CN102816858B - 一种检测ugt1a1基因型的引物和探针、及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测UGT1A1基因型的引物及其试剂盒。所述引物的核苷酸序列为：上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，下游引物为由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列本发明的试剂盒操作简单，检测速度快；灵敏度高，最低检出限为50ng/μl基因组DNA并可通过基因扫描技术能检测出UGT1A1所有基因型。
Description
技术领域
本发明涉及基因型的检测，具体讲，涉及一种检测UGT1A1基因型的引物和探针、及其试剂盒。
背景技术
个体化治疗是基于药物基因组Pharmaco-genomics发展起来的，在肿瘤治疗中扮演越来越重要的角色。个体化治疗是指通过检测肿瘤的靶标或患者的遗传因素，了解患者对药物敏感性及耐受性，从而指导合理用药、提高用药的安全性和有效性、避免不良反应、减少药物治疗的费用和风险。简而言之，个体化治疗的目标就是：在合适的时间，对合适的人，使用合适的药物，处方合适的剂量。
伊立替康(Irinotecan，CPT-11，商品名为开普拓、Camptosar)，是DNA拓扑异构酶I抑制剂，可诱导单链DNA损伤，从而阻断DNA复制叉，阻止DNA链的重新组装，引起DNA双链的断裂，造成细胞死亡。伊立替康主要用于治疗成人晚期/转移性大肠癌，对小细胞和非小细胞肺癌及宫颈癌和卵巢癌亦有疗效。伊立替康最主要的毒副作用为嗜中性白血球减少症及迟发性腹泻，后者为剂量限制性毒副反应，严重时可致命。临床研究表明，40％以上接受伊立替康治疗的患者可出现3～4级迟发性腹泻，约10％患者可出现嗜中性白血球减少症，从而导致化疗方案的提前中止。
伊立替康为前体药物，在体内经过羧酸酯酶转化为活性代谢物。羧酸酯酶将伊立替康分子10位的哌啶侧链裂解，产生7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)，其活性较伊立替康强100到1000倍。SN-38经肝脏尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-GT，主要由UGT1A1、UGT1A7和UGT1A9代谢)葡萄糖醛酸化灭活，生成葡萄糖醛酸化SN-38(SN-38G)，从而保护健康细胞免受伊立替康毒性的影响。
UGT1A1基因编码尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶，其多态性最常发生在TATA启动子区，表现为易变的TA重复。野生启动子序列有6个TA重复(TA)6，也被称为UGT1A1*1，三个变异等位基因分别为5、7、8三种TA重复——(TA)5、(TA)7、(TA)8。其中(TA)7多态性(也叫UGT1A1*28)最常见，(TA)5和(TA)8多态性少见。突变型UGT1A1*28的杂合子比野生型对SN-38的葡萄糖醛苷化活性稍低，而UGT1A1*28的突变纯合子对SN-38的葡萄糖醛苷化活性则仅是野生型的35％，从而更容易产生毒副作用。野生型UGT1A1(6/6)在接受伊立替康治疗时产生毒副作用风险较低，而UGT1A1*28突变型杂合子(6/7)产生毒副作用的几率为12.5％，突变型纯合子(7/7)则有50％产生毒副作用的可能性。该突变的影响是与剂量相关的，在使用低剂量伊立替康治疗时，UGT1A1突变与否对毒副作用的风险影响大。
因此，2005年，美国FDA要求在伊立替康药品标签上加入警示，建议患者在使用伊立替康前先检测是否带有UGT1A1*28突变。在中国人中，野生型纯合子(6/6)、杂合子(6/7)和突变型纯合子(7/7)的发生频率分别为70.2％、27.7％和2.1％。
为此，发明人根据我国人口突变特点，设计并制造了一种检测UGT1A1基因型的引物和探针、及其试剂盒。
发明内容
本发明涉及一种检测UGT1A1基因型的引物和探针、试剂盒。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种检测UGT1A1基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列为：上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，下游引物为由SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。
本发明还涉及一种含有述检测UGT1A1基因型的引物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、PCR对照品、Genscan对照品；其中，核酸扩增试剂为：
表1：
| 序号 | 组份 | 组份中的主要成份 |
| 1 | UGT1A1 MIX-1管 | 引物、荧光引物、dNTPs、buffer |
| 2 | UGT1A1 MIX-2管 | Taq酶、UNG酶 |
本发明试剂盒的第一优选技术方案为，所述的核酸扩增试剂中，
UGT1A1 MIX-1中含有6mmol/L引物各1ul、5mM的dNTPs 0.5ul、10×buffer 50μ，共计25μl
所述的UGT1A1 MIX-2中含有Taq酶5u/反应、UNG0.5u/反应。
本发明试剂盒的第二优选技术方案为，所述的PCR对照品为：
表2：
| 序号 | 组份 | 组份中的主要成份 |
| 3 | UGT1A1阴性对照管 | 工艺用水； |
| 4 | UGT1A1 PCR阳性对照管 | 质粒DNA混合液； |
其中，UGT1A1 PCR阳性对照管中含有：靶基因序列克隆的UGT1A1-TA6质粒DNA与UGT1A1-TA7质粒DNA的混合液，1∶1混合，浓度为0.1pg/ul；UGT1A1-TA6质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，UGT1A1-TA7质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明试剂盒的第三优选技术方案为，所述的Genscan对照品为：
表3：
| 序号 | 组份 | 组份中的主要成份 |
| 5 | UGT1A1 Genscan阳性对照管 | DNA片段混合液； |
其中，UGT1A1 Genscan阳性对照管中含有：5’端带ROX荧光修饰的SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列与5’端带ROX荧光修饰的SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的混合液，浓度5ng/ul。
本发明试剂盒的第四优选技术方案为，所述试剂盒对检测样本的要求为，所述检测样本为人类基因组DNA，OD260/OD280在1.8～2.0，DNA总量在3～15μg，稀释DNA的终浓度至50～125ng/μl，优选75ng/μl。
本发明还涉及试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)扩增试剂准备：
取UGT1A1 MIX-1管、UGT1A1 MIX-2管，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心5～15s；
配制反应体系：21μl的UGT1A1 MIX-1与1μl的UGT1A1 MIX-2混合，加入到PCR反应管中，得到PCR预混液，配制多管，存于0～4℃；
(2)加样：
从UGT1A1阴性对照管、UGT1A1 PCR阳性对照管和样本处理液管中各取3μl，分别加至装有步骤(1)制备的PCR预混液的离心管中，进行扩增和检测；
(3)PCR扩增：反应体系为25μl；
PCR扩增条件为：
表4：
(4)毛细管电泳：根据不同型号测序仪的要求，将PCR产物适量稀释后，与UGT1A1 Genscan阳性对照、荧光标记的标准分子量内标和HIDI混合、变性后，上测序仪进行毛细管电泳；
(5)计算机自动处理和分析数据。
本发明的试剂盒的结果判定方法为：
(1)有效性判定：
a.Genscan有效性判断：
在322～330bp范围内，UGT1A1 Genscan阳性对照在325、327bp位置收集到ROX荧光信号，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3，判定为有效；
b.PCR有效性判断：
在322～330bp范围内，阴性对照未收集到任何荧光信号；UGT1A1 PCR阳性对照在Genscan阳性对照相同位置收集到FAM荧光信号，荧光信号高度高于或等于Genscan阳性对照，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3，判定为有效；
(2)结果判定：
在322～330bp范围内，
d.当标本检测中收集到两个荧光信号，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3，则这两个峰均判为有效；若两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比＞3，则高峰判为有效峰，低峰判为无效峰；
有效峰中至少有一个的荧光信号高度≥Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则按检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
e.当标本检测中收集到一个荧光信号，且荧光信号高度≥Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则按检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
f.当标本检测中的未收集到荧光信号则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
检验结果判定表：
表5：
下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：
本发明采用了基因扫描技术，其原理为，在一条PCR引物的5′端标记荧光染料，在PCR扩增时，PCR产物带上荧光标记，然后采用高分辨率胶电泳(如用于测序的毛细管电泳等)对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统(如ABI测序仪)确定扩增片断的长度，实现对目的片断长度多态性的分型。
注意事项：
1)因FQ-PCR为高灵敏度的实验，需严格按照PCR实验室的操作规范分区操作，并注意防污染。
2)本试剂盒检测标本为人基因组DNA，操作者均应将之视为潜在传染源，并严格按照生物制品安全操作规范操作。
3)本试剂盒应需-20℃冷冻保存，并尽量避免反复冻融，试剂解冻完请混匀后再使用。
4)本品仅用于体外诊断，测试结果仅供辅助诊断，对实验结果解释需与临床相结合。
本发明的试剂盒的技术优势为：
一、操作简单，检测速度快。一般PCR产物需通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和紫外光进行观察，阳性PCR产物再进行产物纯化、测序。整个实验过程至少需要两个工作日的时间，且染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的过程给污染和假阳性提供了机会。而本试剂盒只须在PCR结束后直接上机进行毛细管电泳，需三到四个小时即可获得结果，因此操作简便、省时、减少污染。
二、灵敏度高。利用特异性荧光引物，通过激光激发荧光，荧光信号被CCD收集进行分析，与溴化乙锭染色和紫外光进行观察相比，灵敏度大为提高。最低检出限为50ng/μl基因组DNA。
三、基因扫描技术能检测出UGT1A1所有基因型。野生型UGT1A1(6/6)在接受伊立替康治疗时产生毒副作用风险较低，而UGT1A1*28突变型杂合子(6/7)产生毒副作用的几率为12.5％，突变型纯合子(7/7)则有50％产生毒副作用的可能性。因此，2005年，美国FDA要求在伊立替康药品标签上加入警示，建议患者在使用伊立替康前先检测是否带有UGT1A1*28突变。
为了帮助临床医生们准确及时地了解患者UGT1A1基因型情况，以确定相关治疗方案，发明人设计并开发了UGT1A1基因型检测试剂盒(PCR毛细管电泳法)，该试剂盒利用特异性荧光引物，采用PCR体外扩增的方法对UGT1A1基因型进行定性检测，从而指导伊立替康用药，降低医生治疗风险以及患者经济负担。
本发明对PCR扩增体系和扩增条件做了优化，对模板量等方面做了研究，保证在使用病人样本最少的前提下，最大程度地对病人的UGT1A1基因型进行准确定性和分型。
采用质控品对本发明的试剂盒做性能检测，操作严格按照说明书进行，特异性质控品符合率100％；准确性质控品符合率100％；各精密度质控品，在相应的反应液中重复做10次，结果符合拟定的检定标准。
本发明通过稳定性试验，包括常规稳定性、开盖稳定性和运输稳定性试验，根据实验结果确定了试剂盒的储存条件和有效期：-20℃条件下避光保存，有效期12个月。
本发明UGT1A1基因型检测试剂盒(PCR毛细管电泳法)采用PCR结合荧光引物技术，通过毛细管电泳，对人基因组DNA中的UGT1A1*28位点的基因型进行定性检测，因此能检测出包括TA5或TA8型等的所有UGT1A1基因型，通过临床考核，并用金标准进行比照实验，结果表明，阴阳性符合率好，适于临床推广。
附图说明：
图1到图10为实施例2得到的结果图。
本发明的具体实施方式仅限于对本发明的做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。
具体实施方式
实施例1
检测UGT1A1基因型的试剂盒，其组成为：
表6：
其中：
管1中含有：6mmol/L引物各20ul、100mM的dNTPs 0.5ul、10×buffer 50μl；上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，下游引物为由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
管2中含有Taq酶100u、UNG酶10u；
管3中含有工艺用水10μl；
管4中含有靶基因序列克隆的UGT1A1-TA6质粒DNA与UGT1A1-TA7质粒DNA的混合液10μl，1∶1混合，浓度为0.1pg/ml；UGT1A1-TA6质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，UGT1A1-TA7质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
管5中含有：5’端带ROX荧光修饰的UGT1A1-TA6DNA片段与5’端带ROX荧光修饰的UGT1A1-TA7DNA片段混合液10μl，浓度5ng/ul；
引物序列为：
表7：
Ug-F1 Fam-5’-GTGAACTCCCTGCTAC-3’
Ug-R1 AACTATTTCATGTCCCCTCTGC
质粒DNA片段的序列为：
UGT1A1-TA6的DNA片段的核苷酸序列为：
GGTAACACTTGTTGGTCTGTGGAAATACTAATTTAATGGATCCTGAGGTTCTGGAAGTACTTTGCTGTGTTCACTCAAGAATGTGATTTGAGTATGAAATTCCAGCCAGTTCAACTGTTGTTGCCTATTAAGAAACCTAATAAAGCTCCACCTTCTTTATCTCTGAAAGTGAACTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGCTTTTTATAGTCACGTGACACAGTCAAACATTAACTTGGTGTATCGATTGGTTTTTGCCATATATATATA TATAAGTAGGAGAGGGCGAACCTCTGGCAGGAGCAAAGGCGCCATGGCTGTGGAGTCCCAGGGCGGACGCCCACTTGTCCTGGGCCTGCTGCTGTGTGTGCTGGGCCCAGTGGTGTCCCATGCTGGGAAGATACTGTTGATCCCAGTGGATGGCAGCCACTGGCTGAGCATGCTTGGGGCCATCCAGCAGCTGCAGCAGAGGGGACATGAAATAGTTGTCCTAGCACCTG
UGT1A1-TA7的DNA片段的核苷酸序列为：
GGTAACACTTGTTGGTCTGTGGAAATACTAATTTAATGGATCCTGAGGTTCTGGAAGTACTTTGCTGTGTTCACTCAAGAATGTGATTTGAGTATGAAATTCCAGCCAGTTCAACTGTTGTTGCCTATTAAGAAACCTAATAAAGCTCCACCTTCTTTATCTCTGAAAGTGAACTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGACAGCTTTTTATAGTCACGTGACACAGTCAAACATTAACTTGGTGTATCGGATTGGGTTTTTGCCATATATATATA TATATAAGTAGGAGAGGGCGAACCTCTGGCAGGAGCAAAGGCGCCATGGCTGTGGAGTCCCAGGGCGGACGCCCACTTGTCCTGGGCCTGCTGCTGTGTGTGCTGGGCCCAGTGGTGTCCCATGCTGGGAAGATACTGTTGATCCCAGTGGATGGCAGCCACTGGCTGAGCATGCTTGGGGCCATCCAGCAGCTGCAGCAGAGGGGACATGAAATAGTTGTCCTAGCACCTG
试剂盒的储存条件为：-20℃条件下避光保存，有效期12个月。
试剂盒的适用仪器为：BIO-RAD系列PCR检测仪和ABI系列PCR检测仪；ABI系列基因分析仪。
样本要求为：人类基因组DNA，优选Qiagen公司的试剂盒来提取，OD260/OD280在1.8～2.0，所提DNA总量在3-15μg，稀释DNA的终浓度至50-125ng/μl，优选推荐稀释至75ng/μl，作为模板待用。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请与-20℃以下保存，以防止DNA降解。
检验方法为：
1.仪器准备：将每台仪器接通电源，检查是否运转正常。
2.扩增试剂准备：
从试剂盒中取出UGT1A1 MIX-1、UGT1A1 MIX-2，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s；
反应体系配制如下：21μl的UGT1A1 MIX-1与1μl的UGT1A1 MIX-2混合，注意PCR管数应为样本数、2个对照之和；
用微量加样器在每一PCR反应管内分别各自加入22μl上述混匀后的反应液，存于4℃。
3.加样：
从UGT1A1阴性对照、UGT1A1 PCR阳性对照和样本处理液中各取3μl，分别加至装有PCR预混液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区；
4.PCR扩增：反应体系为25μl；
PCR扩增条件为：
表8：
5.毛细管电泳：
根据不同型号测序仪的要求，将PCR产物适量稀释后，与UGT1A1 Genscan阳性对照、荧光标记的标准分子量内标和HIDI混合、变性后，上测序仪进行毛细管电泳。
优选条件为：PCR产物稀释3～5倍，再分别将0.5μl稀释后的PCR产物、0.5μl UGT1A1 Genscan阳性对照与0.5μl GenescanTM 500
Size Standard和10μl HIDI混合，如果结果低于检出极限，则直接使用不稀释的PCR产物重新上样检测。
计算机自动处理和分析数据。
本试剂盒对含50ng/μl浓度以上的人基因组DNA样本，能准确分型。
检测结果的判定方法：
1.有效性判定：
a.Genscan有效性判断：
在322～330bp范围内，UGT1A1 Genscan阳性对照((TA)6/(TA)7杂合基因型)在325、327bp位置收集到ROX荧光信号(片段大小误差＜1bp)，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3；
b.PCR有效性判断：
在322～330bp范围内，阴性对照未收集到任何荧光信号；UGT1A1 PCR阳性对照((TA)6/(TA)7杂合基因型)在Genscan阳性对照相同位置收集到FAM荧光信号，荧光信号高度高于或等于Genscan阳性对照，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3；
2.结果判定：
在检测范围内(322～330bp)，
①当标本检测中收集到两个荧光信号，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3，则这两个峰均判为有效；若两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比＞3，则高峰判为有效峰，低峰判为无效峰；
有效峰中至少有一个的荧光信号高度≥Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则可按下列检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
②当标本检测中收集到一个荧光信号，且荧光信号高度≥Genscan阳性对照低峰的荧光信号高度，则可按下列检验结果判定表进行判断；反之，则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
③当标本检测中的未收集到荧光信号则判为标本质量不符合检测要求，低于本试剂盒最低检出极限，需重新进行实验；
表9：
实施例2
采用实施例1的试剂盒对样本进行检测。
1.样本提取：样本1～10采用Qiagen公司的试剂盒来对样本进行提取，
该样本的OD260/OD280在1.8～2.0，所提DNA总量在3～15μg，稀释DNA的终浓度至75ng/μl，作为模板待用。
2.检验方法：
1.仪器准备：将每台仪器接通电源，检查是否运转正常。
2.扩增试剂准备：
从试剂盒中取出UGT1A1 MIX-1、UGT1A1 MIX-2，室温融化并振荡混匀后，2000rpm离心10s；
反应体系配制如下：21μl的UGT1A1 MIX-1与1μl的UGT1A1 MIX-2混合，注意PCR管数应为样本数、2个对照之和；
用微量加样器在每一PCR反应管内分别各自加入22μl上述混匀后的反应液，存于4℃。
3.加样：
从UGT1A1阴性对照、UGT1A1 PCR阳性对照和样本处理液中各取3μl，分别加至装有PCR预混液的离心管中，盖紧管盖、将其移至检测区；
4.PCR扩增：反应体系为25μl；
PCR扩增条件为：
表10：
5.毛细管电泳：
根据不同型号测序仪的要求，PCR产物稀释3～5倍，再分别将0.5μl稀释后的PCR产物、0.5μl UGT1A1Genscan阳性对照与0.5μl GenescanTM 500Size Standard和10μl HIDI混合，变性后，上测序仪进行毛细管电泳。如果结果低于检出极限，则直接使用不稀释的PCR产物重新上样检测。
计算机自动处理和分析数据，实验结果如图1～图10所示。
本试剂盒对含50ng/μl浓度以上的人基因组DNA样本，能准确分型。
检测结果的解释
1.有效性判定：
a.Genscan有效性判断：
在322～330bp范围内，UGT1A1 Genscan阳性对照((TA)6/(TA)7杂合基因型)在325、327bp位置收集到ROX荧光信号(片段大小误差＜1bp)，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3；
b.PCR有效性判断：
在322～330bp范围内，阴性对照未收集到任何荧光信号；UGT1A1 PCR阳性对照((TA)6/(TA)7杂合基因型)在Genscan阳性对照相同位置收集到FAM荧光信号，荧光信号高度高于或等于Genscan阳性对照，且两个位置的高峰与低峰的荧光信号高度比≤3；
2.结果判定：
表11：
Claims (3)
1.一种检测UGT1A1基因型的引物，其中，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物为5’端连接Fam基团的SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，
下游引物为由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.一种含有权利要求1所述检测UGT1A1基因型的引物的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括核酸扩增试剂、PCR对照品和Genscan对照品：
其中，UGT1A1PCR阳性对照管中含有：靶基因序列克隆的UGT1A1-TA6质粒DNA与UGT1A1-TA7质粒DNA的混合液，1:1混合，浓度为0.1pg/ul；
UGT1A1-TA6质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，UGT1A1-TA7质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
其中，UGT1A1Genscan阳性对照管中含有：5’端带ROX荧光修饰的SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列与5’端带ROX荧光修饰的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的混合液，浓度5ng/ul。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸扩增试剂中，
UGT1A1MIX-1中含有6mmol/L引物各1ul、5mM的dNTPs0.5ul和10×buffer50μ，共计25μl；
所述的UGT1A1MIX-2中含有Taq酶5u/反应和UNG酶0.5u/反应。
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