CN109251971A

CN109251971A - 基于poct模式的adrb1基因型快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN109251971A
Application number: CN201810152029.XA
Authority: CN
Inventors: 贺庭祯; 罗德朋; 向霄; 熊伟; 黎帮勇; 钟越; 刘黎; 董锐; 崔奇新; 杨园
Original assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHONGQING JINGYIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-01-22

Abstract

本发明提供一种基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒含有用于检测ADRB1基因型(G1165C)的荧光定量PCR引物和探针以及细胞裂解液，所述PCR引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述探针如SEQ ID NO.3‑4所示。本试剂盒可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，特别适合DNA含量较低样本(如口腔脱落细胞)的快速、准确检测，检测准确率达99％以上，检测灵敏度高，可以准确检测低至0.1ng基因组DNA；整个检测耗时短，1小时内可得检测结果，能在第一时间给医生提供用药依据，降低患者用药风险。

Description

基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒。

背景技术

β1-肾上腺素能受体(ADRB1)属于肾上腺素能受体家族，与鸟嘌呤核苷蛋白(G蛋白)偶联并广泛分布于心肌细胞中。ADRB1是一个包含477个氨基酸残基的蛋白受体，与儿茶酚胺结合后能激活腺苷酸环化酶(AC)使环磷酸腺苷(cAMP)大量产生，从而进一步激活蛋白激酶A 而达到调节心率和血压的作用。

ADRB1具有单核苷酸多态性(SNP)，其中G1165C(rs1801253) 位点突变导致第389的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)所替代，该突变氨基酸定位于细胞内羧基端使得受体结构发生改变，腺苷酸环化酶活性得到增强从而使人体对血压的调节能力降低，G1165C是与高血压显著相关的一个突变位点。因此，为了达到降血压的作用，须减弱 ADRB1的活性，故ADRB1成为治疗高血压疾病的受体拮抗药物的主要作用靶点。

现有的ADRB1阻断剂主要有美托洛尔和阿替洛尔，对于ADRB1 基因突变引发的高血压具有较好的疗效，但是需要预先检测高血压患者是否携带G1165C突变才能达到最佳的治疗效果。据统计，中国人群G1165C突变率达70％以上，突变ADRB1信号转导能力更强，活性更持久，且对于激动剂更灵敏，需要更高剂量的ADRB1阻断剂药物才能达到较好的降血压效果。因此快速、准确的ADRB1(G1165C) 基因分型检测对病人个体化使用治疗高血压药物有着重大的临床意义。

目前，检测ADRB1(G1165C)的方法主要有测序法、基因芯片法和荧光定量PCR法。测序法(如专利CN105586406A)和基因芯片法(如专利CN102021238A)对检测结果具有很高的精度，但是需要大型精密仪器设备，固定实验室以及须专业操作人员，因此，这两种检测方法成本高，步骤繁琐并且耗时长，在临床上很难进行推广。而基于 Taqman探针的荧光PCR法(如专利CN106834466A)虽然具有成本低，时间短和结果分析简单的优点，但是由于该反应体系只能扩增纯化后的基因组DNA样本，所以必须采用多步骤多管操作，在临床推广上也不理想。因此这些常规的检测技术都难以满足国内携带 ADRB1(G1165C)突变基因的人群对ADRB1基因检测快速、准确的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一套用于检测ADRB1(G1165C)基因型的荧光定量PCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种基于POCT模式的ADRB1(G1165C) 基因型快速检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明提供用于检测ADRB1(G1165C)基因型的引物对，引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5’-GGCCTTCAACCCCATCATCT-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-GTCTCCGTGGGTCGCGTG-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明提供了与所述引物对配套使用的探针组合，F1和F2分别代表不同荧光基团标记，Q为猝灭基团，所述探针组合为：

ADRB1基因野生型探针：5’-F1-CCAGGGACTGCTC-Q-3’

ADRB1基因突变型探针：5’-F2-CCTTCCAGCGACTGC-Q-3’。

优选地，所述探针组合包括：

ADRB1基因野生型探针：5’-F1-CCAGG+GACTGCTC-Q-3’

ADRB1基因突变型探针：5’-F2-CCTTCC+AGCGACTGC-Q-3’。

其中，“+”表示右侧的碱基为LNA修饰。

本发明提供了含有所述引物和所述探针组合的检测试剂或试剂盒。

本发明提供一种检测ADRB1基因多态性的PCR反应液，包括所述的引物与所述的探针组合。

进一步的，所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、 MgCl₂和细胞裂解液。

优选地，所述PCR反应液中各组分的终浓度为：0.5-1.5倍的PCR 反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs0.1-0.5mM、上游引物 0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针 0.2-0.7μM、Mg²⁺1-2.5mM和细胞裂解液；

所述细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；

其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。

更优选地，所述PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.7μM、下游引物0.7μM、野生型探针0.2μM、突变型探针0.3μM、Mg²⁺2.5mM 和细胞裂解液。

本发明提供了一种基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的PCR反应液。

本发明的上述试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：95℃ 预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。

将本发明的试剂盒应用于实际样本检测，所述检测样本可以来自口腔内壁、舌头、手掌、耳朵等部位，来自上述位置的脱落细胞经裂解液裂解后释放出的DNA均可用于该试剂盒的基因检测，由于刮取口腔内壁样本方法简便快捷，且样本量适中，因此选取口腔样本为最优。一般情况下在20秒内即可完成取样和加样步骤。

(1)取样前准备

取样前患者须用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3 次，尽量避免口腔内壁残留唾液。取样者须穿戴手套、口罩。待上述准备完成后，方可进行取样。

(2)取样与加样

采样工具为一次性口腔拭子。具体采样过程如下：

1)分别从试剂盒与拭子包装袋中取出反应液与拭子，然后拔掉试剂塞(图1-a)；

2)取下拭子端盖,该过程中注意勿接触试剂塞(图1-b)；

3)使拭子端部近90°接触口腔内腮壁，均匀刮拭5次(上下为1 次)，力度以腮部微突为宜(图1-c)；

4)取样后立即将拭子插入反应液中，按压使其与试剂管密封，避光暂存(如1-d)。

检测结果分析：反应结束后经过分析系统可直观准确地对检测结果进行分析和解读，一共可产生以下三种结果。

①野生纯合型

该检测结果在分析系统中表现为有且仅有绿色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有绿色荧光通道产生Ct值(cycle threshold，指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)。(图2)

②突变纯合型

该检测结果在分析系统中表现为有且仅有红色荧光曲线呈指数增长趋势，并且有且仅有红色荧光通道产生Ct值。(图3)

③杂合型

该检测结果在分析系统中表现为绿色荧光曲线和红色荧光曲线均呈指数增长趋势，并且绿色荧光通道和红色荧光通道均产生Ct值。 (图4)

本发明具有以下优点：

(一)可实现即时检测，无需DNA提纯，可将样本直接加入试剂中进行PCR反应，1小时内即可得到对应基因位点的检测信息；故可在第一时间给医生提供用药依据，从而避免患者用药错误。

(二)在试剂反应体系中加入了细胞裂解液，可直接裂解细胞并释放出细胞核中DNA，使样本加入、DNA提取与PCR反应在同一支试剂管里闭管进行。

(三)本试剂盒样本(DNA或口腔细胞)检测准确率达99％以上。

(四)本发明检测方法，取样过程无痛无创，操作简便，单次取样加样20s内即可完成。

(五)检测灵敏度高，可以准确检测低至0.1ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子等DNA含量较低的样本能准确检测。

(六)本试剂盒在常温下至少可放置72h，2-8℃至少可放置15天， -20℃至少可放置12个月。

(七)本发明采用了新颖的加样至结果一步化的操作方式，免去了繁琐的中间环节，1小时内即可出检测结果，解决了紧急病人治疗迫切的问题。单一步骤，单管试剂，闭管操作，大幅度降低了环境污染的可能性。

(八)本发明还配套使用了智能分析程序，可直接对数据进行自动分析，即刻得出无偏性的基因型检测结果和用药指导报告，摆脱了实验室束缚，对环境和操作人员没有特殊要求。

(九)本发明使用的探针可采用常用的分子信标，也可采用同时有着MGB(minorgroovebinding)和LNA(locknucleicacid)双重修饰的Taqman探针，但Taqman探针较分子信标本身具有更大优势，Taqman 探针不仅大大降低了本底信号强度，并且进一步提高了探针的特异性、灵敏度和准确性。

(十)本发明还采用了热启动酶，通过优化试剂体系，使其能够包容口腔杂质和环境温度变化带来的风险。

附图说明

图1为利用本发明试剂盒进行检测过程中取样及加样操作流程图。

图2为本发明ADRB1(G1165C)等位基因野生纯合子检测结果图。

图3为本发明ADRB1(G1165C)等位基因突变纯合子检测结果图。

图4为本发明ADRB1(G1165C)等位基因杂合子检测结果图。

图5为本发明实施例1中加裂解液和不加裂解液三种基因型Ct值统计柱状图。“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)， “**”表示与对照组相比，该组数据差异极显著(P≤0.01)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P＞0.05)。

图6为本发明实施例1中加裂解液和不加裂解液三种基因型EPF 值统计柱状图。“*”表示与对照组相比，该组数据差异显著(P≤0.05)； “**”表示与对照组相比，该组数据差异极显著(P≤0.01)；未标示的表示与对照组相比，该组数据差异不显著(P＞0.05)。

图7为实施例7中A组三种基因型Ct值统计图。

图8为实施例7中B组三种基因型Ct值统计图。

图9为实施例7中C组三种基因型Ct值统计图。

图10为实施例7中A组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。

图11为实施例7中B组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。

图12为实施例7中C组三种基因型终点荧光值(EPF)统计图。

图13为实施例8中浓度一、二、三配比的三种基因型Ct值统计柱状图。

图14为实施例8中浓度一、二、三中三种基因型EPF统计柱状图。

图15为实施例8中浓度四、五配比的三种基因型Ct值统计柱状图。

图16为实施例8中浓度四、五配比的三种基因型EPF统计柱状图。

图5-图16中，“G”表示绿色荧光通道，“R”表示红色荧光通道。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

实施例1用于检测ADRB1(G1165C)基因的PCR反应液的配置

PCR是一种极其灵敏的微量DNA检测技术。目前临床上无痛无创检测方法的主要样本有口腔拭子、毛发、指甲、口腔唾液及体腔液等，这些样本均需专业人员在专业实验室使用专业的仪器设备，通过复杂的操作流程将其中所含的DNA提取纯化后，才可加入PCR反应体系进行反应，需要耗费大量的人力、物力、财力。为了解决DNA 纯化的问题，直接以口腔黏膜脱落细胞代替提纯的DNA进行PCR；考虑到直接加入细胞后扩增效果不理想，不适合临床检测，申请人尝试加入了一定浓度的自制细胞裂解液。并且进行加细胞裂解液与不加细胞裂解液的比较实验。细胞裂解液由十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚组成；其中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚的浓度为0.001-0.03％(w/v)。此外，为了验证加裂解液和不加裂解液对ADRB1(G1165C)基因分型正确率的影响，本实施例进行了100例野生纯合子、100例突变纯合子、100例杂合子的对比检测试验(基因型经测序验证)。

试剂配方见表1-1，3种不同表型各配制100支重复。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50 次。

表1-1不同样本实验PCR反应总体系配方表

实验结果：

(1)Ct值统计如下和图5。

表1-2Ct值统计表

(2)终点荧光值(EPF)统计如下和图6。

表1-3三种基因型终点荧光值(EPF)统计表

表1-4加裂解液与否对三种基因型检测准确率影响的统计表

比较加细胞裂解液与不加细胞裂解液的Ct值可看出，不加细胞裂解液的Ct值极显著大于加入细胞裂解液的Ct值(P≤0.01)；通过两者EPF比较，可看出加入细胞裂解液后EPF极显著高于不加细胞裂解液EPF(P≤0.01)。加入裂解液后，检测准确率从75.3％提高到 99.7％。说明加入细胞裂解液后能裂解细胞并释放大量DNA，从而使 Ct值显著降低，EPF显著升高，使得检测准确率达到99％以上。

实施例2LNA修饰探针提高分型正确率

LNA是一种寡核苷酸衍生物，与DNA/RNA具有相似的结构，因此能够对DNA和RNA进行有力的识别和结合。LNA用于寡核苷酸的修饰后，能够增加引物或探针的热稳定性，提高其退火温度3～8℃。本试剂盒开发的探针采用LNA修饰，经软件预测，修饰后的野生型探针和突变型探针与模板结合的Tm值均提高了4℃左右。为了充分表明 LNA修饰探针和未经LNA修饰探针的差异，进行下列对比实验，PCR 体系见表2-1，分别检测野生纯合子、杂合子和突变纯合子，每个基因型做三支重复，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。

所用引物和探针序列如下：

上游引物：5’-GGCCTTCAACCCCATCATCT-3’

下游引物：5’-GTCTCCGTGGGTCGCGTG-3’

野生型LNA修饰探针探针：

5’-FAM-CCAGG+GACTGCTC-MGB-3’

突变型LNA修饰探针探针：5’-Texas

Red-CCTTCC+AGCGACTGC-MGB-3’

(注：“+”表示右侧碱基为LNA修饰)

野生型未经LNA修饰探针：5’-FAM-CCAGGGACTGCTC-MGB -3’

突变型未经LNA修饰探针：5’-Texas

Red-CCTTCCAGCGACTGC-MGB-3’

表2-1PCR反应体系表

配方1	配方2	反应组分终浓度
			5×Promega Colourless Buffer	5×Promega Colourless Buffer	1.1×
dNTP(10mM)	dNTP(10mM)	0.2mM
			MgCl<sub>2</sub>(25mM)	MgCl<sub>2</sub>(25mM)	2.5mM
细胞裂解液(200×)	细胞裂解液(200×)	1×
			上游引物(100μM)	上游引物(100μM)	0.5μM
下游引物(100μM)	下游引物(100μM)	0.5μM
			野生型LNA修饰探针	野生型未经LNA修饰探针	0.5μM
突变型LNA修饰探针	突变型未经LNA修饰探针	0.5μM
			DNA聚合酶(5U/μL)	DNA聚合酶(5U/μL)	0.05U/μL
DNA(10ng/μL)	DNA(10ng/μL)	10ng
			补加超纯水至23.5μL	补加超纯水至23.5μL	23.5μL

实验结果：

表2-2三种基因型Ct值统计

从表2-2可以看出，经LNA修饰探针组对三种基因型的Ct值均符合要求，而未经LNA修饰的探针组可能由于EPF增量过低导致检测不出Ct值。实验结果表明当探针经LNA修饰后，有利于探针与靶序列的结合。

实施例3准确性测试

本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞作为扩增样本，由于被检测人员生活习惯及个体基因序列的多样性可能造成试剂在分型时受到干扰，为了验证本试剂盒分型的准确度，本实验采用三个基因型不同人员的口腔黏膜脱落细胞进行测试(其中测试人员的基因型均经过测序法确证)，操作方法参照图1操作流程，样本总数为300例，试剂配方如表1-1所示。

实验结果：

表3-1三种基因型的正确率统计

从表3-1可以看出，在300例的样本测试中，本试剂盒的检测准确率可以达到99.3％。初步表明在按照图1操作流程进行测试的情况下，该试剂具有很高的准确度，可以达到99％以上。

实施例4准确性和灵敏度测试

验证ADRB1(G1165C)基因型快速检测试剂盒的灵敏度，我们将样品DNA(杂合子)加入总量分别以：1ng、0.5ng、0.25ng和0.125ng 四个浓度梯度按照上述方法进行检测，以上每次检测至少进行两次以上重复，其结果如下表4-1所示：

表4-1不同样品浓度的检测结果

由上结果显示，样品DNA浓度分别以：1ng、0.5ng、0.25ng和 0.125ng四个浓度梯度用ADRB1(G1165C)基因型检测试剂盒进行检测，其准确率均达到100％，当DNA浓度为0.1ng时，正确率为99％。也即是说，本发明的ADRB1(G1165C)基因型快速检测试剂盒只需35 个拷贝数的DNA模板量就能确保正确分型。

实施例5抗干扰能力检测

由于本试剂盒采用口腔黏膜脱落细胞直接扩增的方式进行检测，因此口腔进食后的残留物是否会干扰试剂检测结果，急需进行研究。本实验在取样操作前对被取样人员(其基因型经测序法确证)进行要求，以取样前30min禁食后取样作为标准，以吃甜食、喝碱性茶、吃酸性食物、麻辣食品和喝中药以后立即取样作为处理组，用同一批试剂对所有样品进行分别检测，每组样品中野生纯合子120例，杂合子 120例，突变纯合子60例，试剂配方如表1-1所示，检测结果如下表所示：

表5-1试剂抗干扰能力测试结果

从以上结果可以看出，和禁食取样的检测正确率相比，其他实验组的检测准确率都低于90％，表明吃完这些食物后对检测的干扰较大，吃完这些食品后应该在30min后进行漱口取样。由于本实验取样有限，在进行临床检测时仍应该在禁食30min后进行取样检测。

实施例6环境对检测试剂的影响试验

由于本发明试剂盒旨在应用于临床检测，因此为了验证 ADRB1(G1165C)基因型快速检测试剂盒的检测结果是否受环境因素的影响，我们分别在日常办公区(总面积为200平方米，共容纳50 人，不限制他们的活动(可随意走动或说话等)，环境温度为 27℃，湿度为77％)和空气洁净度等级为一百万级的洁净室对多个人员(其基因型经测序法确证)进行取样，每个人员在两个区域分别进行两次重复实验，试剂配方参照表1-1，检测结果统计如下表6-1 和图6所示。

表6-1两个取样区的基因型检测结果正确率统计

从以上结果可以看出，办公区和洁净区取样的检测正确率均能达到99％以上且准确率只差0.4％，表明环境因素对检测的结果没有较大影响。此次试验为试剂盒在医院的应用便利性提供了数据，为以后在医院的推广和使用提供了有力数据支撑。

实施例7试剂盒在常温、2-8℃、-20℃放置稳定性检测。

传统PCR试剂需要冷链运输、-20℃储存。本试剂盒在常温下至少可放置72h，2～8℃至少可放置15天，-20℃至少可放置12个月。

本试剂盒是基于POCT模式开发的，医院床旁检测，低温储存以及低温操作难以实现，所以需检测试剂在常温下放置一定时长后，是否会对检测结果产生不良影响。配制大批试剂，随机分成3个温度条件组共24个处理组，分组情况见表7-1，其中对照组为：配置后立即上机检测(2-8℃配制，30min内完成108支样品的取样上样上机程序)，每个处理组共108支试剂，每种基因型检测36支。待完成试剂处理后，按照附图1操作，采集被取样者(其ADRB1(G1165C)基因型经测序法确证)的口腔样品，野生纯合子、突变纯合子、杂合子各取36支。统一按照表一进行荧光PCR反应。

表7-1试剂放置条件和放置时长分组情况表

表7-2三种基因型分型正确率统计表

以上数据表明常温放置、2-8℃放置、-20℃放置时间过久会对检测准确率产生影响。但从表8-2可以看出，各处理组108例数据，A/B/C 三个温度条件的1～7组分型正确率为100％，到A/B/C三个温度条件的第8组时，出现分型错误的情况。说明常温条件下放置试剂至少7 天，不会影响试剂的分型结果；2-8℃条件下放置试剂至少15天，不会影响试剂的分型结果；-20℃条件下放置试剂至少12个月，不会影响试剂的分型结果。综上所述，可证明本试剂盒的MTHFR(C677T) 试剂有良好的稳定性，在医院进行检测使用时，短暂(常温5天内) 的非低温环境放置，不会影响分型准确性，完全可以满足POCT模式。

实施例8ADRB1引物探针最佳比例优化实验

本发明实施例2的特异的引物和探针筛选确认后，需对引物和探针在PCR反应体系中的浓度进行优化(以口腔细胞为模板)。引物探针浓度对应的PCR反应体系如下表8-1所示。

表8-1引物探针浓度实验PCR反应总体系配方表

实验结果如图13、图14所示：

(1)引物浓度梯度实验(浓度一、浓度二、浓度三)

a.CT值统计如下表。

表8-2CT值统计表

b.EPF值统计如下表

表8-3三种浓度三种基因型EPF值统计表

c.杂合型G/Rratio统计如下：

表8-4杂合型G/Rratio

注：“G/Rratio”为绿通道终点荧光值和红通道终点荧光值的比值。

通过引物三个浓度梯度配置的试剂CT值比较发现三者之间差异均不明显，但浓度二的三个基因型终点荧光值(EPF)均极显著高于其他两个浓度的终点荧光值(EPF)。可能原因是浓度三过高，引物间形成了大量二聚体，影响了引物的扩增效率；浓度一过少，生成产物量不够。通过杂合型G/Rratio可看出当引物浓度为浓度二时，该比值接近于1。由此可知当上下游引物浓度均为0.7μM时，反应体系最优。

(2)探针浓度梯度实验

考虑到杂合型G/Rratio尽量接近于1，故对探针浓度进行了调整。

a.CT值统计见下表和图15。

表8-5Ct值统计表

b.EPF值统计见下表和图16。

表8-6三种基因型EPF统计表

c.杂合型G/Rratio统计如下：

表8-7杂合型G/Rratio

终浓度	G/R ratio(杂合型)
		浓度四	1.01
浓度五	1.21

通过引物三个浓度梯度配置的试剂CT值比较发现三者之间差异均不明显，但浓度二的终点荧光值显著高于浓度一和三的终点荧光值 (p≤0.05)。说明在相同探针浓度条件下，浓度二扩增的可参与PCR 反应的有效产物量最高。探针正确匹配的量越多，试剂也就越稳定。

由绿红通道终点荧光值比值(G/R ratio)可看出，浓度二的绿红通道终点荧光值比值(G/Rratio)更接近于1，说明检测杂合子基因型时，结果更准确可靠。

通过探针两个浓度梯度配制的试剂终点荧光值和绿红通道荧光比值(G/Rratio)比较发现，浓度四的终点荧光值极显著高于浓度五的终点荧光值(p≤0.01)，浓度四绿红通道荧光比值(G/Rratio)更接近于1，该试剂盒在该浓度下灵敏度更高，检测结果更准确。

此例证是为了证明ADRB1(G1165C)位点基因型快速检测试剂盒所用的反应体系灵敏度高，稳定性好，结果准确可靠。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 重庆京因生物科技有限责任公司

<120> 基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒

<130> KHP181110928.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggccttcaac cccatcatct 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctccgtgg gtcgcgtg 18

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccagggactg ctc 13

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttccagcg actgc 15

<210> 5

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagggactg ctc 13

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttccagcg actgc 15

Claims

1.一种检测ADRB1基因多态性的引物对，所述ADRB1基因多态性为G1165C，其特征在于，引物对的核苷酸序列为：

上游引物：5’-GGCCTTCAACCCCATCATCT-3’

下游引物：5’-GTCTCCGTGGGTCGCGTG-3’。

2.与权利要求1所述引物对配套使用的探针组合，F1和F2分别代表不同荧光基团标记，Q为猝灭基团，其特征在于，所述探针组合为：

ADRB1基因野生型探针：5’-F1-CCAGGGACTGCTC-Q-3’

ADRB1基因突变型探针：5’-F2-CCTTCCAGCGACTGC-Q-3’。

3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括：

ADRB1基因野生型探针：5’-F1-CCAGG+GACTGCTC-Q-3’

ADRB1基因突变型探针：5’-F2-CCTTCC+AGCGACTGC-Q-3’,

其中，“+”表示右侧的碱基为LNA修饰。

4.含有权利要求1所述引物和权利要求2或3所述探针组合的检测试剂或试剂盒。

5.一种检测ADRB1基因多态性的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1所述的引物与权利要求2或3所述的探针组合。

6.根据权利要求5所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl₂和细胞裂解液。

7.根据权利要求6所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液中各组分的终浓度为：0.5-1.5倍的PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.04-0.1U/μL、dNTPs0.1-0.5mM、上游引物0.2-0.7μM、下游引物0.2-0.7μM、野生型探针0.2-0.7μM、突变型探针0.2-0.7μM、Mg²⁺1-2.5mM和细胞裂解液；

8.根据权利要求7所述的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应体系中各组分的终浓度为：1.1×PCR反应缓冲液、DNA聚合酶0.05U/μL、dNTPs0.2mM、上游引物0.5μM、下游引物0.5μM、野生型探针0.5μM、突变型探针0.5μM、Mg²⁺2.5mM和细胞裂解液。

9.基于POCT模式的ADRB1基因型快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求6-8任一所述的PCR反应液。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒进行荧光定量PCR时，其工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性8s，56℃退火及延伸35s，循环50次。