv)根据伴随温度变化的所述信号值的变动，决定所述检测对象部位的多态性的步骤

如果使用本发明的引物对，可以在反应液中特异性且高效率地扩增UGT1A1基因中的、含有检测目标多态性(UGT1A1*28，UGT1A1*6或UGT1A1*27)发生的部位的目标区域。因此，与前述以往的方法不同，可以降低麻烦和成本。而且，这样一来，由于可以特异性扩增UGT1A1基因中的、含有特定的多态性发生的检测对象部位的区域，因此通过使用与含有检测对象部位的检测对象序列互补的探针，可以使用前述反应液直接进行Tm分析，对前述多态性进行分型。而且，由于可以在一个反应液中扩增前述目标区域以及实现多态性分型，因此可以实现操作自动化。进而，如果使用本发明的引物对，即使是例如含有杂质的试样(例如，全血或口腔粘膜等)，由于可以省略前处理，因此可以更迅速且更简便地进行扩增反应。而且，使用本发明的引物对，由于可以以比以往更好的扩增效率进行扩增反应，因此可以缩短扩增反应。因此，通过本发明的引物对、含有它们的试剂以及使用这些物质的扩增产物的制备方法和多态性分析方法，可以迅速且简便地分析UGT1A1基因的多态性，因此可以认为其在医疗领域中非常有效。

附图说明

图1是表示本发明的实施例1中Tm分析的结果的图。

图2是表示本发明的前述实施例1中Tm分析的结果的图。

图3是表示本发明的前述实施例1中Tm分析的结果的图。

图4是表示本发明的实施例2中Tm分析的结果的图。

具体实施方式

<UGT1A1基因扩增用引物对>

本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，如前所述，其特征在于其含有选自前述引物对(1)～(3)所组成的组中的至少一种引物对。由于含有至少任意一种引物对，因此例如可以特异性扩增UGT1A1基因中特定的目标区域。

本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，例如可以只含有前述引物对(1)～(3)中的任意一种，也可以含有任意两种或引物对(1)～(3)全部。可以用引物对(1)特异性扩增的目标区域是UGT1A1基因中含有多态性UGT1A1*6发生的部位的区域，可以用引物对(2)特异性扩增的目标区域是UGT1A1基因中含有多态性UGT1A1*27发生的部位的区域，可以用引物对(3)特异性扩增的目标区域是UGT1A1基因中含有多态性UGT1A1*28发生的部位的区域，这将在后面叙述。

如前所述，已知UGT1A1基因的这3种多态性均为对药物代谢产生影响的多态性，因此不仅要重视研究任意1种，还要重视研究任意2种或所有3种多态性。但是，在以往的方法中，存在着1个反应体系中无法分析多个序列的问题。这被认为是因为：如前所述，由于UGT存在很多同工酶，因此PCR中连UGT1A1之外的同工酶的编码基因也被扩增。因此，为了研究UGT1A1基因的3种多态性(UGT1A1*28，UGT1A1*6或UGT1A1*27)中的2种或所有3种时，需要分别在各个反应体系中分别扩增含有多态性发生部位的区域，单独分析获得的产物。这样一来，以往的方法难以做到仅将UGT基因的UGT1A1基因作为模板且同时在UGT1A1基因中只特异性扩增分别含有前述多态性发生部位的2种或3种目标区域。而且，这样一来，由于即使分析1个样品也伴随过多劳动力，因此存在无法实现分析大量试样的问题。与之相对，如果使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，则即使在含有前述引物对(1)～(3)中的任意2种或所有3种时，也可以在同一反应液中同时且特异性地扩增各个目标区域。因此，与前述的现有方法不同，可以减少麻烦和成本。而且，这样一来，由于在同一反应液中特异性扩增2个或3个目标区域，因此通过使用例如与各个目标区域中的检测对象序列互补的探针，使用前述反应液直接进行Tm分析，则可以分别对前述2种或3种多态性进行分型。这样一来，由于可以在同一反应液中分析UGT1A1基因中的2种或3种多态性，因此本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，例如在含有引物对(1)～(3)任一种时当然优选，含有任意两种或所有三种也优选。使用这种UGT1A1基因扩增用引物对，1个目标区域自不必说，如果同时扩增2个或3个目标区域，则可以比以往更有效地进行UGT1A1基因的多态性分析。

而且，以下有时将正向引物称为F引物，将反向引物称为R引物。

前述引物对(1)，如前所述，是包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对。

和

与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2140位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着5’方向直至第18～34个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

中的至少一个

和

中的至少一个

序列号1所示的碱基序列是来源于人(Homo Sapiens)的UGT1家族的UGT1A1基因的全长序列，例如，登录于NCBI登录号No.AY603772。

前述引物对(1)是用于扩增序列号1的包含第2121位～2225位区域、第2141位～2197位区域、第2121位～2197位区域或者第2141位～2225位区域中的任意一个区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第2160位的碱基(序列号1中第2160位的碱基)存在对UGT1A1的功能产生影响的点突变(2160G，2160A)，这种多态性就是前述的UGT1A1*6。本发明中，该部位的多态性，在纯合子时，可以用2160G/G、2160A/A表示，在为杂合子时，可以用2160G/A来表示。以下，也将该引物对(1)称为“UGT1A1*6用引物对”。而且，在只分析UGT1A1*6的多态性时，可以只使用UGT1A1*6用引物对。

在本发明中，引物对(1)的F1引物和R1引物，只要决定DNA聚合酶的扩增起始点的3’末端碱基满足前述条件即可。这样一来，通过固定各引物的3’末端的碱基，可以充分防止引物对(1)与例如类似的其它同工酶的基因(例如，UGT1A3基因，UGT1A4基因等)结合。

这样一来，由于F1引物和R1引物其3’末端的碱基被固定，各引物的长度自身没有特别的限制，可以适当调整到一般长度。作为引物长度的其中一例，例如在13～50mer的范围内，优选14～45mer，更优选15～40mer。作为具体的一例，前述F1引物优选如下：与含有序列号1的碱基序列中的、以第2120位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第18～22个碱基(优选第19～22个，更优选第19～21个碱基)的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，或者与序列号1的碱基序列中的、以第2140位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第18～34个碱基(优选第21～33个碱基，更优选第24～31个碱基)的区域序列相同的至少一种寡核苷酸。而且，前述R1引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第2226位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第17～27个碱基(优选第19～26个碱基，更优选第19～23个碱基)的区域互补的至少一种寡核苷酸；或者与序列号1的碱基序列中的、以第2198位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基朝着3’方向直至第22～39个碱基(优选第23～36个碱基，更优选第25～34个碱基)的区域互补的至少一种寡核苷酸。而且，由于F1引物和R1引物的3’末端分别被固定，由引物延伸的区域是例如，如前所述序列号1中第2121位～第2225位的区域，第2141位～第2197位的区域，第2121位～第2197位区域，或第2141位～第2225位的区域中的任意一个区域，获得的扩增产物的总长根据所使用的引物的长度而变化。

而且，R1引物也可以是不与序列号1所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸，F1引物也可以是不与前述碱基序列的互补链完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端碱基以外的部分中，可以与完全互补的寡核苷酸有1～5个碱基不同。

以下，列举F1引物和R1引物的具体例子，本发明不限于此。而且，这些F1引物和R1引物的组合没有任何限制，这其中，特别优选包括含有序列号4或序列号81的寡核苷酸的F1’引物、和含有序列号13或序列号91的寡核苷酸的R1’引物的引物对(1’)。而且，下表中的“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃)，是用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)，将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM，钠当量(Naeq.)50mM计算的值(以下相同)。前述Tm值，可以用例如以往公知的MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等计算，而且，还可以用临近法(Nearest Neighbor Method)测定(以下相同)。

表1

接着，前述引物对(2)，如前所述，是包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对。

(F2)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2622位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第15～27个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

(R2)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第2687位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第17～26个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第2687位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

前述引物对(2)是用于扩增序列号1的含有第2623位～2686位区域的DNA链及其互补链的引物对。已知该区域内的第2635位碱基(序列号1中第2635位的碱基)存在对UGT1A1的功能产生影响的点突变(2635C，2635A)，这种多态性就是前述的UGT1A1*27。本发明中，该部位的多态性，在纯合子时，可以用2635C/C、2635A/A表示，在为杂合子时，可以用2635C/A来表示。以下，也将该引物对(2)称为“UGT1A1*27用引物对”。而且，在只分析UGT1A1*27的多态性时，可以只使用UGT1A1*27用引物对。

出于与前述引物对(1)相同的理由，在本发明中，引物对(2)的F2引物和R2引物，只要决定DNA聚合酶的扩增起始点的3’末端的碱基满足前述条件即可。因此，F2引物和R2引物其长度自身没有特别的限制，可以列举与前述相同的长度。作为具体的例子，前述F2引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第2622位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第15～27个碱基(优选第16～27个，更优选第17～27个碱基)的区域序列相同的至少一种寡核苷酸。而且，前述R2引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第2687位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第17～26位碱基(优选第18～26个碱基，更优选第19～26个碱基)的区域互补的至少一种寡核苷酸。而且，由于F2引物和R2引物的3’末端被固定，由引物延伸的区域是例如如前所述的序列号1中第2623位～第2686位的区域，获得的扩增产物的总长根据所使用的引物的长度而变化。

而且，R2引物，也可以是不与序列号1所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸，F2引物也可以是不与前述碱基序列的互补链完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端碱基以外的部分中，可以与完全互补的寡核苷酸有1～5个碱基不同。

以下，列举F2引物和R2引物的具体例子，本发明不限于此。而且，这些F2引物和R2引物的组合没有任何限制，这其中，特别优选包括含有序列号21或序列号92的寡核苷酸的F2’引物、和含有序列号29或序列号98的寡核苷酸的R2’引物的引物对(2’)。

表2

其次，引物对(3)如前所述是包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一个引物对。

(F3)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第1863位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第17～31个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以所述胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

(R3)：与含有序列号1的碱基序列的UGT1A1基因中的、以第1928位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第16～20个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与所述第1928位的胞嘧啶碱基(C)互补的鸟嘌呤碱基(G)作为3’末端

前述引物对(3)是用于扩增序列号1的含有第1864位～1927位区域的DNA链及其互补链的引物对。已知序列号1的该区域内第1895位起的TATA盒中的突变(6次TA重复，7次TA重复)为对UGT1A1的功能产生影响的点突变。这种多态性就是前述的UGT1A1*28。本发明中，该部位的多态性，在纯合子时，可以用1895-TA7/TA7、1895-TA6/TA6表示，在为杂合子时，可以用1859-TA6/TA7来表示。而且，序列号1是具有7次TA重复的多态性UGT1A1*28。以下，也将该引物对(3)称为“UGT1A1*28用引物对”。而且，在只分析UGT1A1*28的多态性时，可以只使用UGT1A1*28用引物对。

出于与前述引物对(1)相同的理由，在本发明中，引物对(3)的F3引物和R3引物，只要决定DNA聚合酶的扩增起始点的3’末端的碱基满足前述条件即可。因此，F3引物和R3引物其长度自身没有特别的限制，可以列举与前述相同的长度。作为具体的例子，前述F3引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1863位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第17～31个碱基(优选第18～28个，更优选第19～24个碱基)的区域序列相同的至少一种寡核苷酸。而且，前述R3引物优选如下：与序列号1的碱基序列中的、以第1928位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第16～20个碱基(优选第17～20个碱基，更优选第17～19个碱基)的区域互补的至少一种寡核苷酸。而且，由于F3引物和R3引物的3’末端被固定，由引物延伸的区域是例如如前所述的序列号1中第1864位～第1927位的区域，获得的扩增产物的总长根据所使用的引物的长度而变化。

而且，R3引物也可以是不与序列号1所示的碱基序列完全互补的寡核苷酸，F3引物也可以是不与前述碱基序列的互补链完全互补的寡核苷酸。即，各引物中除3’末端碱基以外的部分中，可以与完全互补的寡核苷酸有1～5个碱基不同。

以下，列举F3引物和R3引物的具体例子，本发明不限于此。而且，这些F3引物和R3引物的组合没有任何限制，这其中，特别优选包含含有序列号42或序列号123的寡核苷酸的F3’引物、和含有序列号46或序列号48的寡核苷酸的R3’引物的引物对(3’)。

表3

而且，前述引物对(1)～(3)的各引物，例如为了提高扩增反应的反应温度，可以在5’末端添加以往公知的任意序列。

含有这种引物对(1)～(3)中的任意一个的本发明的UGT1A1基因扩增用引物对优选在扩增全血试样等生物试样中的UGT1A1基因时使用。尤其是，本发明的UGT1A1基因扩增用引物对在与后述的多态性检测用探针一起使用时，基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例优选为0.1～0.5体积％。对于这点，后文有述。

<UGT1A1基因扩增用试剂>

本发明的UGT1A1基因扩增用试剂，如前所述，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因的试剂，含有本发明的UGT1A1基因扩增用探针。本发明的基因扩增用试剂的特征在于含有本发明的引物对，此外的组成等没有任何限定。

本发明的UGT1A1基因扩增用试剂，例如，为了检测使用本发明的引物对通过基因扩增法获得的扩增产物，还可以含有能与UGT1A1基因的检测对象部位杂交的探针。如前所述，如果使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，根据例如其所包含的引物对(1)～(3)的种类，通过基因扩增法可以获得UGT1A1基因中的1个～3个目标区域的扩增产物。因此，通过同时存在有与前述各目标区域中的检测对象序列互补的探针，可以使用后述的方法检测例如扩增的有无、检测对象部位的基因型(多态性)等。对于这种探针及其利用方法，在之后的多态性分析方法中说明。而且，本发明的UGT1A1基因扩增用引物对优选在扩增全血等生物试样中的UGT1A1基因时使用。尤其是，本发明的UGT1A1基因扩增用试剂在与前述的探针一起使用时，基因扩增用反应液中的全血试样的添加比例优选为0.1～0.5体积％。而且，在本发明中，所谓“检测对象序列”是指含有多态性发生的部位(检测对象部位)的序列。

本发明的UGT1A1基因扩增用试剂的形态没有特别限定，例如可以是含有本发明的UGT1A1基因扩增用引物对的液体试剂，也可以是在使用前用溶剂悬浮的干燥试剂。而且，UGT1A1基因扩增用引物对的含有量也没有特别的限制。

<扩增产物的制备方法>

本发明的扩增产物的制备方法，如前所述，，其特征在于，其是通过基因扩增法制备UGT1A1基因的扩增产物的方法，含有下述步骤(I)：

(I)以试样中的核酸作为模板，使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，在反应液中扩增前述UGT1A1基因的步骤。

这样一来，通过使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对进行扩增反应，如前所述，可以使UGT1A1基因的目标区域扩增。而且，本发明的UGT1A1基因扩增用引物对在含有前述引物对(1)～(3)中的任意两种时，可以在同一反应液中同时扩增分别含有UGT1A1基因中的2个检测对象部位的2个目标区域。而且，本发明的UGT1A1基因扩增用引物对在含有前述引物对(1)～(3)全部时，可以在同一反应液中同时扩增分别含有UGT1A1基因中的3个检测对象部位的3个目标区域。根据本发明扩增的目标区域，如前所述，是分别含有各多态性(UGT1A1*28，UGT1A1*6和UGT1A1*27)发生的检测对象部位的区域。而且，在本发明的扩增产物的制备方法中，特征在于使用本发明的引物对，基因扩增法的种类和条件等没有任何限制。

作为前述基因扩增法，如前所述，没有特别的限制，例如，可以列举PCR(聚合酶链式反应)法、NASBA(Nucleic acidsequence based amplification，基于核酸序列的扩增)法、TMA(Transcription-mediated amplification，转录介导的扩增法)法、SDA法(Strand Displacement Amplification，链置换扩增法)等，这其中，优选PCR法。以下，以PCR法为例，说明本发明，但不限于该法。

作为使用本发明的试样，例如只要含有作为模板的核酸即可，没有特别的限制，优选例如在含有杂质的试样中使用。作为前述含有杂质的试样，可以列举例如全血、口腔内细胞(例如，口腔粘膜)、指甲和毛发等的体细胞、生殖细胞、咳痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液(例如胃清洗液)等，以及这些物质的悬浮液等。根据采用本发明的引物对的扩增产物的制备方法，即使是例如含有各种杂质的试样(尤其是全血或口腔内细胞等生物试样)，也可以不受其影响地特异性扩增UGT1A1基因的前述目标区域。因此，根据本发明，即使是用以往的方法难以分析的杂质多的试样，也可以例如不进行纯化等前处理地直接使用。因而，从试样的前处理的观点来看，可以说能够比以往的方法更快地制备扩增产物。

前述反应液中的试样的添加比例没有特别的限制。作为具体例子，前述试样为生物试样(例如，全血试样)时，前述反应液中的添加比例的下限优选在例如0.01体积％以上，更优选在0.05体积％以上，更优选在0.1体积％以上。而且，前述添加比例的上限没有特别的限制，例如，优选2体积％以下，更优选在1体积％以下，更优选在0.5体积％以下。

而且，以后述的光学检测作为目的时，尤其是使用标记探针进行光学检测时，前述反应液中的全血试样等生物试样的添加比例优选设定在例如0.1～0.5体积％。在PCR反应中，通常为了使DNA变性(向单链DNA的解离)而实施热处理，但是存在着通过这种热处理，试样中所含的糖、蛋白质等变性，产生不溶的沉淀物、浑浊等的可能性。因此，在通过光学方法确认有无扩增产物、检测部位的基因型(多态性)时，这种沉淀物、浑浊的产生可能会影响测定精确度。但是，若将反应液中的全血试样的添加比例设定在前述范围，尽管机理并不清楚，但可以充分防止变性所导致的沉淀物的发生所产生的影响，因此可以提高使用光学方法的测定精确度。而且，由于充分抑制了全血试样中的杂质对PCR的干扰，因此可以进一步提高扩增效率。因此，在使用本发明的引物对的基础上，再通过将全血试样等试样的添加比例设定在前述范围，可以进一步排除试样的前处理的必要性。

而且，前述反应液中的全血试样的比例不仅可以用前述的体积比例(例如，0.1～0.5体积％)还可以用血红蛋白(以下称为“Hb”)的重量比例表示。此时，前述反应液中的全血试样的比例，换算成Hb量，在例如0.565～113g/L的范围，更优选在2.825～56.5g/L的范围，更优选在5.65～28.25g/L的范围。而且，前述反应液中的全血试样的添加比例，可以满足例如前述体积比例和Hb重量比例两者，也可以满足二者中的任意一者。

作为全血，可以是例如溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固组分的全血等中的任意一者。

本发明中，试样中所含的目标核酸例如是DNA。前述DNA可以是例如生物试样等试样中原来含有的DNA，也可以是通过基因扩增法扩增的扩增产物DNA。后者的情况下，可以列举由前述试样中原本含有的RNA(总RNA，mRNA等)通过逆转录反应(例如RT-PCR(逆转录PCR))生成的cDNA。

在本发明的扩增产物的制备方法中，优选在基因扩增反应开始前在前述反应液中再添加白蛋白。通过添加这种白蛋白，可以进一步减小例如由于前述沉淀物、浑浊的发生所产生的影响，而且还可以进一步提高扩增效率。具体而言，优选在前述步骤(I)的扩增反应和向单链DNA解离的步骤之前添加白蛋白。

前述反应液中的白蛋白的添加比例在例如0.01～2重量％的范围，优选在0.1～1重量％的范围，更优选在0.2～0.8重量％的范围。作为前述白蛋白，没有特别的限定，可以列举例如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白，大鼠血清白蛋白，马血清白蛋白等，可以是这些物质中的任意一种也可以联合使用两种以上。

其次，对于本发明的扩增产物的制备方法，举如下的例子进行说明，即，以全血试样中的DNA作为目标核酸，采用包括前述引物对(1)～(3)的本发明的UGT1A1基因扩增用引物对、通过PCR制备UGT1A1基因的3个目标区域的扩增产物。而且，本发明的特征在于使用本发明的引物对，其它构成及条件没有任何限制。

首先，制备PCR反应液。本发明的引物对的添加比例没有特别的限制，但优选按引物对(1)～(3)的F引物分别达到0.1～2μmol/L的方式添加，更优选为0.25～1.5μmol/L，特别优选为0.5～1μmol/L。而且优选按引物对(1)～(3)的R引物分别达到0.1～2μmol/L的方式添加，更优选为0.25～1.5μmol/L，特别优选为0.5～1μmol/L。各引物对中F引物和R引物的添加比例(F∶R，摩尔比)没有特别限制，但优选例如在1∶0.25～1∶4，更优选在1∶0.5～1∶2。

反应液中的全血试样的比例没有特别的限定，但优选前述的范围。全血试样可以直接添加于反应液中，也可以预先用水或缓冲液等溶剂稀释后再添加到反应液中。预先稀释全血试样时，其稀释率没有特别的限定，例如将稀释率设定为使反应液中的最终的全血添加比率在前述范围，例如为100～2000倍，优选在200～1000倍。

前述反应液中的其它组成成分没有特别的限制，可以列举以往公知的成分，其比例没有特别限定。作为前述组成成分，可以列举例如DNA聚合酶，核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶剂。而且，如前所述，优选在前述反应液中进一步含有白蛋白。而且，在前述反应液中，各组成成分的添加顺序没有任何限定。

作为前述DNA聚合酶，没有特别限定，例如可以使用以往公知的耐热性细菌来源的聚合酶。作为具体例子，可以商业上获得水生栖热菌(Thermus aquaticus)来源的DNA聚合酶(美国专利第4889818号和第5079352号)(商品名Taq聚合酶)，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)来源的DNA聚合酶(WO91/09950)(rTth DNA聚合酶)，强烈火球菌(pyrococcusfuriosus)来源的DNA聚合酶(WO92/09689)(Pfu DNA聚合酶：Stratagenes公司制)，嗜热球菌(Thermococcus litoralis)来源的DNA聚合酶(EP0455430)(商标Vent：New England Biolabs公司制)等，这其中优选水生栖热菌(Thermus aquaticus)来源的耐热性DNA聚合酶。

前述反应液中的DNA聚合酶的添加比例没有特别限定，例如在1～100U/mL，优选在5～50U/mL，更优选在20～30U/mL。而且，DNA聚合酶的活性单位(U)，一般以活化鲑鱼精子DNA作为模板引物，在活性测定用反应液中于74℃、30分钟内将所有10nmol的核苷酸都吸收到酸不溶性沉淀物中的活性为1U。前述活性测定用反应液的组成是例如25mM TAPS缓冲液(pH9.3，25℃)，50mM KCl，2mM MgCl₂，1mM硫基乙醇，200μMdATP、200μM dGTP、200μM dTTP、100μM“α-³²P”dCTP、0.25mg/ml活化鲑鱼精子DNA。

作为前述核苷三磷酸，通常可以列举dNTP(dATP，dCTP，dTTP)。前述反应液中的dNTP的添加比例没有特别的限定，例如为0.01～1mmol/L，优选为0.05～0.5mmol/L，更优选为0.1～0.3mmol/L。

作为前述溶剂，可以列举例如Tris-HCL，三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，MES，MOPS，HEPES，CAPS等缓冲液，可以使用市售的PCR用缓冲液和市售的PCR试剂盒的缓冲液等。

而且，前述PCR反应液还可以含有肝素，甜菜碱，KCl，MgCl₂，MgSO₄，甘油等，它们的添加比例可以设定在例如不抑制PCR反应的范围内。

反应液的总体积没有特别的限定，例如可以根据使用的机器(热循环仪)等适当确定，通常为1～500μL，更优选为10～100μL。

然后进行PCR。PCR的循环条件没有特别的限定，例如(1)全血来源的双链DNA向单链DNA的解离，(2)引物的退火，(3)引物的延伸(聚合酶反应)分别如下述方式进行。而且，循环数也没有特别限定，以下述(1)～(3)的3个步骤为1个循环，优选例如在30个循环以上。上限没有特别的限定，例如在总计100个循环以下，优选70个循环以下，更优选50个循环以下。各步骤的温度变化可以使用例如热循环仪等自动进行控制。使用本发明的引物对时，由于如前所述扩增效率优异，因此与用以往的方法50个循环需要3个小时左右相比，根据本发明可以以约1小时左右(优选1小时内)完成50个循环。

表4

按上述方式，可以制备与UGT1A1基因的3个目标区域互补的扩增产物。而且，在制备与3个目标区域中的任意1个或任意2个互补的扩增产物时，可以使用例如含有引物对(1)～(3)中与目标区域相应的任意1种或任意2种引物对的本发明的UGT1A1基因扩增用引物对。

本发明的扩增产物的制备方法还可以含有检测通过前述的扩增反应获得的目标区域的扩增产物的步骤。通过该步骤，还可以检测扩增产物的有无、UGT1A1基因的前述目标区域的基因型(多态性UGT1A1*6，UGT1A1*27或UGT1A1*28)。按照以往已知的方法可以确认扩增产物的有无。具体而言，例如可以通过在前述步骤(I)中，在前述反应液中添加可以与UGT1A1基因的检测对象部位杂交的探针(例如荧光标记探针)，再通过步骤(II)、即测定前述反应液的前述探针中的荧光标记的荧光强度来确认。而且，扩增的目标区域为2个或3个时，可以通过例如在前述步骤(I)中，在前述反应液中添加2种或3种可以与UGT1A1基因的各检测对象部位杂交的探针(例如荧光标记探针)，再通过步骤(II)、即测定前述反应液的各探针中的各荧光标记的荧光强度来确认。而且，对于UGT1A1基因中的UGT1A1*6，UGT1A1*27和UGT1A1*28的检测，作为本发明的一个方式，在下文进行说明。

<UGT1A1基因的多态性分析方法>

本发明的UGT1A1基因的多态性分析方法，其特征在于，其是分析UGT1A1基因中的检测对象部位的多态性的方法，含有以下步骤(i)～(iv)。

(ii)准备含有所述步骤(i)中的扩增产物和可以与所述检测对象部位杂交的探针的反应液的步骤

这样，通过使用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对制备扩增产物，如前所述地扩增UGT1A1基因中的、含有多态性(UGT1A1*6，UGT1A1*27或UGT1A1*28)的检测对象部位的目标区域，可以分析前述目标区域中的检测对象部位的多态性。

前述步骤(ii)中的探针没有特别的限定，可以列举例如与多态性UGT1A1*6的发生部位杂交的探针(以下也称为“UGT1A1*6用探针”)，与多态性UGT1A1*27的发生部位杂交的探针(以下也称为“UGT1A1*27用探针”)，以及与多态性UGT1A1*28的发生部位杂交的探针(以下也称为“UGT1A1*28用探针”)。这些探针优选与含有前述检测对象部位的检测对象序列互补的探针。这些探针可以是任意一种，也可以是任意两种，也可以是所有3种，例如可以根据用本发明的UGT1A1基因扩增用引物对扩增出的目标区域的种类来确定。使用2种或3种探针时，例如可以使用同一反应液，分析任意2种检测对象部位或前述所有3个检测对象部位的多态性。

用于检测前述多态性的探针，没有特别的限定，可以通过以往公知的方法设定。例如，作为含有多态性的检测对象部位的检测对象序列，可以基于UGT1A1基因的有义链的序列设计，也可以基于反义链的序列设计。而且，多态性的检测对象部位的碱基可以根据各个多态性的种类适当确定。即，UGT1A1*6时，序列号1中第2160位的碱基已知有“G”和“A”的多态性，据此可以列举例如与第2160位为G的检测对象序列和第2160位为A的检测对象序列中的任一条序列互补的探针(有义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。而且，UGT1A1*27时，序列号1中第2635位的碱基已知有“C”和“A”的多态性，据此可以列举例如与第2635位为C的检测对象序列和第2635位为A的检测对象序列中的任一条序列互补的探针(有义链的检测用探针)、与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针)。而且，UGT1A1*28时，序列号1中从第1895位开始的TATA盒的碱基已知有“6次TA重复：TA6”，“7次TA重复：TA7”)的多态性，据此可以列举例如与第1895位起始的TA重复为6次的检测对象序列和第1895位起始的TA重复为7次的检测对象序列中的任一条序列互补的探针(有义链的检测用探针)，与其反义链的序列互补的探针(反义链的检测用探针等)。这样，不论在设计探针时将发生多态性的检测对象部位的碱基设定为前述那样的任意一种碱基，都可以通过后述的方法判断UGT1A1基因的各检测对象部位中呈现哪种多态性。

前述各探针还可以在前述步骤(i)后，即对UGT1A1基因的目标区域进行扩增反应后，添加到扩增反应液中，但为了容易且迅速地进行分析，优选在前述步骤(i)的扩增反应前预先添加到反应液中。

前述反应液中的探针的添加比例没有特别的限定，但优选例如按10～400nmol/L的范围内添加各探针，更优选在20～200nmol/L。而且，使用荧光染料作为探针的标记时，例如为了调整检测的荧光强度，可以联合使用与标记探针序列相同的未标记探针，这种未标记探针可以在其3’末端上添加磷酸。此时，标记探针和非标记探针的摩尔比优选在例如1∶10～10∶1。前述探针的长度没有特别的限制，例如是5～50mer，优选是10～30mer。

对Tm值进行说明。若逐渐加热含有双链DNA的溶液，260nm处的吸光度上升。这是由于双链DNA中的双链间的氢键因加热而解开，解离成单链DNA(DNA的融解)。而且，所有的双链DNA解离形成单链DNA，其吸光度呈现出加热开始时的吸光度(只是双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断融解结束了。基于这种现象，所谓融解温度Tm一般被定义为吸光度达到吸光度总上升部分的50％时的温度。

前述步骤(iii)中，测定前述扩增产物和前述探针的杂交产物显示融解状态的信号可以是测定前述的260nm的吸光度，也可以是测定标记物的信号。具体而言，优选使用用标记物标记的标记探针作为前述探针，进行前述标记物的信号测定。作为前述标记探针，可以列举例如单独显示信号且由于形成杂交体而不显示信号的标记探针，或者单独不显示信号且由于形成杂交体而显示信号的标记探针。如果是前述的探针，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，而通过加热探针游离则显示信号。而且如果是后者的探针，在与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示信号，而通过加热探针游离则信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸收波长等)下检测这种标记产生的信号，可以与前述260nm的吸光度测定一样，在进行杂交产物融解的同时进行Tm值的测定等。

在本发明中，如前所述，还可以对同一反应液中扩增的2个或3个目标区域的扩增产物确认其多态性。为此，在使用2种或3种探针时，优选通过在各个不同的条件下进行检测的不同的标记进行标记。通过使用这种不同的标记，即使在同一反应液中，通过改变检测条件，也可以分别分析各扩增产物。

作为前述标记探针中的标记物的具体例子，可以列举例如荧光染料(荧光团)。作为前述标记探针的具体例子，优选例如用荧光染料标记，单独呈现信号且由于杂交体形成而荧光减少(例如猝灭)的探针。利用这种荧光猝灭现象(Quenchingphenomenon)的探针一般被称为荧光猝灭探针。这其中优选前述探针的寡核苷酸的3’末端或5’末端被荧光染料标记，被标记的前述末端的碱基优选为C。此时，优选将前述标记探针的碱基序列设计成如下的序列：在前述标记探针所杂交的检测对象序列中，与前述标记的探针的末端碱基C配对的碱基或从前述配对的碱基起的1～3个碱基为G。这种探针一般被称为鸟嘌呤猝灭探针，已知有所谓QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤猝灭探针若与检测对象序列杂交，经荧光染料标记的末端的C由于靠近前述检测对象DNA中的G，因此呈现出前述荧光染料的发光变弱(荧光强度减少)的这种现象。如果使用这种探针，通过信号的变动可以容易地确认杂交和解离。

作为前述荧光染料，没有特别的限定，但可以列举例如荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的荧光染料，可以列举例如BODIPY FL(商标，Molecular probe公司制)，FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制)，Fluoredite(商品名，Millipore公司制)，FAM(ABI公司制)，Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia公司制)，TAMRA(Molecularprobe公司制)等。在多种探针中使用的荧光染料的组合，只要可在例如不同的条件下检测，就没有特别的限定，例如可以列举Pacific Blue(检测波长450～480nm)，TAMRA(检测波长585～700nm)和BODIPY FL(检测波长515～555nm)的组合等。

以下，列举用于检测多态性UGT1A1*6，UGT1A1*27和UGT1A1*28的探针的序列的具体例子，但本发明不限于此。下述探针(1)是UGT1A1*6用探针的一个例子，是用于检测反义链的探针。下述探针(2)是UGT1A1*27用探针的一个例子，下述(2-1)是用于检测反义链的探针，下述(2-2)是用于检测有义链的探针。下述探针(3)是UGT1A1*28用探针的一个例子，是用于检测反义链的探针。

探针(1)：

与序列号1中的、以第2173位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第17～25个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为3’末端

探针(2)为以下(2-1)和(2-2)中任意一种寡核苷酸

(2-1)：与序列号1中的、以第2645位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着5’方向直至第15～22个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为3’末端

和

(2-2)：与序列号1中的、以第2625位的鸟嘌呤碱基(G)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第17～22个碱基的区域互补的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤碱基互补的胞嘧啶碱基(C)作为3’末端

探针(3)：

与序列号1中的、以第1892位的胞嘧啶碱基(C)作为第1个碱基，朝着3’方向直至第25～31个碱基的区域序列相同的至少一种寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶碱基作为3’末端

在前述探针(1)中，位于序列号1的第2160位的碱基用r表示，前述r是G或A。在前述探针(2-1)中，位于序列号1的第2635位的碱基用m表示，前述m是C或A。在前述探针(2-2)中，与序列号1的第2635位互补的碱基用k表示，前述k是G或T。在前述探针(3)中，位于序列号1的从第1895位起的TATA盒的区域是7次的TA重复或6次的TA重复。

进而，前述探针(1)、探针(2)和探针(3)的具体例子示于下表。而且，下表中“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃)，是用MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)、将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM，钠当量(Naeq.)50mM计算的值。

表5

上表中探针(1)包含与序列号1中的第2160位为A的区域相同的序列，大写的碱基表示序列号1的第2160位的碱基。而且，在前述探针(1)中，前述大写的碱基可以替换成r，前述r可以是A和G中的任一个。在上表中，由序列号59～66表示的探针(2-1)包含与序列号1中的第2635位为A的区域相同的序列，前述大写的碱基表示序列号1的第2635位的碱基。而且，在前述探针(2-1)中，前述大写的碱基可以替换成m，前述m可以是A和C中的任一个。在上表中，序列号100～105表示的探针(2-2)包含与序列号1中的第2635位为A的区域互补的序列，大写的碱基表示与序列号1的第2635位的碱基互补的碱基。而且，在前述探针(2-2)中，前述大写的碱基可以替换成k，前述k可以是A或C。在上表中的探针(3)包含与序列号1中的第1895位起的TATA盒为7次TA重复的区域相同的序列，大写的碱基表示7次TA重复。而且，在前述探针(3)中，TA重复可以是7次和6次中的任一种。作为本发明中的探针的具体例子，例如如前所述，可以是前表中所示的寡核苷酸的互补链。

前述探针是一个例子，本发明不限于此。作为UGT1A1*6用探针，探针(1)中，优选为含有序列号55的碱基序列的寡核苷酸或者含有序列号56的碱基序列的寡核苷酸；作为UGT1A1*27用探针，探针(2)中，优选为含有序列号62的碱基序列的寡核苷酸或者含有序列号102的碱基序列的寡核苷酸；作为UGT1A1*28用探针，探针(3)中，优选为含有序列号69的碱基序列的寡核苷酸。

而且，在使用2种以上这些探针时，如前所述，优选用各个不同的荧光染料(不同的波长下检测的荧光染料)标记。例如，以前表中所示的探针制成鸟嘌呤猝灭探针时，优选UGT1A1*6用探针和UGT1A1*27用探针3’末端的胞嘧啶被前述的荧光染料(例如Pacific Blue，TAMRA等)标记，UGT1A1*28用探针5’末端的胞嘧啶被前述的荧光染料(例如BODIPY FL)标记。而且，在5’末端上标记了荧光染料的探针，例如为了防止探针自身伸长，可以在其3’末端上再添加磷酸基。

然后，对于本发明的检测方法，列举如下的例子进行说明，即，使用下述探针，检测UGT1A1基因中的3个多态性UGT1A1*28，UGT1A1*6和UGT1A1*27。而且，本发明不限于此。

(探针)

UGT1A1*6用探针

5’-agagacaGagcattttacac-(Pacific Blue)-3’(序列号55)，或

5’-gagacaGagcattttacac-(Pacific Blue)-3’(序列号56)

UGT1A1*27用探针

5’-ttattcccAgtatgcaacc-(TAMRA)-3’(序列号62)，或

5’-gttgcatacTgggaataaac-(TAMRA)-3’(序列号102)

UGT1A1*28用探针

5’-(BODIPY FL)-ccaTATATATATATATAtaagtaggagag-3’(序列号69)

首先，使用添加了前述3种标记探针的反应液，如前所述地进行PCR，在同一反应液中同时扩增UGT1A1基因的3个区域。前述反应液含有例如本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，DNA聚合酶，dNTP，含有作为模板的核酸的试样和前述3种探针。此外还可含有可以在核酸扩增中使用的各种添加剂。

接着，对获得的扩增产物进行解离，并进行通过解离获得的单链DNA与前述标记探针的杂交。这可以通过例如改变前述反应液的温度来进行。

前述解离步骤中的加热温度只要是前述扩增产物解离的温度即可，没有特别的限定，例如，85～95℃。加热时间没有特别的限定，但通常为1秒～10分钟，优选1秒～5分钟。

解离的单链DNA和前述标记探针的杂交可以在例如前述解离步骤后，通过使前述解离步骤中的加热温度下降来进行。作为温度条件，为例如40～50℃。

而且，改变前述反应液的温度，测定前述扩增产物和前述标记探针的杂交产物显示融解状态的信号值。具体的是，例如，加热前述反应液(前述单链DNA和前述标记探针的杂交产物)，测定伴随温度上升的信号值的变化。如前所述，使用末端的C碱基被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)时，在与单链DNA杂交的状态下，荧光减少(或猝灭)，在解离的状态下，发出荧光。因此，例如，可以慢慢加热荧光减少(或猝灭)了的杂交产物，测定伴随温度上升的荧光强度的增加。

测定荧光强度的变动时的温度范围没有特别的限定，例如，起始温度为室温～85℃，优选25～70℃，终止温度为例如40～105℃。而且，温度的上升速度没有特别的限定，为例如0.1～20℃/秒，更优选为0.3～5℃/秒。

接着，通过分析前述信号的变动来确定Tm值。具体而言，根据获得的荧光强度，计算各温度下每单位时间的荧光强度变化量(-d荧光强度增加量/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。而且，还可以将每单位时间的荧光强度增加量(d荧光强度增加量/dt)的最高点确定为Tm值。而且，在使用单独不显示信号且由于杂交形成显示信号的探针而不是使用猝灭探针作为标记探针时，可以相反地来测定荧光强度的减少量。

在本发明中，为了检测3个多态性UGT1A1*6、UGT1A1*27和UGT1A1*28，在与3种探针的各个标记相应的条件下，测定各个Tm值。UGT1A1*6用探针的Pacific Blue可以在例如450～480nm的检测波长处检测，UGT1A1*27用探针的TAMRA可以在例如585～700nm的检测波长处检测，UGT1A1*28用探针的BODIPY FL可以在例如515～555nm的检测波长处检测。

而后，根据这些Tm值确定各检测对象部位的基因型。在Tm分析中，获得了以下结果：完全互补的杂交体(匹配)比1个碱基不同的杂交体(错配)显示解离的Tm值要高。因此，对于前述探针，通过预先测定完全互补的杂交体的Tm值、和1个碱基不同的杂交体的Tm值，可以确定各检测对象部位的基因型。例如，将检测对象部位的碱基假定为突变型(例如，序列号1中第2160位的碱基为A)，使用与含有其的检测对象序列互补的探针时，形成的杂交体的Tm值如果与完全互补的杂交体的Tm值相同，则前述扩增产物的多态性可以判断为突变型。而且，形成的杂交体的Tm值如果与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同(比完全互补的杂交体的Tm值更低)，则前述扩增产物的多态性可以判断为野生型(例如，序列号1中第2160位的碱基为G)。进而，在检测到两个Tm值时，可以确定为杂合子。这样，根据各个标记探针相对应的3个Tm值，可以评断多态性UGT1A1*6和UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因型。

而且，在本发明中，可以进行杂交体形成时的信号变动的测定来代替如前所述的使含有前述探针的反应液的温度上升(加热杂交产物)，测定伴随温度上升的信号变动的方法。也就是说，通过使含有前述探针的反应液的温度下降来形成杂交体时，可以测定伴随前述温度下降的信号变动。

作为具体例子，使用单独显示信号而由于形成杂交体不显示信号的标记探针(例如鸟嘌呤猝灭探针)时，在单链DNA和探针解离的状态下发出荧光，然而由于温度下降而形成杂交体时，则前述荧光减少(或猝灭)。因此，例如，可以使前述反应液的温度缓缓下降，测定伴随温度下降的荧光强度的减少。另一方面，使用单独不显示信号、由于形成杂交体而显示信号的标记探针时，在单链DNA和探针解离的状态下不发出荧光，然而由于温度下降而形成杂交体时，则发出荧光。因此，例如，可以使前述反应液的温度徐徐下降，测定伴随温度下降的荧光强度的增加。

而且，在分析UGT1A1基因的3种多态性(UGT1A1*28和UGT1A1*6和UGT1A1*27)中的任意1种或任意2种多态性时，使用例如含有引物对(1)～(3)中的对应于目标区域的任意1种或任意2种引物对的本发明的UGT1A1基因扩增用引物对，还可以使用与目标检测对象部位杂交的任意一种探针或任意2种探针。

下面，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不受下述实施例限制。

实施例1

从9名受试者中用肝素锂采血管进行采血(试样1～9)。将10μL获得的血液与90μL蒸馏水混合，再将10μL该混合液与90μL蒸馏水混合。将10μL所得的混合液添加到40μL下述组成的PCR反应液中，用热循环仪进行PCR。PCR的条件为以95℃处理60秒、95℃1秒和54℃10秒作为1个循环，重复50个循环，再于95℃处理1秒，40℃处理60秒。而且，接着，温度的上升速度设为1℃/3秒，将前述PCR反应液由40℃加热到95℃，测定荧光强度随时间的变化。检测波长为450～480nm(荧光染料PacificBlue的检测)，515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)，585～700nm(荧光染料TAMRA的检测)。而且，50个循环的PCR所需要的时间约为1个小时。

表6

(PCR反应液：单位μl)

蒸馏水 19.875

5％NaN₃ 0.5

20％BSA 1

40％甘油 3.125

10×Gene Taq缓冲液* 5

2.5mM dNTPs 4

100mM MgCl₂ 1

5μM UGT1A1*6用探针 1

5μM UGT1A1*27用探针1 0.5

5μM UGT1A1*27用探针2 1

5μM UGT1A1*28用探针 0.5

100μM UGT1A1*6 F1引物 0.25

100μM UGT1A1*6 R1引物 0.5

100μM UGT1A1*27 F2引物 0.25

100μM UGT1A1*27 R2引物 0.5

100μM UGT1A1*28 F3引物 0.25

100μM UGT1A1*28 R3引物 0.5

5U/μl Gene Taq FP* 0.25

总 40μl

*商品名Gene Taq FP：ニッポンジ一ン公司制

(探针)

UGT1A1*6用探针

5’-agagacagagcattttacac-(Pacific Blue)-3’(序列号55)

UGT1A1*27用探针1

5’-ttattcccagtatgcaacc-(TAMRA)-3’(序列号62)

UGT1A1*27用探针2

5’-ttattcccagtatgcaacc-P-3’(序列号62)

UGT1A1*28用探针

5’-(BODIPY FL)-ccatatatatatatatataagtaggagag-P-3’(序列号69)

(引物对)

UGT1A1*6 F1引物

5’-agcagaggggacatgaaata-3’(序列号4)

UGT1A1*6 R1引物

5’-aacattatgcccgagactaac-3’(序列号13)

UGT1A1*27 F2引物

5’-agaactttctgtgcgacg-3’(序列号21)

UGT1A1*27 R2引物

5’-cagatgcagagctcaatagg-3’(序列号29)

UGT1A1*28 F3引物

5’-gtcacgtgacacagtcaaac-3’(序列号42)

UGT1A1*28 R3引物

5’-cctttgctcctgccagag-3’(序列号48)

与UGT1A1*6用探针匹配的杂交体的Tm值为63℃，错配的杂交体的Tm值为56℃，与UGT1A1*27用探针匹配的杂交体的Tm值为61℃，错配的杂交体的Tm值为56℃，与UGT1A1*28用探针匹配的杂交体的Tm值为58℃，错配的杂交体的Tm值为54℃。

试样1～9的结果示于图1～3。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”，横轴表示温度(以下相同)。如这些图所示，根据信号的峰确定各试样中的UGT1A1*6和UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因型。为了支持这些实施例的结果，对于9名受试者，通过RFLP法和测序法确认UGT1A1*6和UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因型，获得了与实施例相同的结果。这样，通过使用本发明的引物对，使用不实施前处理的全血试样，可以在同一反应液中同时扩增UGT1A1基因的3个区域，并且使用前述同一反应液分析3种多态性。

实施例2

从2名受试者中用EDTA采血管进行采血(试样1～2)。将10μL获得的血液与70μL下述稀释液A混合，再将10μL该混合液与70μL下述稀释液B混合。将10μL所得混合液于95℃加热5分钟处理后，再添加到46μL下述组成的PCR反应液中，用热循环仪进行PCR。PCR的条件为以95℃处理60秒后、95℃处理1秒和60℃15秒作为1个循环，重复50个循环，再于95℃1秒，40℃处理60秒。而且，接着，温度的上升速度设为1℃/3秒，将前述PCR反应液由40℃加热到75℃，测定荧光强度随时间的变化。检测波长为450～480nm(荧光染料Pacific Blue的检测)，515～555nm(荧光染料BODIPY FL的检测)，585～700nm(荧光染料TAMRA的检测)。

(稀释液A)

10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN₃、0.3％ SDS

(稀释液B)

10mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM EDTA、0.05％NaN₃

表7

(PCR反应液：单位μl)

蒸馏水 15

5％NaN₃ 0.5

20％BSA 0.5

40％甘油 12.5

10×Gene Taq缓冲液* 5

2.5mM dNTPs 4

5μM UGT1A1*6用探针 2

5μM UGT1A1*27用探针 2

5μM UGT1A1*28用探针 2

100μM UGT1A1*6 F1引物 0.25

100μM UGT1A1*6 R1引物 0.5

100μM UGT1A1*27 F2引物 0.5

100μM UGT1A1*27 R2引物 0.25

100μM UGT1A1*28 F3引物 0.25

100μM UGT1A1*28 R3引物 0.5

5U/μl Gene Taq FP* 0.25

总 46μl

*商品名Gene Taq FP：ニッポンジ一ン公司制

(探针)

UGT1A1*6用探针

5’-gagacagagcattttacac-(Pacific Blue)-3’(序列号56)

UGT1A1*27用探针

5’-gttgcatacTgggaataaac-(TAMRA)-3’(序列号102)

UGT1A1*28用探针

5’-(BODIPY FL)-ccatatatatatatatataagtaggagag-P-3’(序列号69)

(引物对)

UGT1A1*6 F1引物

5’-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3’(序列号81)

UGT1A1*6 R1引物

5’-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3’(序列号91)

UGT1A1*27 F2引物

5’-ccttttcacagaactttctgtgcgacg-3’(序列号92)

UGT1A1*27 R2引物

5’-gccagacagatgcagagctcaatagg-3’(序列号98)

UGT1A1*28 F3引物

5’-agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3’(序列号123)

UGT1A1*28 R3引物

5’-cgcctttgctcctgccagag-3’(序列号46)

与UGT1A1*6用探针匹配的杂交体的Tm值为57℃，错配的杂交体的Tm值为50℃，与UGT1A1*27用探针匹配的杂交体的Tm值为57℃，错配的杂交体的Tm值为50℃，与UGT1A1*28用探针匹配的杂交体的Tm值为53℃，错配的杂交体的Tm值为49℃。

试样1～2的结果示于图4。这些图是表示伴随温度上升的荧光强度的变化的Tm分析的图，纵轴的微分值表示“-d荧光强度增加量/dt”，横轴表示温度。如这些图所示，根据信号的峰确定各试样中的UGT1A1*6和UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因型。为了支持这些实施例的结果，对于2名受试者，通过RFLP法和测序法，确认UGT1A1*6和UGT1A1*27和UGT1A1*28的基因型，获得了与实施例相同的结果。这样，通过使用本发明的引物对，使用不实施前处理的全血试样，可以在同一反应液中同时扩增UGT1A1基因的3个区域，并且使用前述同一反应液可以分析3种多态性。

工业上利用的可能性

如上所述，通过本发明的引物对，可以以高效率特异性扩增UGT1A1基因中的、含有特定的多态性(UGT1A1*28和UGT1A1*6或UGT1A1*27)发生部位的区域。因此与前述的以往的方法不同，可以减少麻烦和成本。而且，由于这样一来特异性扩增含有多态性的检测对象部位的区域，通过使用例如与含有前述检测对象部位的检测对象序列互补的探针，使用前述反应液直接进行Tm值分析，可以对前述多态性进行分型。而且，由于在一个反应液中可以扩增和分型，因此可以使操作自动化。再者，如果使用本发明的引物对，即使是例如含有杂质的试样(例如全血或口腔粘膜等)，由于可以省略前处理，因此可以更迅速且更简便地进行扩增反应。而且，如果使用本发明的引物对，可以以比以往更优异的扩增效率进行扩增反应，因此可以缩短扩增反应。因此，如果通过本发明的引物对和含有其的试剂、以及使用它们的扩增产物的制备方法，可以快速且简便地分析UGT1A1基因的多态性，因此可以认为在医疗领域中极为有效。

序列表

<110>爱科来株式会社(ARKRAY，Inc.)

<120>UGT1A1基因扩增用引物对、含有其的UGT1A1基因扩增用试剂及其用途

<130>TF07037-01

<150>JP2006-322955

<151>2006-11-30

<150>JP2007-232611

<151>2007-09-07

<160>124

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16944

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

tgcatgatgc aggaaagtca taaaatcatt acagtggtga cttatgtgtt tatagcccct 60

ttactgtcta taatctgcaa atgaactcac acagcattgg gactttggaa gaattatcac 120

ccttaaggtt taaattaaac tgtgaatttc agaatttcta ataaggacac aacaaagagt 180

gaaagcattg ctatgtctat tctgcttgcc cagaatcttg gtcctaaaaa atgaagagtg 240

tttgggtgtg gggaggagct tcagtgtgca tgtgcatgca aagtacctac tctaaggaga 300

agaatgagag ggtaccctaa ttacctgtta atatgtccca taggacacca aaactctagt 360

tagctgtttc tctatgatcc tctaagcaca tccccaagta tggctggcca gtgatgtgta 420

tggttcaaat gttgggatct gtgcagttat cttggaattg tatagtacag cagtatatcc 480

cccccaaaaa gagtgtaata cttccaattc tggctgcaca atacttgccc catagtccat 540

ggtcaataaa tacaaatttg agttgttttt gctcatcttt cccttttgac ttcaactcag 600

tcatcagaat ttccccaaat gcctttcccc tggatcttgg gccagtggaa tgagtacaat 660

ttaacttaat tgaatttgct tatctatttg gtttcctgtt gtgaacaaaa gttctctgaa 720

aaggaatttg gaagaaagag actttgttct agtgaacagt ttgcaaacca gggagttaca 780

gcctctggta cgcaatgaag gtgagttcca cagaacacaa ggcaggcagg tttcacggca 840

aaaagttcct tcccaggttc ccaatcaggt ccatttatgc aaatgaagga tggaaacttg 900

cttagttctt attggtcact gcagctgcat tctgattggt tgatgaagct gagccctgag 960

tggctgaggt gggtgagctt taattggttg gttcaggtga gcgctgaaaa tctcaactat 1020

aaaaaggtac aggttttcag gatactcaga gtaaccgtgt gacctgtagt aagcaaaggg 1080

ccagttggct ctattttaaa tccaggccca gttagccact caagatctat cttacaggac 1140

tggctctttc aggttcacac taataaaggc ctgtccttgg ggaagacttc tgttcacatg 1200

cgctccagtg aatttccctt tctggtcatt ctctacccca gcacgccccc cacccccgcc 1260

ccgccccacc cacccacctg ttcatttcct tcttagcatg cttcacgatt tctaagttcc 1320

tgctcatgtg tttaaattgt gagtctggct cacctcatgg cgcgtgctcg tgtggtgggc 1380

tctgctgcag cctcaagacc ccacactgtg ctggactcaa taaatattgt tggacgaagg 1440

aatgaaacac atgatacaag tgagcaggca gtaccggggg agctgtggag tgggcactct 1500

tacaggtttc catggcgaaa gcgggggtac agttgtgttc ttttctttct aaaaggcttt 1560

ctaaaaagcc ttctgtttaa tttctggaaa agaagcctaa cttgttcact acatagtcgt 1620

ccttcttcct ctctggtaac acttgttggt ctgtggaaat actaatttaa tggatcctga 1680

ggttctggaa gtactttgct gtgttcactc aagaatgtga tttgagtatg aaattccagc 1740

cagttcaact gttgttgcct attaagaaac ctaataaagc tccaccttct ttatctctga 1800

aagtgaactc cctgctacct ttgtggactg acagcttttt atagtcacgt gacacagtca 1860

aacattaact tggtgtatcg attggttttt gccatatata tatatatata agtaggagag 1920

ggcgaacctc tggcaggagc aaaggcgcca tggctgtgga gtcccagggc ggacgcccac 1980

ttgtcctggg cctgctgctg tgtgtgctgg gcccagtggt gtcccatgct gggaagatac 2040

tgttgatccc agtggatggc agccactggc tgagcatgct tggggccatc cagcagctgc 2100

agcagagggg acatgaaata gttgtcctag cacctgacgc ctcgttgtac atcagagacg 2160

gagcatttta caccttgaag acgtaccctg tgccattcca aagggaggat gtgaaagagt 2220

cttttgttag tctcgggcat aatgtttttg agaatgattc tttcctgcag cgtgtgatca 2280

aaacatacaa gaaaataaaa aaggactctg ctatgctttt gtctggctgt tcccacttac 2340

tgcacaacaa ggagctcatg gcctccctgg cagaaagcag ctttgatgtc atgctgacgg 2400

accctttcct tccttgcagc cccatcgtgg cccagtacct gtctctgccc actgtattct 2460

tcttgcatgc actgccatgc agcctggaat ttgaggctac ccagtgcccc aacccattct 2520

cctacgtgcc caggcctctc tcctctcatt cagatcacat gaccttcctg cagcgggtga 2580

agaacatgct cattgccttt tcacagaact ttctgtgcga cgtggtttat tccccgtatg 2640

caacccttgc ctcagaattc cttcagagag aggtgactgt ccaggaccta ttgagctctg 2700

catctgtctg gctgtttaga agtgactttg tgaaggatta ccctaggccc atcatgccca 2760

atatggtttt tgttggtgga atcaactgcc ttcaccaaaa tccactatcc caggtgtgta 2820

ttggagtggg acttttacat gcgtatattc tttcagatgt attactttgg atcgattaac 2880

tagccccaga tatatgctga gcaagcattc tgagataatt taaaatgccc tcttttgtta 2940

atttttgact cctaggtttg agtctgtctt tggcatcatc ttctggatga tttcttggta 3000

tctgagattt cgggaaagca ttccttggac attttactct gtgtgctcca gtggatagta 3060

atcaattaga aacaacaagc tgttaaatgc cataggcaca gaatgctggg tttggggcac 3120

cctgcagaaa actcagttga agcctgcacc ttgccctgga ttcagtcagg caggcaatgt 3180

tcaggactga tgaaatcatt ctttgatgat gatagatcct ggaaatgaaa gttgcctttg 3240

tgaccctggt taaagctcca gtttctaaat attctgataa gaagctaaat cctgcagtcc 3300

gttctcttct aatgagtgaa tcaccagaca gtcaggttct gacatgatac agaaaggttg 3360

taggtttcat tctcaagcta ttaggtttat ttttccccta cagagtttga agtatgcaaa 3420

aagtagcatt cacatcctca tcgaaatctc agcagaggat agaaaagaac aggagaggct 3480

ccttcagatg gagcgttagg gaattactct ttgaggaggt gacatttcag agagcgttca 3540

ttcacttatc ctgcaaagat tggctgagga tctactggca gcccaggcac ttcccaggtg 3600

ctgcgtctgg ctcccattaa ggggactgat atcaccttcg gaggtgacct tatttccact 3660

atacctccaa tgtgatttgt attttatttt ttttaatttt ctgtgcattt tccttcatag 3720

cacatcaaat atggcagcca tttcacttag atagttgttg attgtccgct tcacatcatg 3780

agccatgtgg ggacctgtgt gactttgcat taatcacatc cactgtatgc ggcgtcctca 3840

acacctgcca atgggtctgc atgtatttgg cgccccataa atctcagcac ctaaggcaca 3900

gaataggcac ccaccgaata tgtgttacat taatgaatga gaagaaaggt gccaaccgag 3960

gtctagttaa tgggtcgaga gtaatccaca atagctcttt ttagttcttt gtactccagc 4020

tattacatac caatatgtat atagaaacat atgtaaaatt ttttggttgc tttttctaca 4080

aaatagagta acagtgtatt cccactgccc acttaccgat aatgtcatgg atatcactcc 4140

agttttaaat gctattactt tttaaactat gaaatagtat ttcatggtac ttgtgtacca 4200

cagtgtattc tgctggagat ctagtctagt tccccacaga ggaacattac aatttgtatt 4260

ccaggagttt tgttgttgtg acctcaaaca cttcctttaa aaagataagc tattttgtag 4320

tttaaaaaac atttgttctg tttctttctc attcatcttt tcttaagtat tttacacggt 4380

tttttttttt tggtcactac tgtgaatgtg ttattttttt gcatttctat ctctagctga 4440

ttatctactc attactcagc tatctcatca aaatattgat tttcataata aaaaataata 4500

ggcagtcatt tgctgataaa gaaattttgg tttcttctct tataaattcc atgccaaata 4560

tcagggctat tgaatttatt agaatctcta aaaacagttg aataattctg gcaataggaa 4620

agatgcccgt cttgctgcta ttttagtgga aattgattat catttcatta ttttgcatta 4680

tgttagccat tgttttctga acaggcttta ttgatttaga taatttcctt ctttgcgtga 4740

ggatgtttgt aggagaggca ccgaacttta tcagctgcct ttctggcatt tattgatata 4800

accataaaag tctaagtggt gaactgtgtt gactacatat ttgttgttgc cttgtttggt 4860

gcagtcaggc ttaggtgtga aaatatgttt ttaaattgta ccttttagta acctgttttg 4920

tcttgttgca tgttttaatc tgaaattcca ctttttggat attaatatta ccacttctgt 4980

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tcctttttaa acaacatggc actggtattt ttaatccagt caggcagttg ctttaataag 5100

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aaagataaaa cttttattgc acaaagaagt ccatagagaa agcacaacct ggcattggcg 5400

tgtctttggt gtgtctgaag gaaaagagat agtggaacaa cattgggaga aaaggaatga 5460

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tacaaaattc ttggtaaagt ttaggagtta tgttaaatgt ctcattttgg ctggtgaagt 5820

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caatggtggg ggattggagt gttattttca gttaatatgt tgcttcactc tttggtcatt 5940

ccggtaactg tgaagtcagg gtgaagttta agggaagctt tgccaagtag gggatggact 6000

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accaccatgg catatgtatc ccagaacttc aagtaaataa taataataat aattaataat 7380

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atgggggaag ccagaagggg atggaatggg aagggtttcc cctggagtca gaccgctcag 7920

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gtaaaggaga ggaaaatgct gtaaaactta catattaata attttttact ctatctcaaa 8580

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ccagacttcc agcttccaga ttaattctct taattggaac cttagatttg gcttttccct 8940

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attgtttctt catattaaat agaagtattt ctccaaaaag ctgttggtta gaacactgaa 9180

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attcacgtag tgcatacacc cttgtaacta aacctccaaa acaagatgcc ggaagttgcc 9360

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catcgaatct tgcgaacaac acgatacttg ttaagtggct accccaaaac gatctgcttg 9600

gtatgttggg cggattggat gtataggtca aaccagggtc aaattaagaa aatggcttaa 9660

gcacagctat tctaaaggat tgttgagctt gaaaatatta tggccaacat atcctacatt 9720

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tgtgagtaac actgagtctt tggagtgttt tcagaaccta gatgtgtcca gctgtgaaac 9840

tcagagatgt aactgctgac atcctcccta ttttgcatct caggtcaccc gatgacccgt 9900

gcctttatca cccatgctgg ttcccatggt gtttatgaaa gcatatgcaa tggcgttccc 9960

atggtgatga tgcccttgtt tggtgatcag atggacaatg caaagcgcat ggagactaag 10020

ggagctggag tgaccctgaa tgttctggaa atgacttctg aagatttaga aaatgctcta 10080

aaagcagtca tcaatgacaa aaggtaagaa agaagataca gaagaatact ttggtcatgg 10140

cattcatgat aaaattgttt caaatatgaa aacatttacg tagcatttaa tagcgttgtt 10200

tcaaatataa aaacaaatac ataaaaatct ggatttttat ttcttctttt tttttttttt 10260

ttttttttga gatggagtct tgctctgtca cctaggctgg agtgcagtgg tgcaatcttg 10320

gcttactgca acctccacct cccacgttca agcagttctg cctcagcctc cgtgtagctg 10380

ggattacagg tgtccaccac cacgcccggt taatttttgt attttttagt agagaaaggg 10440

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aagataattt agaggttatt attcacttta taaaaggatt ctttagtttc tatataattt 10620

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gtccattgct ttctcccatg gttacctcct ttagaaagaa gcagcagtca ggaagacaga 11220

tgtgaagagc tggagcatgt tcagatgaga ggagacggaa cacggggaca caccagcttg 11280

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caaaaaaaaa aaaaaaaatg aaaagtccac ataacctgag catcatgtgc ccagagcgtt 11580

gggtggtgtg gtcccattcc ttccttccag cggcttcttc tggccacctc aatgtcagga 11640

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tacttgtaac ctaagaacaa cttggtgaaa gtcctctaat acattatttt ttaaaaaaac 11820

acaaatcaat gagctcaact tattaactaa ctttcatcta ttcatttttg agccatccct 11880

gtctgattgt gaatctccat gattccaaca ctctgagctg gggatagtgc ctacacaaaa 11940

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gctcaattac tattgaatga atgaatgaaa gttctggcca ggtacggtgg ctcatgcctg 12060

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caacctgacc aacatgaaga aaccttatct ctaccaaaaa aatataaaaa aattacccag 12180

gcatggtggt gtatgcctgt aatcccagct atttgggagg ctgaggcagg aaaatcactt 12240

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gccaagcagt attctacttc atggatatac caggatttat ttaaccataa cttctggttg 15360

gattcactct tattattttg tttaattaaa aaaaaaagac ctcggctggg cacagtggct 15420

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gtcaatcgga gcttaatcct gctgggtgac tctgggagcc agtggagaaa agacacccca 16020

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actgcatccc caaacttact atcagcgtgt gagggagaca ggttcccaca ccctcattag 16320

cacaaagtac tatcttgaaa aagaaagcct gtcagtttga taggagaaaa gcaggatctt 16380

gtttacaatg tgcttttatt attgttatta ttagagattg tatttctttt caagctgatg 16440

agccgtctgt gtttattttt tggaggatac cctttgccca ctttcctatt ggagtgtatt 16500

accctgagga tttggtaaga gtgcttattg cattcaccag aatgtccttt ttgtcattta 16560

ctgtattttc tctacttttt tttttttgcc ttgttttact ttttttgttt tgtattacaa 16620

gcagaagttt taaatttgta agcttcaaat tggagctggg gtggtgcaga gcgaagattt 16680

cagctggttc cctgacccca gctccatctc cttccctagg cagtggctgg aacacattct 16740

gtccactatt tccctctcta catccttgag gctgtgcagt cacccctcaa ctacgttcac 16800

cctccttcaa agcccttcct ggtccacccg gggaccatct cccggcctca ctgcccctag 16860

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<212>DNA

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<212>DNA

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<223>正向引物

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cagcagaggg gacatgaaat a 21

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<212>DNA

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<223>正向引物

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<212>DNA

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<223>正向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

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cagaggggac atgaaata 18

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>反向引物

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<212>DNA

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<212>DNA

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<212>DNA

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<220>

<223>反向引物

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<212>DNA

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<223>反向引物

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>反向引物

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aaacattatg cccgagacta ac 22

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>13

aacattatgc ccgagactaa c 21

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>14

acattatgcc cgagactaac 20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>15

cattatgccc gagactaac 19

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>16

attatgcccg agactaac 18

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>17

ttatgcccga gactaac 17

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>18

cacagaactt tctgtgcgac g 21

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>19

acagaacttt ctgtgcgacg 20

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>20

cagaactttc tgtgcgacg 19

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>21

agaactttct gtgcgacg 18

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>22

gaactttctg tgcgacg 17

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>23

aactttctgt gcgacg 16

<210>24

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>24

actttctgtg cgacg 15

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>25

cagacagatg cagagctcaa tagg 24

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>26

agacagatgc agagctcaat agg 23

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>27

gacagatgca gagctcaata gg 22

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>28

acagatgcag agctcaatag g 21

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>29

cagatgcaga gc tcaatagg 20

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>30

agatgcagag ctcaatagg 19

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>31

gatgcagagc tcaatagg 18

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>32

atgcagagct caatagg 17

<210>33

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>33

ctttttatag tcacgtgaca cagtcaaac 29

<210>34

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>34

tttttatagt cacgtgacac agtcaaac 28

<210>35

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>35

ttttatagtc acgtgacaca gtcaaac 27

<210>36

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>36

tttatagtca cgtgacacag tcaaac 26

<210>37

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>37

ttatagtcac gtgacacagt caaac 25

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>38

tatagtcacg tgacacagtc aaac 24

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>39

atagtcacgt gacacagtca aac 23

<210>40

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>40

tagtcacgtg acacagtcaa ac 22

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>41

agtcacgtga cacagtcaaa c 21

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>42

gtcacgtgac acagtcaaac 20

<210>43

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>43

tcacgtgaca cagtcaaac 19

<210>44

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>44

cacgtgacac agtcaaac 18

<210>45

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>45

acgtgacaca gtcaaac 17

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>46

cgcctttgct cctgccagag 20

<210>47

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>47

gcctttgctc ctgccagag 19

<210>48

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>48

cctttgctcc tgccagag 18

<210>49

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>49

ctttgctcct gccagag 17

<210>50

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>50

tttgctcctg ccagag 16

<210>51

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>51

catcagagac agagcatttt acac 24

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>52

atcagagaca gagcatttta cac 23

<210>53

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>53

tcagagacag agcattttac ac 22

<210>54

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>54

cagagacaga gcattttaca c 21

<210>55

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>55

agagacagag cattttacac 20

<210>56

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>56

gagacagagc attttacac 19

<210>57

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>57

agacagagca ttttacac 18

<210>58

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>58

gacagagcat tttacac 17

<210>59

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>59

tggtttattc ccagtatgca acc 23

<210>60

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>60

ggtttattcc cagtatgcaa cc 22

<210>61

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>61

tttattccca gtatgcaacc 20

<210>62

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>62

ttattcccag tatgcaacc 19

<210>63

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>63

tattcccagt atgcaacc 18

<210>64

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>64

attcccagta tgcaacc 17

<210>65

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>65

ttcccagtat gcaacc 16

<210>66

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>66

tcccagtatg caacc 15

<210>67

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>67

ccatatatat atatatataa gtaggagagg g 31

<210>68

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>68

ccatatatat atatatataa gtaggagagg 30

<210>69

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>69

ccatatatat atatatataa gtaggagag 29

<210>70

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>70

ccatatatat atatatataa gtaggaga 28

<210>71

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>71

ccatatatat atatatataa gtaggag 27

<210>72

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>72

ccatatatat atatatataa gtagga 26

<210>73

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>73

ccatatatat atatatataa gtagg 25

<210>74

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>74

ggggacatga aatagttgtc ctagcacctg acgc 34

<210>75

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>75

gggacatgaa atagttgtcc tagcacctga cgc 33

<210>76

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>76

ggacatgaaa tagttgtcct agcacctgac gc 32

<210>77

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>77

gacatgaaat agttgtccta gcacctgacg c 31

<210>78

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>78

acatgaaata gttgtcctag cacctgacgc 30

<210>79

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>79

catgaaatag ttgtcctagc acctgacgc 29

<210>80

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>80

atgaaatagt tgtcctagca cctgacgc 28

<210>81

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>81

tgaaatagtt gtcctagcac ctgacgc 27

<210>82

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>82

gaaatagttg tcctagcacc tgacgc 26

<210>83

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>83

aaatagttgt cctagcacct gacgc 25

<210>84

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>84

aatagttgtc ctagcacctg acgc 24

<210>85

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>85

atagttgtcc tagcacctga cgc 23

<210>86

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>86

tagttgtcct agcacctgac gc 22

<210>87

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>87

agttgtccta gcacctgacg c 21

<210>88

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>88

gttgtcctag cacctgacgc 20

<210>89

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>89

ttgtcctagc acctgacgc 19

<210>90

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>90

tgtcctagca cctgacgc 18

<210>91

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>91

caaaagactc tttcacatcc tccctttgg 29

<210>92

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>92

ccttttcaca gaactttctg tgcgacg 27

<210>93

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>93

cttttcacag aactttctgt gcgacg 26

<210>94

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>94

ttttcacaga actttctgtg cgacg 25

<210>95

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>95

tttcacagaa ctttctgtgc gacg 24

<210>96

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>96

ttcacagaac tttctgtgcg acg 23

<210>97

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>97

tcacagaact ttctgtgcga cg 22

<210>98

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>98

gccagacaga tgcagagctc aatagg 26

<210>99

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>99

ccagacagat gcagagctca atagg 25

<210>100

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>100

gggttgcata ctgggaataa ac 22

<210>101

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>101

ggttgcatac tgggaataaa 20

<210>102

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>102

gttgcatact gggaataaac 20

<210>103

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>103

ttgcatactg ggaataaac 19

<210>104

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>104

tgcatactgg gaataaac 18

<210>105

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>105

gcatactggg aataaac 17

<210>106

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>106

ccgagactaa caaaagactc tttcacatcc tccctttgg 39

<210>107

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>107

cgagactaac aaaagactct ttcacatcct ccctttgg 38

<210>108

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>108

gagactaaca aaagactctt tcacatcctc cctttgg 37

<210>109

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>109

agactaacaa aagactcttt cacatcctcc ctttgg 36

<210>110

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>110

gactaacaaa agactctttc acatcctccc tttgg 35

<210>111

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>111

actaacaaaa gactctttca catcctccct ttgg 34

<210>112

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>112

ctaacaaaag actctttcac atcctccctt tgg 33

<210>113

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>113

taacaaaaga ctctttcaca tcctcccttt gg 32

<210>114

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>114

aacaaaagac tctttcacat cctccctttg g 31

<210>115

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>115

acaaaagact ctttcacatc ctccctttgg 30

<210>116

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>116

aaaagactct ttcacatcct ccctttgg 28

<210>117

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>117

aaagactctt tcacatcctc cctttgg 27

<210>118

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>118

aagactcttt cacatcctcc ctttgg 26

<210>119

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>119

agactctttc acatcctccc tttgg 25

<210>120

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>120

gactctttca catcctccct ttgg 24

<210>121

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>121

actctttcac atcctccctt tgg 23

<210>122

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>122

ctctttcaca tcctcccttt gg 22

<210>123

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>123

agctttttat agtcacgtga cacagtcaaa c 31

<210>124

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>124

gctttttata gtcacgtgac acagtcaaac 30

Claims

1.一种UGT1A1基因扩增用引物对，其特征在于，

所述UGT1A1基因扩增用引物对包括：

包含由序列号4的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号13的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(1)、

包含由序列号21的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号29的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(2)、以及

包含由序列号42的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号48的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(3)；

或者

包含由序列号81的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号91的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(1)、

包含由序列号92的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号98的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(2)、以及

包含由序列号123的寡核苷酸构成的正向引物和由序列号46的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(3)。

2.根据权利要求1所述的UGT1A1基因扩增用引物对，所述UGT1A1基因扩增用引物对是用于扩增生物试样中的UGT1A1基因的引物对。

3.根据权利要求2所述的UGT1A1基因扩增用引物对，所述生物试样是全血。

4.一种UGT1A1基因扩增用试剂，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增UGT1A1基因的试剂，含有权利要求1所述的UGT1A1基因扩增用引物对。

5.根据权利要求4所述的UGT1A1基因扩增用试剂，其还含有能与UGT1A1基因的检测对象部位杂交的探针。

6.根据权利要求5所述的UGT1A1基因扩增用试剂，所述探针是由下述(P1’)的寡核苷酸构成的探针、由下述(P2’)的寡核苷酸构成的探针、和由下述(P3’)的寡核苷酸构成的探针中的至少两种探针：

(P1’)：由序列号55的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号56的碱基序列构成的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸；

(P2’)：由序列号62的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号102的碱基序列构成的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸；

(P3’)：由序列号69的碱基序列构成的寡核苷酸。

7.根据权利要求5所述的UGT1A1基因扩增用试剂，所述探针是荧光标记探针。

8.一种扩增产物的制备方法，其特征在于，其为通过基因扩增法制备UGT1A1基因的扩增产物的方法，含有下述步骤(I)：

(I)以试样中的核酸作为模板，使用权利要求1所述的UGT1A1基因扩增用引物对，在反应液中扩增所述UGT1A1基因的步骤。