CN103131782A - 一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于特定基因检测领域，具体涉及一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明针对非小细胞肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680,rs16969968,rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为非小细胞肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。本发明检测样本的检测周期短、取材方便，能够满足高通量地大规模的检测，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于特定基因检测领域，具体涉及一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
生物信息学是通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，生物信息学成为解开生物数据所蕴含的生物学意义的强大工具。并且随着人类基因组测序完成，蛋白质及肿瘤组织学开展，生物信息学在人类疾病与功能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究方面都发挥着关键的作用。生物信息学方法结合生物基因探针技术，通过对全基因表达图谱进行数据挖掘，成功地将临床表征不明或容易误诊的恶性肿瘤准确、快速地区分开。科研人员利用生物信息学的进行深度的数据发掘，比对及分析，发现了基因EGFR(Genbank登录号NM_201284.1)、CHRNA3(Genbank登录号NM_000743.4)、CHRNA5(Genbank登录号NM_000745.3)及ERCC1(Genbank登录号NM_001166049.1)在早期的非小细胞肺癌发病期表达存在着一定的关联性。
基因探针，一般分成3种。第一种是从DNA基因组中设计，叫做基因组探针；第二种是提取组织中的RNA，利用基因反转录技术得到cDNA,也叫做cDNA探针，它与第一组不同的是不含有样本中的内含子序列，一般认为仅有外显子及有功能的基因序列；第三种就是通过体外人工合成DNA片段与基因序列互补，称为寡核苷酸探针。
目前研究发现非小细胞肺癌易感性与遗传有着密切的关系，而研究遗传疾病目前国际上公认的手段是SNP位点技术。SNP（Single Nucleotide Polymorphism）单核苷酸多态性是目前最新的遗传标记。SNP的生物体中最普遍，分布最广泛的多态差异。人类HapMap对亚洲人的测序中发现人类基因组中，至少存在三百万个SNP多态位点。根据对早期非小细胞肺癌病人样本SNP研究发现，肺癌的遗传度高达30-40%左右。现代遗传学研究 表明，各种遗传疾病都会被某些SNP位点所表现，也就是关联性。
市场上现有的肺癌早期预测的试剂盒，大部分都是利用传统的抗原抗体反应原理的Elisa检测试剂盒，存在假阳性比较高。如果采用国外进口的试剂盒，检测样本更是周期长，花费高，而且取材比较繁琐，不能够高通量的大规模的检测，弊病较多。
对于现有SNP位点分析，常用的方法有大规模的测序技术，基因芯片技术及TaqMan探针技术，但这些技术都存在周期长，费用高的问题。测序及芯片的结果虽然比较可靠，但是对于个别基因的SNP分析存在时间长，人力物力浪费的问题。
因此，在早期非小细胞肺癌的基因检测领域需要一种检测结果可靠、检测周期短、操作方法简单易行的多位点关联基因的试剂盒及其检测方法。
发明内容
本发明提供一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物，所述的引物的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17所示。
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的探针，包括5’端探针和3’端探针；所述的5’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19所示；所述的3’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：5、SEQ ID No：10、SEQ ID No：15、SEQ ID No：20所示，所述的3’端探针的核苷酸碱基序列的5’端添加磷酸修饰，3’端加入荧光修饰。
上述的引物和探针与检测早期非小细胞肺癌4个相关联基因EGFR(Genbank登录号NM_201284.1)、CHRNA3(Genbank登录号 NM_000743.4)、CHRNA5(Genbank登录号NM_000745.3)及ERCC1(Genbank登录号NM_001166049.1)内部的rs2239680,rs16969968,rs12910984及rs2298881位点的对应关系如下表：
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒，所述的试剂盒包括由A体系(PCR扩增反应体系)、和B体系[连接酶检测反应（LDR）体系]；
所述的A体系包括：PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/LKCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]，dNTP，Taq DNA聚合酶、引物、ddH2O；
所述的PCR镁离子缓冲液中镁离子浓度是2.5mM，所述的Taq DNA聚合酶浓度是2.5unit/μl；
所述的B体系包括：1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]，dNTP，Taq DNA连接酶、探针，ddH2O；所述的探针包括3’端探针和5’端探针；
所述的1×连接酶缓冲液的浓度是5mM，所述的Taq DNA连接酶浓度是2.5unit/μl。
所述的引物和所述探针均为5OD的干粉形式，经过12000rpm离心后加入ddH2O溶解成10pmol/μl浓度并震荡混匀。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒的制备方法，包 括以下步骤：
A、采用引物设计软件设计所述的引物，Tm值分别为55摄氏度、50摄氏度、60摄氏度、62摄氏度；再合成所述的引物；
B、采用探针设计设计所述的探针，再进行合成和修饰，得到所述的探针；所述的修饰包括以下步骤：
a.两条5’端探针长度相差3个碱基，差别反应在探针的5’端；
b.两条5’端探针的3’端的最后一个碱基根据SNP位点的基因型确定；
c.两条5’端探针在距离3’端的4-6个碱基位置人为引入与目标序列不互补的1个碱基，目的是增大检测的准确性。
d.除上述描述外，5’端探针的其他位置与基因SNP序列完全互补。
e.3’端探针与目标序列完整互补，并在其5’端添加磷酸基团修饰，在3’端加入FAM荧光修饰；
C、分别配制：A体系中的PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/LKCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]、dNTP、Taq DNA聚合酶；B体系中的1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]、dNTP、Taq DNA连接酶；
D、将所述的A体系、B体系进行分装处理，得到所述的试剂盒。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
A、样本DNA提取：
采集健康志愿者和已确诊由于肺癌而去世的患者的遗体的的外周血或者新鲜的唾液样本，进行DNA提取处理，得到样本DNA；
B、PCR扩增反应：
以所述的样本DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述的PCR扩增反应采用所述的A体系；
所述的PCR扩增反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保存；
C、连接酶检测反应：
a.将所述的PCR扩增产物进行纯化处理后，得到纯化后的PCR扩增产 物；
b.以所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，进行连接酶检测反应（LDR），得到连接产物；所述的连接酶检测反应采用所述的B体系；
所述的连接酶检测反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性4min；阶段2：60℃30s，共40个循环；阶段3：95℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
c.将所述的连接产物进行判读；
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
1、本发明针对非小细胞肺癌的早期检测与之相关联的EGFR，CHRNA3，CHRNA5及ERCC1基因内部的rs2239680,rs16969968,rs12910984及rs2298881位点的基因型进行分型，利用以上4个位点联合作为非小细胞肺癌早期诊断的标志物，提高了检测的真实性和准确性。
2、本发明检测样本的检测周期短、取材方便，能够满足高通量地大规模的检测，提高了检测效率。
附图说明
图1为实施例1的纯化后的PCR扩增产物进行电泳图。
图2为实施例1的连接产物检测结果示意图。
具体实施方式
实施例1：
本实施例是一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物、探针、试剂盒及其制备方法和检测方法。
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物，所述的引物的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17所示。
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的探针，包括5’端探针和3’端探针；所述的5’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19所示；所述的3’端探针的核苷 酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：5、SEQ ID No：10、SEQ ID No：15、SEQ ID No：20所示，所述的3’端探针的核苷酸碱基序列的5’端添加磷酸修饰，3’端加入荧光FAM修饰。
上述的引物和探针与检测早期非小细胞肺癌4个相关联基因EGFR(Genbank登录号NM_201284.1)、CHRNA3(Genbank登录号NM_000743.4)、CHRNA5(Genbank登录号NM_000745.3)及ERCC1(Genbank登录号NM_001166049.1)内部的rs2239680,rs16969968,rs12910984及rs2298881位点的对应关系如下表：
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒，所述的试剂盒包括由A体系(PCR扩增反应体系)、和B体系[连接酶检测反应（LDR）体系]；
所述的A体系包括：PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/L KCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]，dNTP，Taq DNA聚合酶、引物、ddH2O；
所述的PCR镁离子缓冲液中镁离子浓度是2.5mM，所述的Taq DNA聚合酶浓度是2.5unit/μl；
所述的B体系包括：1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]，dNTP，Taq DNA连接酶、探针，ddH2O；所述的探针包括3’端探针和5’端探针；
所述的1×连接酶缓冲液的浓度是5mM，所述的Taq DNA连接酶浓度是2.5unit/μl。
所述的引物和所述探针均为5OD的干粉形式，经过12000rpm离心后 加入ddH2O溶解成10pmol/μl浓度并震荡混匀。
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
A、采用引物设计软件设计所述的引物，Tm值分别为55摄氏度、50摄氏度、60摄氏度、62摄氏度；再通过美国AB生物公司合成所述的引物；
B、采用探针设计软件Primer Express设计所述的探针，再通过AB生物公司合成并进行修饰，得到所述的探针；
所述的修饰包括以下步骤：
a.两条5’端探针长度相差3个碱基，差别反应在探针的5’端；
b.两条5’端探针的3’端的最后一个碱基根据SNP位点的基因型确定；
c.两条5’端探针在距离3’端的4-6个碱基位置人为引入与目标序列不互补的1个碱基，目的是增大检测的准确性。
d.除上述描述外，5’端探针的其他位置与基因SNP序列完全互补。
e.3’端探针与目标序列完整互补，并在其5’端添加磷酸基团修饰，在3’端加入FAM荧光修饰；
C、分别配制：A体系中的PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/L KCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]、dNTP、Taq DNA聚合酶；B体系中的1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/LMgCl2]、dNTP、Taq DNA连接酶；
D、将所述的A体系、B体系进行分装处理，得到所述的试剂盒。
一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
A、样本DNA提取：
采集健康志愿者15名（男性10名，女性5名平均年龄55岁）和另外在上海胸科医院采集已确诊由于肺癌而去世的患者的遗体的22名（男性13名，女性9名，患者平均年龄60岁）的外周血或者新鲜的唾液样本，进行DNA提取处理，得到样本DNA；再利用Nanodrop2000微量紫外分光光度计(GENE公司)检测每个DNA样本的浓度，置于零下20摄氏度保存；所述的DNA提取处理利用苯酚氯仿抽提法，该方法参见《分子克隆实验指南（第三版）》（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，2005年3月1日出版）； 上述样本DNA的浓度如下：
| 健康志愿者 | DNA浓度ng/μl | Ratio260/280 |
| A | 1668.5 | 1.81 |
| B | 2341.3 | 1.8 |
| C | 1773.1 | 1.79 |
| D | 1732.2 | 1.83 |
| E | 1996.8 | 1.92 |
| F | 2001.5 | 1.8 |
| G | 598.3 | 1.99 |
| H | 999.8 | 1.85 |
| I | 473.9 | 1.86 |
| J | 4887.5 | 1.87 |
| K | 769.8 | 1.99 |
| L | 889.4 | 2.01 |
| M | 445.2 | 2.03 |
| N | 2278.1 | 2.01 |
| O | 446 | 1.98 |
| 肺癌患者遗体 | DNA浓度ng/μl | Ratio260/280 |
| A | 558.6 | 1.91 |
| B | 5596.4 | 1.85 |
| C | 2875.3 | 1.8 |
| D | 784.42 | 1.96 |
| E | 200.15 | 1.96 |
| F | 225.6 | 2.07 |
| G | 459.8 | 2.03 |
| H | 1589.3 | 1.95 |
| I | 653.2 | 1.88 |
| J | 159.6 | 1.86 |
| K | 558.4 | 2.01 |
| L | 569.4 | 1.95 |
| M | 324.8 | 2 |
| N | 416.6 | 2.07 |
| O | 142.93 | 2.01 |
| P | 961.9 | 1.96 |
| Q | 142.6 | 1.88 |
| R | 1158.6 | 1.49 |
| S | 2569.3 | 1.56 |
| T | 552.2 | 1.63 |
| U | 115.6 | 1.87 |
| V | 248.9 | 1.88 |
[0079] B、PCR扩增反应：
采用本发明所述试剂盒对上述SNP位点rs2239680,rs16969968,rs12910984及rs2298881进行扩增，SNP位点上下游约100-300bp；
以所述的样本DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述的PCR扩增反应采用所述的A体系；
所述的PCR扩增反应中，采用的引物的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17所示，，
以上引物中，核苷酸碱基序列如序列表中SEQ No：1、SEQ ID No：2的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：6、SEQ ID No：7的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：11、SEQ ID No：12的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：16、SEQ ID No：17的序列为一组。
所述的PCR扩增反应的反应体系中含有：
| 模板DNA | 2μl |
| PCR镁离子缓冲液 | 2μl |
| dNTP | 2μl |
| Taq DNA聚合酶 | 0.5μl |
| 10pM上游引物 | 1μl |
| 10pM下游引物 | 1μl |
| ddH2O | 11.5μl |
| Total | 20μl； |
所述的PCR扩增反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保存；
再取上述PCR扩增产物5μL与载样缓冲液（6×Loading Buffer，购自大连TAKAR生物科技有限公司）1μL混匀，再加入1.6%的琼脂糖凝胶中，120V进行电泳检测；其中，琼脂糖为：Agarose RA（购自amresco公司）；缓冲液为：1×TAE缓冲液；电泳仪为购自JINGYI公司的JY600电泳仪。
C、连接酶检测反应：
a.将所述的PCR扩增产物进行纯化处理后，得到纯化后的PCR扩增产物；所述的纯化处理采用切胶回收纯化试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit；将纯化后的PCR扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示，图1中A图为健康志愿者的纯化后的PCR扩增产物，B图为肺癌去世的患者的遗体的纯化后的PCR扩增产物，上述扩增产物的条带单一，纯度高，条件满足下一步实验要求。
b.以所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，进行连接酶检测反应（LDR），得到连接产物；所述的连接酶检测反应采用所述的B体系；
所述的连接酶检测反应中，采用的探针包括5’端探针和3’端探针；
所述的5’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19所示；
所述的3’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：5、SEQ ID No：10、SEQ ID No：15、SEQ ID No：20所示；
以上探针中，核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：8、SEQ ID No：9、SEQ ID No：10的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：15的序列为一组；核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20的序列为一组；
所述的连接酶检测反应反应的反应体系中含有：
| 模板DNA | 2μl |
| 1×连接酶缓冲液 | 2μl |
| dNTP | 2μl |
| Taq DNA连接酶 | 0.5μl |
| 3’端探针 | 3μl |
| 5’端探针上游 | 3μl |
| 5’端探针下游 | 3μl |
| ddH2O | 4.5μl |
[0098]
| Total | 20μl； |
配制以上反应体系的操作应在冰面进行；
所述的连接酶检测反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性4min；阶段2：60℃30s，共40个循环；阶段3：95℃延伸10min；阶段4：4℃保存；
将所述的连接产物进行判读；所述的判读采用ABI377DNA测序仪器。如果产生两种峰的带型，判定为杂合子，如果只有一个峰的条带，判定为纯合子（见图2）。结果如图2所示，出现两个峰的是杂合子AG，出现一个峰的一个是AA，另外一个是GG。
本实施例建立了对多个位点快速，高通量，低成本，高精度的检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，具有较高的使用价值。
本实施例中所述的各个试剂和仪器均为市场上出售的常规产品；
显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (7)
1.一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的引物，其特征在于：所述的引物的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：11、SEQ ID No：12、SEQ IDNo：16、SEQ ID No：17所示。
2.一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的探针，其特征在于：所述的探针的包括5’端探针和3’端探针；所述的5’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：8、SEQ IDNo：9、SEQ ID No：13、SEQ ID No：14、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19所示；所述的3’端探针的核苷酸碱基序列如序列表中SEQ ID No：5、SEQ ID No：10、SEQ ID No：15、SEQ ID No：20所示，所述的3’端探针的核苷酸碱基序列的5’端添加磷酸修饰，3’端加入荧光修饰。
3.一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括由A体系、和B体系；
所述的A体系包括：PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/LKCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]，dNTP，Taq DNA聚合酶、引物、ddH2O；
所述的PCR镁离子缓冲液中镁离子浓度是2.5mM，所述的Taq DNA聚合酶浓度是2.5unit/μl；
所述的B体系包括：1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]，dNTP，Taq DNA连接酶、探针，ddH2O；所述的探针包括3’端探针和5’端探针；
所述的1×连接酶缓冲液的浓度是5mM，所述的Taq DNA连接酶浓度是2.5unit/μl。
4.一种检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒的制备方法，其特征在于：
所述的试剂盒包括由A体系、和B体系；
所述的A体系包括：PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/LKCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]，dNTP，Taq DNA聚合酶、引物、ddH2O；
所述的PCR镁离子缓冲液中镁离子浓度是2.5mM，所述的Taq DNA聚合酶浓度是2.5unit/μl；
所述的B体系包括：1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]，dNTP，Taq DNA连接酶、探针，ddH2O；所述的探针包括3’端探针和5’端探针；
所述的1×连接酶缓冲液的浓度是5mM，所述的Taq DNA连接酶浓度是2.5unit/μl；
所述的制备方法包括以下步骤：
A、采用引物设计软件设计所述的引物，Tm值分别为55摄氏度、50摄氏度、60摄氏度、62摄氏度；再合成所述的引物；
B、采用探针设计设计所述的探针，再进行合成和修饰，得到所述的探针；
C、分别配制：A体系中的PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/L KCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]、dNTP、Taq DNA聚合酶；B体系中的1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/LMgCl2]、dNTP、Taq DNA连接酶；
D、将所述的A体系、B体系进行分装处理，得到所述的试剂盒。
5.一种早期非小细胞肺癌多位点关联基因的检测方法，其特征在于：所述的检测方法利用检测早期非小细胞肺癌多位点关联基因的试剂盒，
所述的试剂盒包括由A体系、和B体系；
所述的A体系包括：PCR镁离子缓冲液[2.5mmol/L MgCl2，500mmol/LKCL,100mmol/L Tris-Cl(PH8.3)]，dNTP，Taq DNA聚合酶、引物、ddH2O；
所述的PCR镁离子缓冲液中镁离子浓度是2.5mM，所述的Taq DNA聚合酶浓度是2.5unit/μl；
所述的B体系包括：1×连接酶缓冲液[10Mm Tris-CL(PH8.0),NaCl3mol/L,60mmol/L MgCl2]，dNTP，Taq DNA连接酶、探针，ddH2O；所述的探针包括3’端探针和5’端探针；
所述的1×连接酶缓冲液的浓度是5mM，所述的Taq DNA连接酶浓度是2.5unit/μl；
所述的检测方法包括以下步骤：
A、样本DNA提取：
采集健康志愿者和已确诊由于肺癌而去世的患者的遗体的外周血或者新鲜的唾液样本，进行DNA提取处理，得到样本DNA；
B、PCR扩增反应：
以所述的样本DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述的PCR扩增反应采用所述的A体系；
C、连接酶检测反应：
a.将所述的PCR扩增产物进行纯化处理后，得到纯化后的PCR扩增产物；
b.以所述的纯化后的PCR扩增产物为模板，进行连接酶检测反应，得到连接产物；所述的连接酶检测反应采用所述的B体系；
所述的连接酶检测反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性4min；阶段2：60℃30s，共40个循环；阶段3：95℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
c.将所述的连接产物进行判读。
6.根据权利要求5所述的早期非小细胞肺癌多位点关联基因的检测方法，其特征在于：
步骤B中，所述的第一次PCR扩增反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
7.根据权利要求5或6所述的早期非小细胞肺癌多位点关联基因的检测方法，其特征在于：
步骤C中，所述的连接检测反应的反应程序为：
阶段1：94℃预变性4min；阶段2：60℃30s，共40个循环；阶段3：95℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
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