CN107723354A - 一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重pcr引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物、试剂盒和方法。本发明的方法是一种高效、可靠的高通量测序序列富集方法。本发明提供的多重PCR联合高通量测序技术的检测方法可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。
Description
技术领域
本发明涉及检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物和方法。
背景技术
肺癌的发病率及死亡率在肿瘤中均位于首位。在过去的三十年来，我国肺癌的死亡率上升了465％，超过肝癌成为死亡率最高的癌症。
肺癌根据组织学可分为小细胞肺癌(small cell lung carcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)，非小细胞肺癌约占肺癌总数的 80％左右，主要分为腺癌(～50％)和鳞癌(～40％)两个亚型。
传统的治疗方法是基于病人的临床特征及病理类型选择化学治疗方案，但无疾病进展期(PFS)只有6.5个月，由于非小细胞肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70％以上的患者在确诊时已是中晚期，错过了最佳手术时期。而非小细胞肺癌各种化疗方案的总体有效性仅为30％左右，同时有些患者无法耐受化疗和放疗以及化疗后很快耐药，从而导致非小细胞肺癌患者确诊后5年生存率很低。近年来，肺癌的个体化用药取得了显著进展，最突出的例子是：以表皮生长因子(EGFR)为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)在含突变型EGFR的非小细胞肺癌患者中显示出显著的疗效，PFS达到了9-13个月。但对于EGFR 野生型患者，TKI治疗效果并不理想，1.5个月的PFS完败于化疗组的6.5个月。随后，以EML4-ALK融合基因为靶点的克唑替尼在非小细胞肺癌的靶向治疗中也显示出同样的临床疗效。ALK抑制剂包括克唑替尼(crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)和alectinib。在一项III期研究中，与化疗相比，克唑替尼用于初治的ALK基因突变的晚期NSCLC患者，其反应率ORR(45％：74％) 和PFS(7个月：10.9个月)均有显著提高。在另一项III期研究中，克唑替尼用于经治的ALK基因突变的晚期NSCLC患者的临床疗效也明显优于单药化疗(ORR 65％：20％；PFS 7.7个月：3个月)。
显然，肺癌的单一的病理分型已不能满足临床需要，需从基因水平明确肺癌组织的突变状况，为靶向药物的临床使用和疗效预测提供分子基础。
高通量测序技术是一项国际先进的新型测序技术，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，大大提高了测序的通量。同时，随着生物信息学的快速发展，通过多基因、多位点的集成式检测分析，可一次性检测分析与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点，给出患者癌组织的基因突变信息，从而指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。同时，也可用于非小细胞肺癌病人的早期诊断和筛查。根据前期研究表明，非小细胞肺癌存在多种基因突变，其中最常见的突变包括致癌基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、ALK、ROS1、MET、RET，更重要的是这些突变临床上均已开发或正在测试靶向药物，对于这些基因突变的检测将更好的指导医生为病人制定针对性的个性化靶向治疗方案。
目前，市场上对于非小细胞肺癌的检测主要停留在单个或几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光PCR、芯片分析等，这些方法的共同缺点是每次只能检测一个突变或一段基因的突变，检测通量低，结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多等。同时，由于晚期病人取材较难，样本量较少，往往不能满足上述方法非小细胞肺癌检测基因突变的需要。一些现有的基于高通量测序技术深度测序方法虽能在通量上满足临床需要，但由于价格昂贵不能在临床应用中普及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物、试剂盒和方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物，所述多重PCR引物的5’-端具有接头序列，所述多重PCR引物的3’-端具有特异性引物序列，所述多重PCR引物的3’- 端特异性结合到目标区域上，所述多重PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～ SEQ ID NO:392所示，核苷酸序列如SEQID NO:1～SEQ ID NO:196所示的引物具有barcode序列，所述barcode序列位于所述接头序列和所述特异性引物序列之间。
所述的致癌基因为EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、ALK、ROS1、 MET、RET，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。本发明的特异性引物SEQ ID No:1～SEQID No:392是针对上述的非小细胞肺癌9个致癌基因的突变位点的特定序列设计的，可以扩增致癌基因EGFR、KRAS、BRAF、 PIK3CA、ERBB2、ALK、ROS1、MET、RET的突变位点区域，扩增产物经高通量测序获得其序列信息，从而检测出样品中这些基因的突变状况。本发明所用引物(SEQ ID No.1～SEQ ID No.392)，可使用多重PCR扩增技术在两管中同时有效的扩增目标序列，所得PCR产物经用于制备测序文库和上机进行高通量测序，所构建的测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit 3.0检测合格后适用于Illumina多种高通量测序平台。
优选地，所述barcode序列是序列长度为10bp的DNA序列。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:196所示的引物的序列不具有所述barcode序列。将SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:196序列中的barcode序列去除之后的引物同样能够用于检测非小细胞肺癌致癌基因突变，这里的barcode序列是用于原始模板上分子量的统计。
本发明提供了一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的试剂盒，包括上述所述的多重PCR引物，还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:393所示的引物。
本发明提供了一种采用上述所述的多重PCR引物或者上述所述的试剂盒检测非小细胞肺癌致癌基因突变的方法。
本发明提供了一种检测非小细胞肺癌致癌基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)第一轮PCR扩增：以待检样本的基因组DNA为模板，用扩增引物混合液R1-barcode、R2-barcode分别进行PCR扩增，获得第一轮PCR产物，所述 R1-barcode包括SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:98所述的引物，所述R2-barcode包括 SEQ ID NO:99～SEQ ID NO:196所述的引物；
(2)第二轮PCR扩增：将步骤(1)中由R1-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F1-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，将步骤(1) 中由R1-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F2-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，所述F1-non barcode包括SEQ ID NO:197～SEQ ID NO:294所示的引物，所述F2-non barcode包括SEQ ID NO:295～SEQ ID NO:392 所示的引物，所述通用的下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:393所示；
(3)第三轮PCR扩增：将步骤(2)获得的PCR产物混合后纯化，再用接头引物进行第三轮PCR扩增，得到测序文库；
(4)将所构建的测序文库采用测序仪进行高通量测序分析，获得非小细胞肺癌致癌基因突变情况。
本发明所述SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:196为带barcode的下游引物，所述的barcode为一段序列长度为10bp的碱基序列，用于原始模板上分子量的统计，理论上，有N个碱基的barcode序列可以有4N种接头，因此10个碱基的barcode序列对于样本分子量的统计是足够的。该组多重PCR引物的特点在于，5’-端具有接头序列、3’-端特异性结合到目标区域上，中间位置为10个碱基长度的barcode 序列。
本发明所述的非小细胞肺癌个体化用药9种相关基因的扩增引物SEQ ID NO:197～SEQ ID NO:392为第二轮PCR扩增的上游引物，该组多重PCR引物的特点在于，5’-端具有接头序列、3’-端特异性结合到目标区域上。
本发明提供的多重PCR联合高通量测序技术的检测方法可以直接反应相关基因的具体突变位点，可以直接用于指导临床非小细胞肺癌靶向用药以及用于癌症早期诊断或辅助诊断及筛查和癌症愈后监测。
优选地，所述步骤(3)中接头序列为用于Illumina测序仪测序文库构建的接头引物。
优选地，所述步骤(4)中将所构建的测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100 和Qubit 3.0检测合格后再进行测序分析。
优选地，所述步骤(4)中测序仪为Illumina NextSeq 500测序仪。
本发明提供了上述所述的多重PCR引物或者上述所述的试剂盒在制备非小细胞肺癌致癌基因文库中的用途。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的方法和试剂盒一次可以检测十几个到几百个样品的非小细胞肺癌9个个体化用药相关基因突变位点。
(2)本发明的检测方法基于多重PCR技术和高通量测序技术，灵敏度高，使用的特异性引物及优化的实验体系，使得检测方法简单易行、重复性好、准确度高，对非小细胞肺癌个体化用药相关基因的突变位点具有检测通量高、检测速度快、准确性和重复性好、安全性高等众多优点，为指导非小细胞肺癌患者的个性化治疗，辅助非小细胞肺癌的早期诊断及癌症愈后检测提供一种高效的方法。
(3)低至20ng DNA的模板起始量，大大节省DNA的使用量。
具体实施方式
实施例1
样本分别有：正常人的血液的基因组DNA、正常人的血浆的cfDNA， MCF10A细胞系基因组DNA、肝癌FFPE基因组DNA，采用DNA提取试剂盒提取各类型样本的基因组DNA，应用SEQ No.1～SEQ No.392对提取得到的基因组DNA进行多重PCR扩增后，采用IlluminaNextSeq 500测序仪进行测序分析，具体实施方法如下：
A、基因组DNA提取：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit，参照试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。获得的基因组DNA进行凝胶电泳和使用NanoDrop 100进行质量检测，要求基因组DNA没有明显的降解，浓度大于20ng/μL， A260/A280>1.8，A260/A230>2.0，并使用Qubit 3.0进行精确定量。
B、第一轮多重PCR扩增：用扩增引物混合液R1-barcode(SEQ ID NO:1～ SEQ IDNO:98)、R2-barcode(SEQ ID NO:99～SEQ ID NO:196)分别进行PCR 扩增，获得第一轮PCR产物；PCR扩增条件为：98℃2分钟、58℃15分钟、 68℃15分钟、68℃7分钟；PCR扩增体系：2×PCR Buffer for KOD-Multi&Epi-5ul、KOD-Multi&Epi-(1.0U/ul)0.2ul、扩增引物混合液1μl、 DNA模板10-200ng，双蒸水补至10μl；
C、将步骤(B)获得的一轮PCR产物分别用扩增引物混合液F1-non barcode (SEQID NO:197～SEQ ID NO:294)、F2-non barcode(SEQ ID NO:295～SEQ ID NO:392)进行第二轮PCR扩增；PCR扩增条件为：94℃5分钟、(98℃10秒、 58℃15分钟、68℃15分钟)，3个循环、68℃5分钟；PCR扩增体系：2× PCR Buffer for KOD-Multi&Epi-12.5μl、KOD-Multi&Epi-(1.0U/ul)0.5ul、扩增引物混合液0.5μl，通用的下游引物(URS)(如表1所示)1.5ul、磁珠纯化后的一轮PCR产物10ul；
D、将步骤(C)获得的第二轮PCR产物混合后磁珠纯化，再用用于Illumina 测序仪测序文库构建的接头引物进行第三轮PCR扩增；PCR扩增条件为：94℃ 3分钟、(98℃10秒、60℃15秒、68℃30秒)，22个循环、68℃5分钟； PCR扩增体系：2×PCR Buffer for KOD-Multi&Epi-25μl、KOD-Multi&Epi-(1.0U/ul)1ul、Illumina接头上游引物1ul、Illumina接头下游引物1ul、磁珠纯化后的二轮PCR产物22ul；
将所构建的测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit 3.0检测合格后采用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序分析。
表1通用的下游引物(URS)(SEQ ID No.393)
| 引物名称 | 序列号 | 序列 |
| URS | SEQ ID No.393 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
数据分析如表2所示：
表2测序数据统计
从表2的测序数据统计中看到：超过95％的短序列能够比对上基因组，比对上基因组的数据中98％以上比对到了目标区域，证明了多重PCR序列富集的高度特异性。此外，本发明对EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ERBB2、ALK、 ROS1、MET、RET目标序列的富集效果达到了99.7％甚至100％覆盖度，并且目标区域平均测序深度达2万X左右。
综上，本发明的方法是一种高效、可靠的高通量测序序列富集方法。本发明的方法对非小细胞肺癌9个个体化用药相关基因的突变位点具有检测通量高、特异性强、样本来源广泛、不易发生污染且安全性高等众多优点，检测结果具有很好的重复性和准确性，对非小细胞肺癌具有较好的辅助诊断和指导治疗作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广州永诺健康科技有限公司、广州永诺医学检验所有限公司
<120> 一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物、试剂盒和方法
<130> 2017
<160> 393
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 148
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn naggacagta tagctcttat tgaagattt 59
<210> 149
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn nagcctcaca atcagattac ctct 54
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<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
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agacgtgtgc tcttccgatc tnnnnnnnnn ngcaaaggac agcacacaga ttta 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Claims (10)
1.一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物的5’-端具有接头序列，所述多重PCR引物的3’-端具有特异性引物序列，所述多重PCR引物的3’-端特异性结合到目标区域上，所述多重PCR引物的核苷酸序列如SEQID NO:1～SEQ ID NO:392所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:196所示的引物具有barcode序列，所述barcode序列位于所述接头序列和所述特异性引物序列之间。
2.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，所述barcode序列是序列长度为10bp的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的多重PCR引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQID NO:196所示的引物的序列不具有所述barcode序列。
4.一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一所述的多重PCR引物，还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:773所示的引物。
5.一种采用如权利要求1-3任一所述的多重PCR引物或者如权利要求4所述的试剂盒检测非小细胞肺癌致癌基因突变的方法。
6.一种基于高通量测序检测非小细胞肺癌致癌基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)第一轮PCR扩增：以待检样本的基因组DNA为模板，用扩增引物混合液R1-barcode、R2-barcode分别进行PCR扩增，获得第一轮PCR产物，所述R1-barcode包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:98所述的引物，所述R2-barcode包括SEQ ID NO:99～SEQ ID NO:196所述的引物；
(2)第二轮PCR扩增：将步骤(1)中由R1-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F1-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，将步骤(1)中由R1-barcode扩增获得的PCR产物用扩增引物混合液F2-non barcode以及通用的下游引物进行PCR扩增，所述F1-nonbarcode包括SEQ ID NO:197～SEQ ID NO:294所示的引物，所述F2-non barcode包括SEQID NO:295～SEQ ID NO:392所示的引物，所述通用的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:393所示；
(3)第三轮PCR扩增：将步骤(2)获得的PCR产物混合后纯化，再用接头引物进行第三轮PCR扩增，得到测序文库；
(4)将所构建的测序文库采用测序仪进行高通量测序分析，获得非小细胞肺癌致癌基因突变情况。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中接头序列为用于Illumina测序仪测序文库构建的接头引物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中将所构建的测序文库经Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit 3.0检测合格后再进行测序分析。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中测序仪为IlluminaNextSeq 500测序仪。
10.如权利要求1-3任一所述的多重PCR引物或者如权利要求4所述的试剂盒在制备非小细胞肺癌致癌基因文库中的用途。
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