CN114592054B - 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法 - Google Patents

用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法；扩增引物组及探针包括：ADRB2‑rs1042713野生型正向引物ADRB2_F1、ADRB2‑rs1042713突变型正向引物ADRB2_F2、ADRB2‑rs1042713共用反向引物ADRB2_R、ADRB2‑rs1042713共用探针ADRB2_P；GLCCI1‑rs37973野生型正向引物GLCCI1_F1、GLCCI1‑rs37973突变型正向引物GLCCI1_F2、GLCCI1‑rs37973共用反向引物GLCCI1_R、GLCCI1‑rs37973共用探针GLCCI1_P；CRHR2‑rs7793837野生型正向引物CRHR2_F1、突变型正向引物CRHR2_F2、共用反向引物CRHR2_R、共用探针CRHR2_P；扩增引物组具有良好的扩增特异性，检测灵敏度高、检测时间短，检测成本低。

Description

用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试 剂盒、使用方法
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，具体涉及用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒、使用方法。
背景技术
哮喘(Asthma)，又称气喘，是一种常见的呼吸道慢性炎症疾病，主要特征是多变和复发的症状、可逆性气流阻塞和支气管痉挛。常见症状表现为喘息、咳嗽、胸腔紧迫、胸闷和呼吸困难。统计数据表明，2018年我国20岁以上人群哮喘患病率为4.2％，患者总数达4570万人，并且超过七成的患者未被诊断。
目前尚无治疗哮喘的特效办法，但坚持长期规范化治疗可使哮喘症状得到良好控制，减少复发甚至不再发作。市面上常用的抗哮喘药物主要有六大类，包括糖皮质激素类、β2受体激动剂、白三烯调节剂、茶碱类药物、抗胆碱药物、IgE抗体和酮替芬。但是，哮喘的治疗效果和不良反应在个体间存在很大的差异，造成这些差异的主要原因是每个人携带基因的不同。例如，ADRB2基因位于第五号染色体5q31-32上，编码β2肾上腺素能受体，其rs1042713位点的多态性会影响患者对β2受体激动剂的治疗效果，其中AG和GG基因型患者对β2受体激动剂的反应明显高于AA基因型患者。在中国，携带AA基因型的患者高达32.1％，对于这些患者应尽量避免沙丁胺醇等β2受体激动剂的使用，更换其他药物。同时，促肾上腺皮质素释放激素受体2由CRHR2基因编码，其rs7793837位点的多态性也会影响患者对β2受体激动剂的反应，研究表明，与携带TT和TA基因型的患者相比，携带AA基因型的患者在接受短效β2受体拮抗剂治疗时有更好的反应。另外GLCCI1 rs37973位点的多态性也影响着哮喘患者对糖皮质激素类药物的反应，AG和GG基因型患者在接受吸入性糖皮质激素治疗时发生不良反应风险的概率明显高于AA基因型患者。
目前大多研究集中于哮喘易感基因检测试剂盒的开发，抗哮喘药物相关基因的研究较为匮乏。例如，中国专利CN113215245A公开的一种用于儿童哮喘个体化用药的基因检测试剂盒及其应用，通过二代测序的方法，检测了儿童哮喘个体化用药的31个相关基因，虽然该方法精准度高，但是时效性较差、成本较高，且检测项目较为冗余。另外，中国专利CN109837339A公开了用于儿童安全用药相关基因检测的引物组、探针组、试剂盒及方法，通过TaqMAN-MGB探针分型技术检测了GLCCI1 rs37973位点的多态性，虽然该方法简单快速，但仅检测了一个与哮喘用药相关的位点，不够全面。
发明内容
有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针，包括：ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针和CRHR2-rs7793837的ARMS引物组及探针；其中，
所述ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针包括：
ADRB2-rs1042713野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：01所示；
ADRB2-rs1042713突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：02所示；
ADRB2-rs1042713共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：03所示；
ADRB2-rs1042713共用探针，其序列如SEQ ID NO：04所示；
所述GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针包括：
GLCCI1-rs37973野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：05所示；
GLCCI1-rs37973突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：06所示；
GLCCI1-rs37973共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：07所示；
GLCCI1-rs37973共用探针，其序列如SEQ ID NO：08所示；
所述CRHR2-rs7793837位点的ARMS引物组及探针包括：
CRHR2-rs7793837野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：09所示；
CRHR2-rs7793837突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：10所示；
CRHR2-rs7793837共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：11所示；
CRHR2-rs7793837共用探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。
另一方面，一些实施例公开了用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，包括用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组。
进一步，一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，还包括PCR扩增试剂。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，包括扩增引物组、探针和PCR扩增试剂的扩增反应体系配置为：
Figure BDA0003590693340000031
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，包括利用基因检测试剂盒对待测样本的基因进行扩增。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，利用ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837的ARMS引物组及探针对待测样本的相应基因分别进行扩增。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，对待测样本的基因进行扩增的扩增反应体系为：
Figure BDA0003590693340000032
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测的扩增引物组及探针的使用方法，包括利用扩增引物组及探针对待测样本的基因分别进行扩增。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测的扩增引物组及探针的使用方法，包括利用ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837的ARMS引物组及探针对待测样本的相应基因分别进行扩增。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测的扩增引物组及探针的使用方法，对待测样本的基因进行扩增的扩增反应体系为：
Figure BDA0003590693340000041
本申请实施例公开的用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针、检测试剂盒，提供了基于突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)的ADRB2-rs1042713基因位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973基因位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及探针；扩增引物组具有良好的扩增特异性，检测灵敏度高、检测时间短，检测成本低，保证哮喘患者用药的安全性和有效性，能实现对哮喘个体化用药相关基因的分型检测，达到个体化用药的目的。
附图说明
图1 ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973和CRHR2-rs7793837位点基因型分别为AA、AG和AT的样本扩增结果；
图2 ADRB2-rs1042713位点基因型为GG的样本扩增结果；
图3 ADRB2-rs1042713位点基因型为AA的样本扩增结果；
图4 ADRB2-rs1042713位点基因型为AG的样本扩增结果；
图5 GLCCI1-rs37973位点基因型为GG的样本扩增结果；
图6 GLCCI1-rs37973位点基因型为AA的样本扩增结果；
图7 GLCCI1-rs37973位点基因型为AG的样本扩增结果；
图8 CRHR2-rs7793837位点基因型为TT的样本扩增结果；
图9 CRHR2-rs7793837位点基因型为AA的样本扩增结果；
图10 CRHR2-rs7793837位点基因型为AT的样本扩增结果。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本申请实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本申请中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本申请公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本申请中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。本文中，正向引物用“F”表示，又称为上游引物，反向引物用“R”表示，又称为下游引物。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本申请内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本申请同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本申请的主旨。
在不冲突的前提下，本申请实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本申请实施例公开的内容。
在一些实施方式中，用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针，包括：ADRB2-rs1042713基因位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973基因位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及探针；其中：
ADRB2-rs1042713基因位点的ARMS引物组及探针包括：ADRB2-rs1042713野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：01所示；ADRB2-rs1042713突变型正向引物，其序列如SEQ IDNO：02所示；ADRB2-rs1042713共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：03所示；ADRB2-rs1042713共用探针，其序列如SEQ ID NO：04所示；
GLCCI1-rs37973基因位点的ARMS引物组及探针包括：GLCCI1-rs37973野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：05所示；GLCCI1-rs37973突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：06所示；GLCCI1-rs37973共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：07所示；GLCCI1-rs37973共用探针，其序列如SEQ ID NO：08所示；
CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及探针包括：CRHR2-rs7793837野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：09所示；CRHR2-rs7793837突变型正向引物，其序列如SEQ IDNO：10所示；CRHR2-rs7793837共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：11所示；CRHR2-rs7793837共用探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。
基于突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)，发明人基于错配碱基的替换原则进行ARMS引物设计，在使用一般耐热DNA聚合酶(缺乏外切校正活性)的条件下PCR引物3’末端错配导致产物急剧减少，根据已知的突变位点设计相应的ARMS引物，其3’端碱基分别与野生型和突变型的模板碱基互补，分别对待测样本进行荧光PCR并监测扩增曲线可以直接达到区别野生型和突变型基因的目的。
所设计的ARMS扩增引物提高了扩增的特异性；而且灵敏度高，最低仅需10ng DNA模板量，即可完成对人DNA样本的分型；检测用时短，不足1h即可完成对的待测样本的分型；成本较低，所使用的试剂耗材在临床上较为常用，成本较低，便于临床的推广。
一些实施方式中，用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒包括用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组。
一些实施方式中，用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒还包括PCR扩增试剂。
一般地，用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒包括扩增引物组及探针，以及与扩增引物组配套使用的扩增试剂，扩增引物组及探针和扩增试剂组成扩增反应体系，进行扩增反应。
作为可选实施例，扩增反应体系的配置如表1所列。
表1扩增反应体系配置
Figure BDA0003590693340000071
一般地，配置扩增体系分为野生型反应体系和突变型反应体系两个独立的扩增反应体系，表1中的扩增反应体系统一适用于野生型反应体系和突变型反应体系；例如，对于野生型反应体系，2×Taq Pro HS U Probe Master Mix包括PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；Primer Forward Mix是指包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的野生型上游引物混合物；Primer Reverse Mix是指包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的下游引物混合物；ProbeMix是指ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个位点荧光探针的混合物；对于突变型反应体系，Taq Pro HS U Probe Master Mix包括PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；Primer Forward Mix是指包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的突变型上游引物混合物；Primer Reverse Mix是指包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的下游引物混合物；ProbeMix是指三个位点荧光探针的混合物。
扩增试验
为了验证设计的扩增引物组的基因分型效果，进行如下试验：
(1)样品处理和核酸提取
使用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，并使用分光光度计对提取的DNA进行浓度和纯度测定，其中，当待测样本的OD260/OD280为1.8～2.0即为合格样品，方可进行后续实验。
(2)配置扩增反应体系
在两个扩增管中，分别配置野生型扩增反应体系和突变型扩增反应体系，配置体系参考本文表1，使用的引物及探针为ADRB2-rs1042713基因位点的ARMS引物组及其共用探针、GLCCI1-rs37973基因位点的ARMS引物组及其共用探针和CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及其共用探针；其中：
ADRB2-rs1042713基因位点的ARMS引物组及探针包括：ADRB2-rs1042713野生型正向引物ADRB2_F1、ADRB2-rs1042713突变型正向引物ADRB2_F2、ADRB2-rs1042713共用反向引物ADRB2_R、ADRB2-rs1042713共用探针ADRB2_P；具体序列见表2；
GLCCI1-rs37973基因位点的ARMS引物组及探针包括：GLCCI1-rs37973野生型正向引物GLCCI1_F1、GLCCI1-rs37973突变型正向引物GLCCI1_F2、GLCCI1-rs37973共用反向引物GLCCI1_R、GLCCI1-rs37973共用探针GLCCI1_P；具体序列见表2；
CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及探针包括：CRHR2-rs7793837野生型正向引物CRHR2_F1、突变型正向引物CRHR2_F2、共用反向引物CRHR2_R、共用探针CRHR2_P；具体序列见表2。
表2扩增引物组序列列表
引物名称 序列 序列号
ADRB2_F1 5’-CTTGCTGGCACCCATTG-3’ SEQ ID NO：01
ADRB2_F2 5’-TCTTGCTGGCACCCTATA-3’ SEQ ID NO：02
ADRB2_R 5’-CAGGCCAGTGAAGTGATGAA-3’ SEQ ID NO：03
ADRB2-P 5’FAM-CATCGTCATGTCTCTCATCGTCCTG-3’BHQ1 SEQ ID NO：04
GLCCI1-F1 5’-AGAAATGTCTGGAACCTTCAC-3’ SEQ ID NO：05
GLCCI1-F2 5’-AGAAATGTCTGGAACCTTCAT-3’ SEQ ID NO：06
GLCCI1-R 5’-TCCTTGTTGACCCCTGCTAT-3’ SEQ ID NO：07
GLCCI1-P 5’ROX-TCACTGCATAACTACAAATGTTAGGCTG-3’BHQ1 SEQ ID NO：08
CRHR2-F1 5’-GGTTTTGAACTCTGCGTTCGA-3’ SEQ ID NO：09
CRHR2-F2 5’-GTTTTGAACTCTGCGTTCGT-3’ SEQ ID NO：10
CRHR2-R 5’-ACCGGATGGTGGATGTAGAG-3’ SEQ ID NO：11
CRHR2-P 5’VIC-TTTGGGGACTTGAGAAATGATTCCTG-3’BHQ1 SEQ ID NO：12
(3)进行扩增反应
使用qPCR仪ABI 7500对配置好的野生型扩增反应体系和突变型扩增反应体系分别进行扩增，并采集荧光信号，扩增反应程序设置如表3所示；
表3 qPCR反应程序设定
Figure BDA0003590693340000091
荧光检测通道分别为FAM、ROX和VIC，其中，FAM荧光反映ADRB2-rs1042713位点扩增情况，ROX荧光反映GLCCI1-rs37973位点扩增情况，VIX荧光反映CRHR2-rs7793837位点扩增情况。
(4)实验结果
实验结果列于图1。
在该样本中，rs1042713突变型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs1042713野生型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本rs1042713位点基因型为AA纯合型；rs37973野生型和突变型反应体系中ROX通道均正常扩增，表明该样本rs37973位点基因型为AG杂合型；rs7793837野生型和突变型反应体系中VIC通道均正常扩增，表明该样本rs7793837位点基因型为AT杂合型。
作为可选实施例，图2-10分别列出了多个位点基因扩增结果图，列明了不同的基因型；试验方法参考扩增试验；
其中，如图2所示，该样本中，rs1042713野生型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs1042713突变型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为GG纯合型；
如图3所示，在该样本中，rs1042713突变型反应体系中FAM通道正常扩增，而rs1042713野生型反应体系中FAM通道无扩增，表明该样本基因型为AA纯合型；
如图4所示，在该样本中，rs1042713突变型和野生型反应体系中FAM通道均正常扩增，表明该样本基因型为AG杂合型；
如图5所示，在该样本中，rs37973野生型反应体系中ROX通道正常扩增，而rs37973突变型反应体系中ROX通道无扩增，表明该样本基因型为GG纯合型；
如图6所示，在该样本中，rs37973突变型反应体系中ROX通道正常扩增，而rs37973野生型反应体系中ROX通道无扩增，表明该样本基因型为AA纯合型；
如图7所示，在该样本中，rs37973野生型和突变型反应体系中ROX通道均正常扩增，表明该样本基因型为AG杂合型；
如图8所示，在该样本中，rs7793837野生型反应体系中ROX通道正常扩增，而rs7793837突变型反应体系中ROX通道无扩增，表明该样本基因型为TT纯合型；
如图9所示，在该样本中，rs7793837野生型反应体系中VIC通道无扩增，而rs7793837突变型反应体系中VIC通道正常扩增，表明该样本基因型为AA纯合型；
如图10所示，在该样本中，rs7793837野生型和突变型反应体系中VIC通道均正常扩增，表明该样本基因型为AT杂合型。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，包括利用基因检测试剂盒对待测样本的基因进行扩增。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，利用ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针和CRHR2-rs7793837基因位点的ARMS引物组及探针对待测样本的相应基因分别进行扩增。
临床样本验证试验
从样本库中随机选取20个临床样本，分别使用ARMS-PCR和一代测序的方法对20个临床样本的ADRB2-rs1042713基因位点、GLCCI1-rs37973基因位点和CRHR2-rs7793837基因位点进行分型。
操作步骤：
(1)随机选取20份临床样本，使用商业化的DNA试剂盒提取待测样本DNA，并测定其浓度和纯度；
(2)配置ARMS扩增反应体系
参照表1配置扩增反应体系，分别加入待测样本DNA、引物、荧光探针、PCR buffer、dNTP和热稳定Taq酶等；
(3)进行PCR扩增反应
按照表3qPCR反应程序设定，使用qPCR仪ABI 7500对其进行扩增并采集荧光信号；检测通道分别为FAM、ROX和VIC；
(4)根据PCR反应后的荧光信号判断所测临床样本的基因型；
(5)使用一代测序的方法对选取的20份临床样本进行测序分型，并与ARMS-PCR分型结果进行比较。
结果如表4所示，发现ARMS-PCR和一代测序结果一致性达到100％。
表4临床样本的ARMS-PCR和一代测序分型结果对照表
Figure BDA0003590693340000111
/>
Figure BDA0003590693340000121
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒的使用方法，采用基因检测试剂盒对待测样本进行扩增，具体包括：
(1)样本处理，提取待测样本DNA；
(2)配置ARMS扩增反应体系，扩增引物组及探针序列如表2所列，扩增反应体系如表1所列；
(3)进行PCR扩增反应，并检测荧光信号；
(4)根据扩增反应的荧光信号判断待测样本的基因型。
一些实施例公开的用于哮喘个体化用药的基因检测的扩增引物组的使用方法，包括利用扩增引物组对待测样本的基因分别进行扩增，具体包括：
(1)样本处理，提取待测样本DNA；
(2)配置ARMS扩增反应体系，扩增引物组及探针序列如表2所列，扩增反应体系如表1所列；
(3)进行PCR扩增反应，并检测荧光信号；
(4)根据扩增反应的荧光信号判断待测样本的基因型。
本申请实施例公开的用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组、检测试剂盒，提供了基于突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)的ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837的ARMS引物组及探针；扩增引物组具有良好的扩增特异性，检测灵敏度高、检测时间短，检测成本低，保证哮喘患者用药的安全性和有效性，能实现对哮喘个体化用药相关基因的分型检测，达到个体化用药的目的。
本申请公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本申请的发明构思，并不构成对本申请技术方案的限定，凡是对本申请公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本申请具有相同的发明构思，都在本申请权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
河南申友医学检验所有限公司
<120> 用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组、检测试剂盒、使用方法
<130> 20220315
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cttgctggca cccattg 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tcttgctggc accctata 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
caggccagtg aagtgatgaa 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
catcgtcatg tctctcatcg tcctg 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
agaaatgtct ggaaccttca c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
agaaatgtct ggaaccttca t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tccttgttga cccctgctat 20
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tcactgcata actacaaatg ttaggctg 28
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ggttttgaac tctgcgttcg a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gttttgaact ctgcgttcgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
accggatggt ggatgtagag 20
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tttggggact tgagaaatga ttcctg 26

Claims (4)

1.用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针，其特征在于，包括：ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针、GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针以及CRHR2-rs7793837的ARMS引物组及探针；其中，
所述ADRB2-rs1042713位点的ARMS引物组及探针包括：
ADRB2-rs1042713野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：01所示；
ADRB2-rs1042713突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：02所示；
ADRB2-rs1042713共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：03所示；
ADRB2-rs1042713共用探针，其序列如SEQ ID NO：04所示；
所述GLCCI1-rs37973位点的ARMS引物组及探针包括：
GLCCI1-rs37973野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：05所示；
GLCCI1-rs37973突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：06所示；
GLCCI1-rs37973共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：07所示；
GLCCI1-rs37973共用探针，其序列如SEQ ID NO：08所示；
所述CRHR2-rs7793837位点的ARMS引物组及探针包括：
CRHR2-rs7793837野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：09所示；
CRHR2-rs7793837突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：10所示；
CRHR2-rs7793837共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：11所示；
CRHR2-rs7793837共用探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。
2.用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于哮喘个体化用药基因检测的扩增引物组及探针。
3.根据权利要求2所述的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂。
4.根据权利要求3所述的用于哮喘个体化用药的基因检测试剂盒，其特征在于，包括扩增引物组和PCR扩增试剂的扩增反应体系配置为：
组分 体积/质量 2×Taq Pro HS U Probe Master Mix 12.5μL Primer Forward Mix 0.6μL Primer Reverse Mix 0.6μL Probe Mix 0.3μL DNA 10~30ng ddH2O 补足至20μL Total 20μL
其中，所述扩增反应体系包括野生型反应体系和突变型反应体系，对于野生型反应体系，Taq Pro HS U Probe Master Mix包括PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；PrimerForward Mix为包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的野生型上游引物混合物；Primer Reverse Mix为包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的下游引物混合物；Probe Mix为ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个位点荧光探针的混合物；对于突变型反应体系，TaqPro HS U Probe Master Mix包括PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；Primer ForwardMix为包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的突变型上游引物混合物；Primer Reverse Mix为包括ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个基因位点的下游引物混合物；Probe Mix为ADRB2-rs1042713、GLCCI1-rs37973、CRHR2-rs7793837三个位点荧光探针的混合物。
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