CN106834444A

CN106834444A - 一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂

Info

Publication number: CN106834444A
Application number: CN201611272610.2A
Authority: CN
Inventors: 杨学习; 吴英松; 李明; 王庆; 曹治家
Original assignee: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd
Current assignee: Guangzhou Da Rui Biotechnology Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序平台的肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂，用于检测肺癌相关基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA四种基因的50个突变位点。检测方法包括样本DNA提取、多重PCR富集目的片段、引物消除、接头连接、文库扩增、文库检测、高通量测序等步骤。本发明降低了建库成本，减少了PCR扩增中引入突变的可能性，使得测序结果更加精确，提高检测通量及检测灵敏度，同时可以为肺癌的分子诊断及个体化用药提供参考。

Description

一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂

技术领域

本发明设计基因测序领域，特别是高通量测序领域，具体是一种基于Ion Torrent测序平台的肺癌相关基因突变检测方法、一组引物对及试剂。

背景技术

肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。目前化疗是治疗中、晚期肺癌的主要手段，也是患者术前、术后辅助治疗的方法之一。临床上部分患者化疗效果欠佳、化疗失败，其主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物不敏感或产生耐药。因此，了解患者对化疗药物敏感性的相关因素，对于肺癌患者进行个体化治疗显得尤为重要。

EGFR基因位于7p12，编码酪氨酸激酶型受体。EGFR的酪氨酸激酶功能区由外显子18～24编码。EGFR与配体结合形成二聚体激活细胞内的激酶通路，进一步诱导下游通路的磷酸化，诱导细胞增殖。腺癌EGFR基因突变的发生率在亚洲人群达到50％，在不吸烟者、女性以及非粘液性肿瘤中发生率更高。迄今为止发现的EGFR基因突变主要位于外显子18～21，尤其是G719S和L861Q，与肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感度密切相关。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能特异性地抑制具有EGFR基因突变的非小细胞肺癌的生长，改善预后。因此，《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》推荐，在使用酪氨酸激酶抑制剂治疗前，肺癌患者进行EGFR基因的突变检测。

KRAS基因位于12p12.1，是常见的致癌基因，KRAS突变在吸烟者以及粘液性肺腺癌中最常见，多达30％的肺腺癌有KRAS突变，是NSCLC的预后不良因素以及EGFR-TKI疗效不佳的预测指标。KRAS突变以点突变为主，常见12、13和61号密码子的突变。当KRAS基因正常时，能控制调控细胞生长的通路，抑制肿瘤细胞生长；当KRAS发生突变时，会导致细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。根据2014年美国国立综合癌症网络(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)的《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》，KRAS突变和EGFR-TKI内源性耐药有关，KRAS野生型患者建议接受EGFR-TKI治疗，在患者使用EGFR-TKI药物治疗前，推荐进行KRAS基因的突变检测。

BRAF基因位于7q34，是一种原癌基因，BRAF基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡。非小细胞肺癌中BRAF突变率约为3％，其中大部分是肺腺癌。BRAF突变主要发生在15号外显子上的激活区：如V600E、V600K、V600D，其中有80％～90％是发生V600E突变，BRAF突变导致肺癌患者对EGFR-TKI出现耐药情况，因此检测BRAF基因突变对于指导肺癌患者的靶向用药具有重要意义。

PIK3CA基因位于3q26.3，PIK3CA编码I类PIK-3-激酶(PI3K)的p110催化亚单位。PIK3CA基因突变导致p110a酶活性增强，减少细胞对生长因子的依赖、抑制细胞的凋亡、促进肿瘤细胞的侵袭。研究结果表明，非小细胞肺癌中PIK3CA基因突变率为1％～4％。PIK3CA突变通常发生在第10和21号外显子，如E542K、E545K和H1047R。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物出现耐药。所以，检测PIK3CA基因突变，可以预测肺癌患者对EGFR-TKI等药物的耐药性，对于指导患者的靶向用药具有重要意义。

目前，常见的基因检测突变方法有Sanger测序法和荧光定量PCR法。Sanger测序法中，操作繁琐，灵敏度较低，假阴性率较高；荧光定量PCR法，每对引物只能检测一种突变，检测多突变位点操作繁琐，需要样本量较大。因此，采用灵敏度高、样本需求量少、可同时检测多位点突变的高通量测序法(NGS)更有利于可以研究和临床使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高通量测序平台的肺癌相关基因突变检测方法、一组引物对及试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种肺癌相关基因基因突变的高通量检测方法，所述相关基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA 4个基因50种突变位点。

作为本发明进一步的方案：上述肺癌相关基因突变情况包括检测以下4个基因50种突变位点的突变情况：

本发明中检测肺癌相关基因突变情况采用特异性引物多重PCR扩增的方法建库并测序。本发明提供了一种基于Ion Torrent测序平台的肺癌相关基因突变检测方法，具体步骤如下：

(1)样本DNA提取：石蜡包埋组织或新鲜组织样本进行DNA提取，得到gDNA后进行浓度测定；

(2)目的片段扩增：将gDNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；

(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；

(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；

(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；

(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；

(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；

(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序。

作为本发明进一步的方案：所述的突变位点1-50各自对应的多重PCR扩增引物依次为：

1-3，引物对1，引物序列如表1所述；

4-22，引物对2，引物序列如表1所述；

23-27，引物对3，引物序列如表1所述；

28-29，引物对4，引物序列如表1所述；

30-36，引物对5，引物序列如表1所述；

37-40，引物对6，引物序列如表1所述；

41-43，引物对7，引物序列如表1所述；

44-47，引物对8，引物序列如表1所述；

48-49，引物对9，引物序列如表1所述；

50，引物对10，引物序列如表1所述；

表1 多重PCR扩增引物对序列

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中PCR反应的循环数为22。

作为本发明进一步的方案：步骤(3)中引物消除试剂为Life Technologines公司的FuPa Reagent，加入量为20μL PCR反应体系加入2μL引物消除试剂。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的P1接头为：

5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’

5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcode x：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’

5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode x代表的具体序列如下：

Barcode 1：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’

5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 2：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 3：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 4：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’

5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 5：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 6：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 7：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 8：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’

5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 9：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 10：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 11：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’

5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 12：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 13：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’

5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 14：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’

5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 15：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’

5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 16：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’

5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

作为本发明进一步的方案：步骤(4)所述接头连接反应的体系为30μL，接头连接反应的体系具体为：

作为本发明进一步的方案：步骤(5)中所用磁珠为XPReagent。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增反应液为PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity，文库扩增引物为Library Amplification Primer Mix。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增体系为52μL，具体为向步骤(5)产物中加入50μL PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL Library AmplificationPrimer Mix。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增的PCR循环数为5～7。

本发明提供了一种试剂，该试剂包括上述引物对。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的方法通过单次同时对EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA4个基因50种突变位点的突变情况进行检测，可以降低了建库成本，减少了PCR扩增中引入突变的可能性，使得测序结果更加精确，提高检测通量及检测灵敏度，同时也可以为肺癌的分子诊断及个体化用药提供参考。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明公开了肺癌相关基因肺癌相关基因突变检测方法，所有试剂均可由市场购得：其中，5×Ion Ampliseq^TM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion Ampliseq^TM PrimerPool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1Adapter和Ion Xpress^TM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，Platium^TM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，LibraryAmplification Primer Mix(Life公司)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：基于Ion Torrent测序平台的肺癌相关基因突变检测方法

本实施例采用以下试剂：5×Ion Ampliseq^TM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion Ampliseq^TM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1Adapter和IonXpress^TM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，Platium^TM PCR SuperMix HighFidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)，Nuclease-FreeWater，无水乙醇。

本方法实验前需要新鲜配置一种试剂：75％乙醇。

本实验需要用到的仪器和设备：离心机、磁力架、移液器、PCR仪、振荡器、荧光计Qubit3.0。

主要实验步骤：

(1)待测样本的gDNA提取

本实施例中，gDNA样本来自石蜡包埋组织样本或新鲜组织样本。采用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit或QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤提取。

(2)对待测样本gDNA进行Qubit 3.0浓度测定

本实施例中，gDNA样本采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。

(3)目的片段扩增。按照以下体系加入各试剂进行PCR扩增：

反应条件：

(4)引物清除

向PCR产物中加入2μL引物清除试剂FuPa Reagent，涡旋混匀，瞬时离心，根据如下程序进行反应：

(5)接头连接

1)稀释混合接头，形成Barcode Adapter Mix；

2)在清除引物后的PCR产物中加入以下组分，涡旋混匀，瞬时离心。

P1接头为：

5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’

5’-ATCACCGACTGCCCAIAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’

样本接头分别如下：

Barcode x：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’

5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode x代表的序列如下：

Barcode 1：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’

5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 2：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 3：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 4：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’

5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 5：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 6：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 7：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 8：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’

5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 9：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 10：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 11：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’

5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 12：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 13：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’

5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 14：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’

5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 15：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’

5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode 16：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’

5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

(6)纯化连接产物

磁珠纯化连接产物，采用XP Reagent纯化产物：

1)将PCR产物转移至1.5ml EP管内，加入45μLXP Reagent，吹打混匀；

2)室温孵育5min；

3)将样本放置磁力架上，静置3mn至管内溶液澄清，小心吸取上清液并弃去；

4)加入300μL新鲜配制的75％乙醇，转动EP管清洗磁珠，弃去乙醇；

5)重复步骤4)一次；

6)室温晾干磁珠，不要过度干燥(风干即可，不要开裂)。

(7)文库扩增，在纯化后晾干的磁珠中加入50μL文库扩增酶Platium^TM PCRSuperMix High Fidelity和2μL文库扩增引物Library Amplification Primer Mix，重悬磁珠，转移至PCR管中，涡旋混匀，进行PCR扩增。

反应条件：

(8)文库进行磁珠纯化，采用XP Reagent磁珠纯化产物：

1)每管加入25μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。

2)将EP管置于磁力架上，吸附3min至溶液变澄清之后，将上清液转移到另一标记的EP管中，注意不要吸到磁珠。

3)每管加入60μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。

4)将EP管置于磁力架上，吸附3分钟至溶液变澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠。

5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，轻轻旋动EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠。

6)重复上一步。

7)取下EP管，低速离心10秒。将EP管置于磁力架上，用移液枪吸去残留溶液，注意管壁上不能有残留。将EP管盖打开，室温静置5分钟，晾干磁珠。

8)吸取50μL洗脱液于EP管内，涡旋混匀，离心5秒，室温放置5分钟。

9)将EP管置于磁力架上，静置3分钟至溶液澄清后，小心转移液体到新的EP管中，并标记文库名称。

(9)检测文库浓度

DNA文库采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。文库建议根据下列公式稀释到200pmol/L，稀释后使用荧光定量PCR仪定量，等质量混合后上机测序。

(10)高通量测序

对混合文库采用Ion Proton或Ion PGM测序平台进行高通量测序。

通过对Ion Torrent测序平台的测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过97％，均一性平均达到100％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的内容视为限制所涉及的权利要求。

Claims

1.一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂，其特征在于基于高通量测序技术检测肺癌相关基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA四种基因外显子的50个突变位点，包括如下：

且所述的突变位点1-50各自对应的多重PCR扩增引物依次为：

1)1-3的引物对：

上游引物：5’-TGTGGAGCCTCTTACACCCA-3’

下游引物：5’-GTGCCAGGGACCTTACCTTATAC-3’；

2)4-22的引物对：

上游引物：5’-ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA-3’

下游引物：5’-CTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’；

3)23-27的引物对：

上游引物：5’-CCACACTGACGTGCCTCTC-3’

下游引物：5’-GTCTTTGTGTTCCCGGACATAGT-3’；

4)28-29的引物对：

上游引物：5’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’

下游引物：5’-GCATGTGTTAAACAATACAGCTAGTG-3’；

5)30-36的引物对5：

上游引物：5’-CAAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3’

下游引物：5’-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3’；

6)37-40的引物对：

上游引物：5’-TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3’

下游引物：5’-GTAAAAGGTGCACTGTAATAATCCAGACT-3’；

7)41-43的引物对：

上游引物：5’-CATACTTACCATGCCACTTTCCCTT-3’

下游引物：5’-TTTCTTTTTCTGTTTGGCTTGACTTGA-3’；

8)44-47的引物对：

上游引物：5’-CCACAAAATGGATCCAGACAACTGT-3’

下游引物：5’-GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTA-3’；

9)48-49的引物对：

上游引物：5’-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACAATGA-3’

下游引物：5’-GCACTTACCTGTGACTCCATAGAAA-3’；

10)50的引物对：

上游引物：5’-TGGAATGCCAGAACTACAATCTTTTGAT-3’

下游引物：5’-GTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征还在于具体实施步骤如下：

3.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(2)中的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：

4.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(2)中PCR反应的循环数为22。

5.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征在于，步骤(3)中引物消除试剂为LifeTechnologines公司的FuPa Reagent，加入量为20μL PCR反应体系加入2μL引物消除试剂。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征还在于，步骤(4)中的P1接头序列分别为：

5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和

5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’。

7.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(4)中的特异性接头序列是由如下正反两个序列组成的Barcode x：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’

5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode x代表的序列如下：

Barcode1：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’

5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode2：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode3：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode4：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’

5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode5：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode6：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode7：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode8：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’

5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode9：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode10：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode11：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’

5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode12：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode13：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’

5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode14：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’

5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode15：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’

5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’

Barcode16：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’

5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’。

8.根据权利要求1所述的检测步骤，其特征在于，步骤(4)所述接头连接反应的体系为30μL，接头连接反应的体系具体为：

9.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征在于，步骤(5)中所用磁珠为

10.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(6)中文库扩增反应液为Platium^TM PCR SuperMix High Fidelity，文库扩增引物为Library AmplificationPrimer Mix。

11.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(6)中文库扩增体系为52μL，具体为向步骤(5)产物中加入50μL Platium^TM PCR SuperMix High Fidelity和2μLLibrary Amplification Primer Mix。

12.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(6)中文库扩增的PCR循环数为5～7。

13.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(7)中文库检测采用的是KAPA公司的KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix。