CN109251981A - 基于poct模式的aldh2基因型快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒含有用于检测ALDH2基因型的荧光定量PCR引物和探针以及细胞裂解液，所述PCR引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述探针如SEQ ID NO.3‑4所示。本试剂盒可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，特别适合DNA含量较低样本(如口腔脱落细胞)的快速、准确检测，检测准确率达98％以上，检测灵敏度高，可以准确检测低至0.1ng基因组DNA；整个检测耗时短，1小时内可得检测结果，能在第一时间给医生提供用药依据，降低患者用药风险。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒。
背景技术
乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是酒精代谢的关键酶，它能催化乙醇代谢的有毒、致癌的乙醛脱氢转变为无毒的乙酸。此外，ALDH2还兼具硝酸酯酶活性，是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键。
ALDH2基因的主要多态性位点是rs671(G>A)，正常的等位基因记为ALDH2*1，单碱基突变的等位基因记为ALDH2*2。ALDH2位点的多态性为先天遗传，与任何疾病的发生无关，与年龄无关。美国国立生物技术信息中心1000Genomes project(phase3)(网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)数据库提供的数据表明，ALDH2*2等位基因在中国西双版纳傣族人群中出现的频率占4.3％；中国北方汉族人群中ALDH2*2等位基因的频率占16.02％；在中国南方汉族人群中ALDH2*2等位基因的频率占27.14％。
研究表明，ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生纯合型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(杂合型)硝酸酯酶活性下降至8-15％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变纯合型)硝酸酯酶活性下降至6-7％，使硝酸甘油无法产生一氧化氮，难以发挥药效；ALDH2*1/ALDH2*2基因型(杂合型)乙醛脱氢酶活性下降至13％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突变纯合型)乙醛脱氢酶活性下降至2％，基本丧失酶的活力。
摄入人体的乙醇有90％以上是在肝脏内完成代谢过程的，在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(食道癌、口咽癌等)的几率较高。研究显示，ALDH2*2基因型者与饮酒人群患食道癌和口腔癌的风险之间具有明显联系。乙醛具有明显的致癌作用，ALDH2的生理意义在于对乙醛的解毒作用，而ALDH2*2等位基因由于缺乏ALDH酶活性，导致饮酒后血液中乙醛的蓄积。研究发现，携带ALDH2*2基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。除此之外，ALDH2*2基因型者也是冠心病、心肌梗死等疾病的高危人群。对ALDH2基因的检测将有助于揭示重大疾病的高危倾向，对指导检测者的日常生活大有益处，也将有助于医生提出个体化指导意见，对相关疾病的预防、治疗及预后具有重大意义。
综上所述，ALDH2基因多态性检测将为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据，具有重要的临床应用意义。
目前，检测ALDH2基因rs671位点基因型的方法有PCR-RFLP、Sanger双脱氧链终止法测序、荧光定量PCR、基因芯片、熔解曲线法等，测序法、熔解曲线法、荧光定量PCR和基因芯片方法均需昂贵设备，操作相对繁琐，检测周期长，检测成本高，其依赖大型精密仪器设备、固定实验室以及专业操作人员，因此，在临床上很难进行推广。相反，PCR-RFLP法操作简单，对仪器设备要求低，但该受内切酶的活性、酶切时间、酶切体系等影响很大，可能造成酶切不全导致基因型误判，也不适用于临床。此外，以上方法均需要提取样本DNA，从抽血到提纯DNA至少需要4个小时，到最终得到检测结果至少需要8小时，且对仪器设备要求高、检测环境要求严格。因此，难以满足临床上对疾病简便、快速、准确诊断的要求。
中国专利(公开号CN104120180A)采用了引物序列特异性扩增法(PCR-SSP)，但是该方法在PCR反应后需要使用凝胶电泳分析结果，对1个样本检测需要进行2次PCR反应，且开放式的操作会导致环境污染，影响结果准确性，因此也不适合临床推广。中国专利(专利号CN1563421 A)使用了基因芯片检测方法，虽然该方法具有通量高的优点，但是需要大型精密仪器设备、专业操作人员等，故在临床推广上也不理想。因此这些常规的检测技术都难以满足国内携带ALDH2*2突变基因的人群对ALDH2基因检测快速、准确的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于检测ALDH2基因型的荧光定量PCR引物和探针。
本发明的另一目的是提供一种基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明提供用于检测ALDH2基因型的引物对，引物对的核苷酸序列为：
上游引物：5’-ACAGGGTCAACTGCTATGAT-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物：5’-AGCAGGTCCCACACTCA-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明提供了与所述引物对配套使用的探针组合，所述探针组合为：
ALDH2基因野生型探针：5’-CAGGCATACACTGAAGT-3’
ALDH2基因突变型探针：5’-CAGGCATACACTAAAGT-3’。
优选地，所述探针组合包括：
ALDH2基因野生型探针：5’-CAGGCATACAC+T+GAAGT-3’
ALDH2基因突变型探针：5’-CAGGCATACAC+T+AAAGT-3’。
其中，“+”表示右侧的碱基为LNA修饰。
本发明提供了含有所述引物和所述探针组合的检测试剂或试剂盒。
本发明提供一种检测ALDH2基因多态性的PCR反应液，包括所述的引物与所述的探针组合。
进一步的，所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2和细胞裂解液。
优选地，所述PCR反应液中各组分的终浓度为：0.5-1.5倍的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs 0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg2+1-2.5mM和细胞裂解液；
所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；
其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。
更优选地，所述PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs 0.2mM、上游引物0.6μM、下游引物0.6μM、野生型探针0.4μM、突变型探针0.45μM、Mg2+2.5mM和细胞裂解液。
本发明提供了一种基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的PCR反应液。
本发明的上述试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。
将本发明的试剂盒应用于实际样本检测，所述检测样本可以来自口腔内壁、舌头、手掌、耳朵等部位，来自上述位置的脱落细胞经裂解液裂解后释放出的DNA均可用于该试剂盒的基因检测，由于刮取口腔内壁样本方法简便快捷，且样本量适中，因此选取口腔样本为最优。一般情况下在20秒内即可完成取样和加样步骤。
(1)取样前准备
取样前患者须用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，尽量避免口腔内壁残留唾液。取样者须穿戴手套、口罩。待上述准备完成后，方可进行取样。
(2)取样与加样
采样工具为一次性口腔拭子。具体采样过程如下：
1)分别从试剂盒与拭子包装袋中取出反应液与拭子，然后拔掉试剂塞(图1-a)；
2)取下拭子端盖,该过程中注意勿接触试剂塞(图1-b)；
3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1次)，力度以腮部微突为宜(图1-c)；
4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压使其与试剂管密封，避光暂存(如1-d)。
检测结果分析：反应结束后经过分析系统可直观准确地对检测结果进行分析和解读，一共可产生以下三种结果。
①野生纯合型
该检测结果在分析系统中表现为有且仅有绿色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有绿色荧光通道产生Ct值(cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)。(图2)
②突变纯合型
该检测结果在分析系统中表现为有且仅有红色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有红色荧光通道产生Ct值。(图3)
③杂合型
该检测结果在分析系统中表现为绿色荧光曲线和红色荧光曲线均呈指数增长趋势，并且绿色荧光通道和红色荧光通道均产生Ct值。(图4)
本发明具有以下优点：
(一)可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，1小时内即可得到对应基因位点的检测信息；故可在第一时间给医生提供用药依据，从而避免患者用药错误。
(二)在试剂反应体系中加入了细胞裂解液，可直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA，使样本加入、DNA提取与PCR反应在同一支试剂管里闭管进行。
(三)本试剂盒样本(DNA或口腔细胞)检测准确率达99％以上。
(四)本发明检测方法，取样过程无痛无创，操作简便，单次取样加样20s内即可完成。
(五)检测灵敏度高，可以准确检测低至0.1ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子等DNA含量较低的样本能准确检测。
(六)本试剂盒在常温下至少可放置72h，2-8℃至少可放置15天，-20℃至少可放置12个月。
(七)本发明采用了新颖的加样至结果一步化的操作方式，免去了繁琐的中间环节，1小时内即可出检测结果，解决了紧急病人治疗迫切的问题。单一步骤，单管试剂，闭管操作，大幅度降低了环境污染的可能性。
(八)本发明还配套使用了智能分析程序，可直接对数据进行自动分析，即刻得出无偏性的基因型检测结果和用药指导报告，摆脱了实验室束缚，对环境和操作人员没有特殊要求。
(九)本发明使用的探针可采用常用的分子信标，也可采用同时有着MGB(minorgroovebinding)和LNA(locknucleicacid)双重修饰的Taqman探针，但Taqman探针较分子信标本身具有更大优势，Taqman探针不仅大大降低了本底信号强度，并且进一步提高了探针的特异性、灵敏度和准确性。
(十)本发明还采用了热启动酶，通过优化试剂体系，使其能够包容口腔杂质和环境温度变化带来的风险。
附图说明
图1为利用本发明试剂盒进行检测过程中取样及加样操作流程图。
图2为本发明ALDH2等位基因野生纯合子检测结果图。
图3为本发明ALDH2等位基因突变纯合子检测结果图。
图4为本发明ALDH2等位基因杂合子检测结果图。
图5为本发明实施例1中加裂解液和不加裂解液三种基因型Ct值统计柱状图。“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P＞0.05)。
图6为本发明实施例1中加裂解液和不加裂解液三种基因型EPF值统计柱状图。“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)，“**”表示差异极显著(P≤0.01)。
图7为本发明实施例2中三种基因型Ct值统计柱状图。图中数据经多重比较检验统计学差异，将均值由大到小比较，*表示差异不显著(P≤0.05)，“**”表示差异极显著(P≤0.01)。
图8为实施例2中三种基因型重点荧光值统计柱状图。*表示差异不显著(P≤0.05)，“**”表示差异极显著(P≤0.01)。
图9为不同检测环境对本发明试剂盒检测正确率的影响数据统计图。
图10为实施例7中A组三种基因型Ct值统计图。
图11为实施例7中B组三种基因型Ct值统计图。
图12为实施例7中C组三种基因型Ct值统计图。
图13为实施例7中A组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。
图14为实施例7中B组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。
图15为实施例7中C组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。
图5-图15中，“G”表示绿色荧光通道，“R”表示红色荧光通道。
图16为ALDH2-1F443&ALDH2-1R570扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图17为ALDH2-2F396&ALDH2-2R529扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图18为ALDH2-3F394&ALDH2-3R530扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：1,5,9,13,17泳道为阴性对照。
图19为ALDH2-4F442&ALDH2-4R563扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：1,5,9泳道为阴性对照。
图20为ALDH2-5F395&ALDH2-5R530扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图21为ALDH2-6F434&ALDH2-6R569扩增曲线、熔解曲线和电泳图。注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图22为ALDH2-7F436&ALDH2-7R570扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图23为ALDH2-8F409&ALDH2-8R570扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图24为ALDH2-9F439&ALDH2-9R603扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图25为ALDH2-10F395&ALDH2-10R528扩增曲线、熔解曲线和电泳图，注：4,8,12,16泳道为阴性对照。
图26为1F1R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)，M：DNA Marker；1-4：56℃退火；5-8，58℃退火；9-12，60℃退火。图26-图32泳道对应情况相同。
图27为2F2R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
图28为3F3R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
图29为4F4R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
图30为6F6R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
图31为7F7R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
图32为10F10R不同退火温度扩增产物电泳图(口腔)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1用于检测ALDH2基因型的PCR反应液的配置
PCR是一种极其灵敏的微量DNA检测技术。目前临床上无痛无创检测方法的主要样本有口腔拭子、毛发、指甲、口腔唾液及体腔液等，这些样本均需专业人员在专业实验室使用专业的仪器设备，通过复杂的操作流程将其中所含的DNA提取纯化后，才可加入PCR反应体系进行反应，需要耗费大量的人力、物力、财力。为了解决DNA纯化的问题，直接以口腔黏膜脱落细胞代替提纯的DNA进行PCR；考虑到直接加入细胞后扩增效果不理想，不适合临床检测，申请人尝试加入了一定浓度的自制细胞裂解液。并且进行加细胞裂解液与不加细胞裂解液的比较实验。细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。
试剂配方见表1-1，3种不同表型各配制36支重复。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。
表1-1不同样本实验PCR反应总体系配方表
| 组成 | 浓度一 | 浓度二 |
| 5×Promega Colourless Buffer | 1.1× | 1.1× |
| dNTP(10mM) | 0.2mM | 0.2mM |
| MgCl<sub>2</sub>(25mM) | 2.5mM | 2.5mM |
| 细胞裂解液 | 1× | - |
| 上游引物(100μM) | 0.6μM | 0.6μM |
| 下游引物(100μM) | 0.6μM | 0.6μM |
| 野生型探针 | 0.4μM | 0.4μM |
| 突变型探针 | 0.45μM | 0.45μM |
| DNA聚合酶(5U/μL) | 1.25U | 1.25U |
| 口腔粘膜脱落细胞 | + | + |
| 补加超纯水 | 23.5μL | 23.5μL |
实验结果：
(1)Ct值统计如下和图5。
表1-2 Ct值统计表
(2)终点荧光值(EPF)统计如下和图6。
表1-3三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
表1-4加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计表
比较加细胞裂解液与不加细胞裂解液的Ct值可看出，不加细胞裂解液的试剂阳性通道Ct值极显著大于加入细胞裂解液的阳性通道Ct值(P≤0.01)；通过两者荧光值比较，可看出加入细胞裂解液后对应基因型阳性通道荧光值极显著高于不加细胞裂解液荧光值(P≤0.01)。说明加入细胞裂解液后，细胞裂解液裂解了细胞并使其释放了大量的DNA，从而Ct值显著降低，荧光值升高，因此PCR反应体系中，使用裂解液更优，避免了需要专业人员及特定实验室对DNA进行抽提和纯化的问题。
实施例2 LNA修饰探针提高分型正确率
LNA是一种寡核苷酸衍生物，与DNA/RNA具有相似的结构，因此能够对DNA和RNA进行有力的识别和结合。LNA用于寡核苷酸的修饰后，能够增加引物或探针的热稳定性，提高其退火温度3～8℃。本试剂盒开发的探针采用LNA修饰，经软件预测，修饰后的野生型探针和突变型探针与模板结合的Tm值均提高了4℃左右。为了充分表明LNA修饰探针和未经LNA修饰探针的差异，进行下列对比实验，PCR体系见表2-1，分别检测野生纯合子、杂合子和突变纯合子，每个基因型做三支重复，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。
所用引物和探针序列如下：
上游引物：5’-ACAGGGTCAACTGCTATGAT-3’
下游引物：5’-AGCAGGTCCCACACTCA-3’
本实验的探针序列如下：
野生型LNA修饰探针：CAGGCATACAC+T+GAAGT
突变型LNA修饰探针：CAGGCATACAC+T+AAAGT
野生型未经LNA修饰探针：caggcatacactgaagt
突变型未经lna修饰探针：caggcatacactaaagt
(注：“+”表示右侧碱基为LNA修饰，以上引物探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本实施例使用的野生型探针5’端均为FAM荧光基团修饰，3’端均为NFQ-MGB修饰；突变型探针5’端均为Texas Red荧光基团修饰，3’端均为NFQ-MGB修饰)
表2-1 PCR反应体系表
实验结果：
表2-2三种基因型Ct值统计
表2-3三种基因型的终点荧光值(EPF)统计
以上结果显示，未经LNA修饰探针组的突变纯合子和杂合子的绿色荧光通道荧光增长值很低，检测不出Ct值，而经LNA修饰探针组在检测3种基因型时，各基因型对应荧光通道荧光值均明显增长，经LNA修饰的突变探针在检测突变型和杂合型模板时对应荧光增量极显著高于(P≤0.01)未经LNA修饰的突变探针，同时，经LNA修饰的野生探针在检测野生型和杂合型模板时对应荧光增量显著高于(P≤0.05)未经LNA修饰的野生探针。实验结果表明当探针经LNA修饰后，有利于探针与靶序列的结合，提高了探针检测准确性。
实施例3准确性测试
本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞作为扩增样本，由于被检测人员生活习惯及个体基因序列的多样性可能造成试剂在分型时受到干扰，为了验证本试剂盒分型的准确度，本实验采用三个基因型不同人员的口腔黏膜脱落细胞进行测试(其中测试人员的基因型均经过测序法确证)，操作方法参照图1操作流程，样本总数为300例，试剂配方如表1-1。
实验结果：
表3-1三种基因型的正确率统计
从表3-1可以看出，在300例的样本测试中，本试剂盒的检测准确率可以达到99.3％。初步表明在按照图1操作流程进行测试的情况下，该试剂具有很高的准确度，可以达到99％以上。
实施例4灵敏度测试
验证ALDH2基因型快速检测试剂盒的灵敏度，将样品DNA(杂合子)加入总量分别以：1ng、0.5ng、0.25ng、0.125ng和0.1ng五个浓度梯度按照上述方法进行检测，以上每次检测至少进行两次以上重复，其结果如下表4-1所示：
表4-1不同样品浓度的检测结果
| DNA加入量 | 1ng | 0.5ng | 0.25ng | 0.125ng | 0.1ng | 合计 |
| 检测数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 500 |
| 正确数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 98 | 498 |
| 准确率 | 100％ | 100％ | 100％ | 100％ | 98％ | 99.6％ |
由上结果显示，样品DNA浓度分别以：1ng、0.5ng、0.25ng和0.125ng、0.1ng五个浓度梯度用ALDH2基因型检测试剂盒进行检测，其准确率均达到100％，当DNA浓度为0.1ng时，正确率为98％。也即是说，本发明的ALDH2基因型快速检测试剂盒只需0.125ng(35拷贝)的DNA模板量就能确保正确分型。
实施例5抗干扰能力检测
由于本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞直接扩增的方式进行检测，因此口腔进食后的残留物是否会干扰试剂检测结果，急需进行研究。本实验在取样操作前对被取样人员(其基因型经测序法确证)进行要求，以取样前30min禁食后取样作为标准，以吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和喝中药以后立即取样作为处理组，用同一批试剂对所有样品进行分别检测，每组样品中野生纯合子120例，杂合子120例，突变纯合子60例，试剂配方如表1-1所示，检测结果如下表所示：
表5-1试剂抗干扰能力正确率统计结果
以上结果可以看出，和禁食取样的检测正确率相比，吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和喝中药以后的正确率都有降低，说明食用以上食物后对PCR反应有一定的抑制作用。与禁食相比，各干扰项正确率下降范围在5-15％。因此为了提高试剂盒的检测准确性，吃完这些食物后，应在30min后进行漱口取样。由于本实验取样有限，在进行临床检测时仍应该在禁食30min后进行取样检测。
实施例6环境对检测试剂的影响试验
由于本发明试剂盒旨在应用于临床检测，因此为了验证ALDH2基因型快速检测试剂盒的检测结果是否受环境因素的影响，本实施例分别在日常办公区(总面积为200平方米，共容纳50人，不限制他们的活动(可随意走动或说话等)，环境温度为27℃，湿度为77％)和空气洁净度等级为一百万级的洁净室对多个人员(其基因型经测序法确证)进行取样，每个人员在两个区域分别进行两次重复实验，试剂配方参照表1-1添加裂解液组配制，检测结果统计见表6-1。
表6-1两个取样区的基因型检测结果正确率统计
从以上结果可以看出，洁净区取样的检测正确率较办公区取样的高1％，表明环境因素对检测的结果没有较大影响。此次试验为试剂盒在医院的应用便利性提供了数据，为以后在医院的推广和使用提供了有力数据支撑。
实施例7试剂盒在常温、2-8℃、-20℃放置稳定性检测
本试剂盒是基于POCT模式开发的，医院床旁检测，低温储存以及低温操作难以实现，所以需检测试剂在常温下放置一定时长后，是否会对检测结果产生不良影响。配制大批试剂，随机分成3个温度条件组共24个处理组，分组情况见表7-1，其中对照组为：配置后立即上机检测(2-8℃配制，30min内完成108支样品的取样上样上机程序)，每个处理组共108支试剂，每种基因型检测36支。待完成试剂处理后，按照SOP操作，采集被取样者(其ALDH2基因型经测序法确证)的口腔样品，野生纯合子、突变纯合子、杂合子各取36支。
表7-1试剂放置条件和放置时长分组情况表
表7-2三种基因型分型正确率统计表
从表7-2可以看出，各处理组108例数据，A/B/C三个温度条件的1～7组分型正确率为100％，到A/B/C三个温度条件的第8组时，出现分型错误的情况。说明常温条件下放置试剂至少7天，不会影响试剂的分型结果；2-8℃条件下放置试剂至少15天，不会影响试剂的分型结果；-20℃条件下放置试剂至少12个月，不会影响试剂的分型结果。综上所述，可证明本试剂盒的ALDH2试剂有良好的稳定性，在医院进行检测使用时，短暂(常温5天内)的非低温环境放置，不会影响分型准确性，完全可以满足POCT模式。
实施例8用于检测ALDH2基因型的引物和探针的效果对比
1.引物扩增效果对比
使用Primer Designing Tool设计PCR引物，综合考虑引物退火温度、特异性、序列长短、GC含量，产物大小等，从结果中筛选了10对PCR引物，引物序列信息见8-1。以设计合成的10对PCR引物为扩增引物，利用JENA荧光PCR仪，以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增，在进行PCR扩增时针对每对引物分别设计4个退火温度，每个温度重复3次，同时设置1支空白对照，进行荧光PCR反应，根据熔解曲线及电泳结果对引物进行初选；以初选出的引物为PCR引物。以人口腔黏膜脱落细胞为模板，在JY-1000A京因全自动医用PCR分析系统上进行PCR反应，根据PCR反应电泳结果对引物复筛，确定可扩增人口腔黏膜脱落细胞的最佳引物对。
表8-1引物序列表
实验结果：
(一)DNA模板扩增结果
(1)ALDH2-1F443&ALDH2-1R570结果见图16。通过电泳图可看出，在4个温度梯度下，该对引物均能扩增出目的条带，且目的条带亮度明显亮于非特异性条带。
(2)ALDH2-2F396&ALDH2-2R529结果见图17。通过电泳图可看出在4个温度梯度下，该对引物均能扩增出目的条带且条带亮度明显亮于非特异性和二聚体条带的亮度，其中退火温度为58℃、60℃时，产物量最多。
(3)ALDH2-3F394&ALDH2-3R530结果见图18。通过电泳图可看出在4个温度梯度下，该对引物均能扩增出目的条带且条带亮度明显亮于非特异性条带，其中退火温度为56℃、58℃、60℃时，产物量较多。
(4)ALDH2-4F442&ALDH2-4R563结果见图19。电泳图可看出生成产物量极少，与非特异性产物和二聚体亮度几乎一致。故舍弃。
(5)ALDH2-5F395&ALDH2-5R530结果见图20。通过电泳可看出，四个温度梯度下产物大小不一，且时有时无。怀疑跟引物结合模板不稳定有关，故舍弃。
(6)ALDH2-6F434&ALDH2-6R569结果见图21。电泳图可看出，虽然有非特异性产物生成，但条带大小与目的条带大小一致，且产物量较多。观察不同退火温度发现在54℃时，目的条带亮度最弱。
(7)ALDH2-7F436&ALDH2-7R570结果见图22。电泳图可看出虽有明显的二聚体，但产物明显多于二聚体的量，且在56℃和58℃时产物量最多，可进行下一步验证。
(8)ALDH2-8F409&ALDH2-8R570结果见图23。由电泳图可看出，产物条带很淡，二聚体很亮，故舍弃。
(9)ALDH2-9F439&ALDH2-9R603结果见图24。综合查看发现几乎无产物生成，故舍弃。
(10)ALDH2-10F395&ALDH2-10R528结果见图25。电泳条带，可看出该对引物可扩增目的片段，但空白试剂检测结果显示二聚体很明显。
(二)口腔细胞扩增结果
对DNA检测选定的7对引物以人类口腔黏膜脱落细胞为模板，PCR扩增结果如下。
(1)ALDH2-1F443&ALDH2-1R570(最适温度56℃、58℃、60℃)结果见图26。可看出ALDH2-1F443&ALDH2-1R570在3个退火温度条件下均无扩增产物。该对引物不可用。
(2)ALDH2-2F396&ALDH2-2R529(最适温度56℃、58℃、60℃)结果见图27。可看出ALDH2-2F396&ALDH2-2R529在3个退火温度下均无扩增产物，该对引物不可用。
(3)ALDH2-3F394&ALDH2-3R530(最适温度56℃、58℃、60℃)结果见图28，由电泳图可看出ALDH2-3F394&ALDH2-3R530在3个退火温度条件下均有扩增产物，且电泳条带56℃较58℃和60℃亮。
(4)ALDH2-4F442&ALDH2-4R563(最适温度54℃、56℃、58℃、60℃)结果见图29，由电泳图可看出ALDH2-4F442&ALDH2-4R563在54℃退火温度条件下无扩增产物，在56℃、58℃、60℃退火温度下有少量产物生成，因产物量过少，该对引物不可用。
(5)ALDH2-6F434&ALDH2-6R569(最适温度56℃、58℃、60℃)结果如下：由电泳图可看出ALDH2-6F434&ALDH2-6R569在三个温度梯度均无产物生成。该对引物不可用。
(6)ALDH2-7F436&ALDH2-7R570(最适温度56℃、58℃)结果如下：由ALDH2-7F436&ALDH2-7R570电泳图可看出口腔取样56℃和58℃均有目的条带生成，但产物较少，该对引物不可用。
(7)ALDH2-10F395&ALDH2-10R528(最适温度56℃、58℃、60℃)结果如下：由电泳图可看出ALDH2-10F395&ALDH2-10R528在56℃退火温度条件下无扩增产物。在58℃、60℃下有少量产物生成，该对引物不可用。
综合以上实验结果，ALDH2-3F394&ALDH2-3R530以人类口腔黏膜脱落细胞为模板时，可特异的对目的片段进行扩增，且56℃时产物量最多。
2.探针分型效果对比
利用分子生物学相关软件(Beacon Designer等)分别设计针对ALDH2G1510A位点的野生型探针和突变型探针，对设计合成的探针进行组合配对，分别以ALDH2三种基因型的口腔黏膜脱落细胞为模板进行分型检测验证，筛选可用于ALDH2分型的探针组合。
针对ALDH2基因G1510A位点共设计2条野生型探针和4条突变型探针，对各探针命名如下：
表8-2探针信息
实验结果：进行100次重复试验，其中野生型模板40次，突变型模板40次，杂合型模板20次。
表8-3不同探针组合分型正确率比较
实验结果显示，几组引物探针配比分型结果显示，只有探针编号1和编号5组合能100％分型正确，即本发明实施例2的探针为最佳。实施例9用于检测ALDH2基因型的引物和探针的优化
采用引物和探针按照表9-1体系配制不同体系的试剂，进行引物和探针浓度测试，每组测试以三种基因型的口腔黏膜脱落细胞作为扩增样本，每种基因型测试三支重复，观察分型稳定性。
表9-1引物探针浓度确定实验PCR反应总体系配方表
实验结果：
(1)引物浓度梯度实验(浓度一、浓度二、浓度三)
a.Ct值统计如下
表9-2 ALDH2 Ct值统计表
b.EPF值统计如下：
表9-3 ALDH2三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/Rratio)统计如下：
表9-4 ALDH2杂合型G/Rratio
| 终浓度 | G/Rratio(杂合型) |
| 浓度一 | 1.23 |
| 浓度二 | 1.31 |
| 浓度三 | 1.28 |
(2)探针浓度梯度实验
考虑到杂合型G/Rratio尽量接近于1(杂合型G/Rratio越接近于1，杂合分型错误的机会越低)，故对探针浓度进行了调整。
a.Ct值统计如下。
表9-5 ALDH2 Ct值统计表
b.终点荧光值(EPF)统计如下：
表9-6 ALDH2三种基因型终点荧光值(EPF)统计表
c.杂合型绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值(G/Rratio)统计如下：
表9-7 ALDH2杂合型G/Rratio
| 终浓度 | G/R ratio(杂合型) |
| 浓度四 | 1.18 |
| 浓度五 | 1.05 |
通过引物三个浓度梯度配制的试剂Ct值比较发现，浓度一和浓度二Ct值相差不明显，浓度三Ct值大于浓度一和浓度二的Ct值，说明相较于浓度三来说，浓度二和浓度一引物扩增效率更高，所以该体系下，试剂检测灵敏度更高。通过探针两个浓度梯度配制的试剂绿红通道荧光增量比值(G/Rratio)比较发现，浓度五绿红通道荧光比值(G/Rratio)更接近于1，该试剂盒在该浓度下灵敏度更高，检测结果更准确。
序列表
<110> 重庆京因生物科技有限责任公司
<120> 基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒
<130> KHP181110930.4
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagggtcaa ctgctatgat 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaggtccc acactca 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcataca ctgaagt 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggcataca ctaaagt 17
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggcataca ctgaagt 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggcataca ctaaagt 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctacaagatg tcggggagtg 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccagcaga ccctcaag 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggtcaact gctatgatgt 20
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcaggtccca cactcac 17
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctacaagat gtcggggag 19
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaccctcaa gccccaa 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagggtcaac tgctatgatg 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcaggtccc acactcac 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
accagcagac cctcaag 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttggtggcta caagatgtc 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttggtggcta caagatgtc 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccagcaga ccctcaag 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgatgtgtt tggagcccag 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caccagcaga ccctcaag 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtggctacaa gatgtcggg 19
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caacagaccc caatcccc 18
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cagggtcaac tgctatgatg 20
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caggtcccac actcaca 17
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggcatacac tgaa 14
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aggcatacac taaagtga 18
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gcatacacta aagtg 15
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aggcatacac taaagt 16
Claims (10)
1.一种检测ALDH2基因多态性的引物对，其特征在于，引物对的核苷酸序列为：
上游引物：5’-ACAGGGTCAACTGCTATGAT-3’
下游引物：5’-AGCAGGTCCCACACTCA-3’。
2.与权利要求1所述引物对配套使用的探针组合，其特征在于，所述探针组合为：
ALDH2基因野生型探针：5’-CAGGCATACACTGAAGT-3’
ALDH2基因突变型探针：5’-CAGGCATACACTAAAGT-3’。
3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括：
ALDH2基因野生型探针：5’-CAGGCATACAC+T+GAAGT-3’
ALDH2基因突变型探针：5’-CAGGCATACAC+T+AAAGT-3’,
其中，“+”表示右侧的碱基为LNA修饰。
4.含有权利要求1所述引物和权利要求2或3所述探针组合的检测试剂或试剂盒。
5.一种检测ALDH2基因多态性的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1所述的引物与权利要求2或3所述的探针组合。
6.根据权利要求5所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2和细胞裂解液。
7.根据权利要求6所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液中各组分的终浓度为：0.5-1.5倍的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05-0.1U/μL、dNTPs 0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg2+1-3.5mM和细胞裂解液；
所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；
其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。
8.根据权利要求7所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs 0.2mM、上游引物0.6μM、下游引物0.6μM、野生型探针0.4μM、突变型探针0.45μM、Mg2+2.5mM和细胞裂解液。
9.基于POCT模式的ALDH2基因型快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求6-8任一所述的PCR反应液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。
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