CN104630375A - 癌症基因突变及基因扩增检测 - Google Patents

癌症基因突变及基因扩增检测 Download PDF

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Abstract

本发明基于多重PCR和高通量测序技术，提供了用于同时检测样品中一个或多个癌症驱动基因的两个或更多个外显子的多个区域突变的引物组；包含该引物组的试剂盒；使用所述引物组和/或试剂盒扩增所述癌症驱动基因或检测所述癌症驱动基因的外显子突变的方法。本发明的突变检测结果可用于指导癌症的临床用药、辅助诊断或用于某些癌症的预后判断。

Description

癌症基因突变及基因扩增检测
发明领域
本发明涉及癌症突变高发基因的检测。本发明提供了基于多重PCR和高通量测序技术的用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的引物组、试剂盒和检测方法。所提供的检测结果例如可用于辅助诊断或指导临床用药方案。
背景技术
癌症是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病，我国每年因癌症死亡的人数就高达270万，其中以肺癌及胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤最为严重，而女性中以乳腺癌为首的妇科肿瘤也是癌症死亡的主要原因。据统计，我国肺癌的发病率为53.57/10万，死亡率高达45.57/10万，均处于所有恶性肿瘤之首，胃癌则以36.21/10万的发病率仅次之，而乳腺癌以42.55/10万的发病率处于女性肿瘤之首。
抗肿瘤靶向药物是目前治疗癌症较为有效的一种手段，2013年全球销量前十大药物近一半为抗肿瘤靶向药物，抗肿瘤靶向药物和其他化疗药物疗效和毒副作用都因人而异，这是因为本质上讲，癌症是一种多基因突变造成的疾病。关键基因的突变、截断、错位或融合等导致肿瘤发生。由于无节制增长，肿瘤细胞发生了更多的基因突变，导致肿瘤恶性化程度加深、转移和抵抗治疗，识别个体肿瘤特异性的驱动基因突变就成了有效的选择靶向药物应用的关键。目前NCCN(美国国立综合癌症网络)已对多种靶向药物使用作出规定，建议其在用于肿瘤治疗前进行基因突变检测以确定是否适合用药，例如吉非替尼(gefitinib)、曲妥珠单抗等(Trastuzumab)。
随着科技发展，抗肿瘤药物的发展也表现出药物使用从单一到联合的趋势。以前靶向药物以单药加化疗为主，但大多数肿瘤是多基因疾病，针对单个靶点治疗虽然能延长生存，但很少能根治，故目前多个靶向药物的联合治疗研究越来越多，最成功的例子就是BRAF和MEK抑制剂联合治疗黑色素瘤。因此，同时能快捷地检测多个药物靶点基因检测方法就变得尤为重要，结合高通量测序的完全个体化的基因治疗也被认为是肿瘤治疗最终努力的方向。
常见的癌症相关基因包括下列基因：
BRAF基因编码B-Raf蛋白。BRAF基因突变常见于黑色素瘤(50％)、非小细胞肺癌(1-3％)，结直肠癌(8–15％)、脑胶质瘤(4.0％)、卵巢癌(11％)及胃间质瘤等高发肿瘤中，其中以15号外显子的V600E突变尤为常见。
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)为表皮生长因子受体，属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族。EGFR中的突变在非小细胞肺癌患者中的发生频率高达35％，主要发生在18、19、20和21号外显子上，而又以19号外显子的p.E746_A750delELREA突变和21号外显子上的p.L858R突变最为常见。此外，EGFR中的突变还见于脑胶质瘤(26％)和胃腺癌(10％)中。EGFR中的突变可直接激活细胞下游的多种信号途径，包括与细胞存活相关的PI3K-AKT-mTOR途径，以及与细胞增殖相关的RAS-RAF-MEK-ERK途径。
KRAS基因编码K-Ras蛋白。KRAS基因突变多发于非小细胞肺癌(15-25％)、结直肠癌(36–40％)、卵巢癌(14％)及甲状腺癌等肿瘤中，主要发生在第2、3号外显子上，KRAS突变可导致RAS GTP酶的组成性激活，这种激活状态不受生长因子信号的调控，这一结果导致细胞的持续增殖，并使EGFR TKI类药物效果降低。
PIK3CA基因编码p110α蛋白，其为组成磷脂酰-3-激酶(PI3K)的催化亚基之一。PI3K可参与激活下游的某些重要的信号蛋白，如AKT等。PIK3CA基因的突变主要发生在第9和20号外显子，常发生于非小细胞肺癌(1–3％)、乳腺癌(26％)、结直肠癌(10–30％)、卵巢癌(6.7％)等肿瘤中，有研究认为PIK3CA的激活突变可能和癌细胞对EGFR TKI类药物产生抗性有关。
HER2(又称ErbB2)基因与EGFR一样同属于受体酪氨酸激酶家族，其基因突变常见于非小细胞肺癌(2–4％)及乳腺癌(2％)中，而其扩增突变常发生于多种肿瘤如乳腺癌(18％)、胃癌(7～34％)、结直肠癌(3％)、食管癌(15％)及肺癌(22.8％)中。HER2的突变可激活细胞下游多种信号途径，包括涉及细胞存活的PI3K-AKT-mTOR途径和涉及细胞增殖的RAS-RAF-MEK-ERK途径。
目前已有不少针对上述基因的药物，如针对EGFR基因为靶点的有吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)，针对BRAF基因突变的药物有维罗非尼(Vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)，针对HER2基因突变或扩增的有拉帕替尼(Lapatinib)、阿法替尼(Afatinib)以及曲妥珠单抗(Trastuzumab)等。
DNA碱基突变(包括点突变、插入突变和删除突变等)和基因扩增突变(即基因拷贝数增加)是肿瘤细胞中最常见的两种突变方式，也是在相关药物研发中常用的靶标。目前常见的检测多基因突变的方法主要有荧光PCR法和一代Sanger测序法。荧光PCR法具有灵敏度高的特点，且技术已经成熟，应用广泛，但是每对引物只能检测一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR反应体系，导致样品用量较大，且无法同时检测大量的样品或位点；一代Sanger测序法单对引物可检测多个突变，具有成本低等特点，但每次扩增只能使用一对引物，无法同时检测多个基因或多个样品，而且所需样品量大，且对低频突变的检测不够令人满意。
传统的检测基因扩增的经典方法为FISH(荧光原位杂交技术)，该技术有较好的灵敏度，其最大的优点是可直观地在细胞核层面观察基因扩增情况，并且可通过荧光的亮度强弱来推测基因拷贝数的多少，但是该方法成本较高，对技术人员的操作也有较高要求，且其结果判断容易受多种因素影响，如多倍体细胞等等。
多重PCR技术目前在多基因多位点的扩增上有较好的应用，而相比普通PCR其也具有高效、可对模版定量或定性等优点，但其体系构建需综合目标序列的同源性和长短、引物动力学、PCR反应条件优化等多种因素，例如目标序列的长度范围太大可能导致扩增效率不均匀，引物浓度配比不当或者引物间形成易形成二聚体均可影响总体扩增效率或者扩增均匀性，目前市场上或者实验中同一体系一般较少超过同时存在五至六对引物的情况，由此可见其在技术实现上具有相当难度和要求。
因此，仍然需要进一步开发对DNA碱基突变和基因扩增突变的检测工具，以实现对癌症驱动基因的更有效、更准确的检测。
发明内容
除非另外说明，本申请中的各个术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。
本发明基于多重PCR和高通量测序技术开发出用于同时检测样品中一个或多个癌症驱动基因的两个或更多个外显子的多个区域突变的引物组、试剂盒和检测方法。所述癌症驱动基因特别是BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因。所述突变可以是一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失，或基因扩增突变。
本发明的检测引物可用于扩增BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因的外显子上的相应区域，然后将扩增的目标片段进行高通量测序，获得目标片段的序列信息，并由此获得突变检测结果。
因此，本发明的目的是提供用于同时检测样品中一个或多个癌症驱动基因的两个或更多个外显子的多个区域突变的引物组；包含该引物组的试剂盒；使用所述引物组和/或试剂盒扩增所述癌症驱动基因或检测所述癌症驱动基因的外显子突变的方法。
根据本发明的一个方面，提供用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因的一个或多个外显子的突变的引物组，包含用于在一个多重PCR中同时扩增选自BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因的一个或多个基因的一个或多个外显子的多个区域的检测引物对，其包含选自表1引物对中的至少3对引物：
表1检测引物对
在一些实施方案中，所述引物组包含上述表1中引物对中的至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对、至少14对、或全部15对引物。
在一些实施方案中，本文所述的“一个多重PCR反应”在同一反应体系中进行多重PCR反应。
在一些实施方案中，本文所述的“突变”是指基因的外显子的区域中的一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失，和/或基因的外显子的区域的扩增突变。所述扩增突变是指基因或基因的外显子或基因的外显子的区域的拷贝数选择性地增加的现象和过程，属于基因拷贝数变异(Copynumber variations,CNV)的一种。扩增突变很有可能导致相应蛋白表达的增加。
因此，上述检测引物对可用于扩增EGFR基因的外显子18、19、20、21，PIK3CA基因的外显子9、20，BRAF基因的外显子11、15，KRAS基因的外显子2、3，HER2基因的外显子19、20、21中的相应区域，对扩增获得的片段进行高通量测序，根据测序获得的序列信息，可获得上述基因外显子上的相应区域的突变(一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失)检测结果。
在一些实施方案中，所述多重PCR的反应条件为99℃预热2min，每个循环99℃变性15s，60℃退火4min，共23个循环，最后储存于10℃。
在进一步优选的实施方案中，所述引物组还包含用于检测HER2基因扩增突变的平衡引物对，所述平衡引物对包括选自下列表2的平衡引物对中的多对引物：
表2平衡引物对
在本发明中，引物序列中的“n”表示与A(腺嘌呤)互补的任何碱基。
如本文所定义的，“平衡引物对”用于确定待测样品扩增的基准值，以保证HER2扩增突变检测算法中均一化的准确性。平衡引物对包含多对引物，其针对的靶序列应均匀分布于全基因组上。本发明中，平衡引物对和检测引物对在一个多重PCR反应中同时扩增。
用上述针对HER2基因外显子的检测引物对扩增HER2基因的外显子19、20和21中的相应区域，并利用上述100对平衡引物扩增基因组DNA，对扩增获得的片段进行高通量测序，根据测序获得的序列信息，可获得HER2基因的扩增突变的检测结果。在一些实施方案中，同时还利用相应的检测引物对扩增EGFR基因的外显子18、19、20和/或21，PIK3CA基因的外显子9和/或20，BRAF基因的外显子11和/或15，和/或KRAS基因的外显子2和/或3，将这些引物对也作为平衡引物的一部分，并对扩增获得的片段进行高通量测序，用于检测HER2基因的的扩增突变。
在优选的实施方案中，所述引物组适用于癌症(特别是肺癌)EGFR TKI治疗的敏感性检测，且由下列引物组成：
用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示；和
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:13和14所示。
在另一个优选的实施方案中，所述引物组适用于癌症(特别是结直肠癌、肺癌，食管癌、胃癌)治疗中EGFR TKI(特别是吉非替尼、厄洛替尼)及EGFR抗体(特别是西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗的耐药性检测，且由下列引物组成，适用于：
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:3和4所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:9和10所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:11和12所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:15和16所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:17和18所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:19和20所示；和
用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:21和22所示。
在另一个优选的实施方案中，所述引物组适用于癌症(特别是肺癌)治疗中EGFR、ERBB2双抑制剂(特别是阿法替尼)的敏感性检测，且由下列引物组成：
用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:13和14所示；和
用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:25和26所示。
在另一个优选的实施方案中，所述引物组适用于癌症(特别是乳腺癌，食管癌、胃癌)治疗中HER2抗体(特别是曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)敏感性检测，且由下列引物组成：
用于扩增HER2基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:23和24所示；
用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:25和26所示；
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:27和28所示；
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:29和30所示；和
SEQ ID NO:31-230所示的平衡引物对。
根据本发明的另一个方面，提供用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因突变的试剂盒，包含上述的引物组。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于从所述样品提取基因组DNA的试剂。从样品中提取基因组DNA是本领域的常规技术，并且目前市场上有很多成熟完善的商品化试剂可供选择。例如，基因组DNA的提取可包括组织包埋、提取DNA、质量控制以及定量等步骤。本申请的实施例也提供了示例性的方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含利用所述引物进行多重PCR反应的试剂。多重PCR是本领域中已知的技术，主要的反应组分包括模板(即上述的基因组DNA)、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。多重PCR反应所使用的设备以及反应参数是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重PCR方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。多重PCR产物一般无法直接用于高通量测序，还需要进行处理，例如，末端修复，连接接头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。高通量测序通常是在微孔芯片上进行的。目前，商业化的芯片和反应试剂容易购得，例如可购自LifeTechnologies Inc.。在优选的实施方案中，所述高通量测序是Ion Torrent测序。
本发明所包含引物，可应用多重PCR扩增技术在一管中同时等效率地扩增目标序列，其目标序列产物可通过连接酶的作用接上所需接头，其后可用于后续的扩增、文库制备和测序。所建文库经agilent2100和qubit2.0检测合格后适用于多种高通量测序平台，包括目前常见的LifeTechnologies公司的Ion PGM测序仪以及Illumina公司的HiSeq 2000及MiSeq等测序仪。
在一些实施方案中，高通量测序为Ion Torrent测序，优选使用Life Technologies公司的Ion PGM测序仪进行。Ion Torrent测序技术也被本领域技术人员称为二代测序技术，其是基于DNA合成过程所产生的化学变化。DNA聚合酶以单链DNA为模板，按碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部pH变化。Ion Torrent半导体测序芯片的每个微孔里的微球表面含有约100万个DNA分子拷贝。测序时核苷酸分子连续流过芯片微孔。如果一个核苷酸与某个微孔中的DNA分子互补，则该核苷酸被合成到DNA分子中，并且释放质子，该微孔中溶液的pH发生变化。离子传感器检测到pH变化后，将该化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无质子释放，也就没有电压信号的变化。Ion Torrent测序技术属于直接检测DNA的合成，即，边合成边检测，这特别适合于多重PCR中多种不同扩增产物的测序。另外，Ion Torrent测序技术不需要CCD扫描、荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间，从而提高了检测效率。
出于对测序进行质量控制的目的，在一些实施方案中，试剂盒包含阳性和/或阴性对照。
根据本发明的又一个方面，提供体外同时扩增一个或多个癌症驱动基因的一个或多个外显子的多个区域的方法，包括以下步骤：
(1)获得样品的基因组DNA；
(2)利用上述引物组或上述试剂盒对所述基因组DNA进行多重PCR扩增。
在优选的实施方案中，所述多重PCR的反应条件为99℃预热2min，每个循环99℃变性15s，60℃退火4min，共23个循环，最后储存于10℃。
根据本发明的又一个方面，提供体外非诊断目的检测一个或多个癌症驱动基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)获得样品的基因组DNA；
(2)利用上述引物组或上述试剂盒对所述基因组DNA进行多重PCR扩增；
(3)对扩增产物进行高通量测序；以及
(4)分析测序结果，确定BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因中是否发生突变。
在优选的实施方案中，所述多重PCR的反应条件为99℃预热2min，每个循环99℃变性15s，60℃退火4min，共23个循环，最后储存于10℃。
在一些实施方案中，所述高通量测序是Ion Torrent测序。
在一些实施方案中，所述突变是指BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因的外显子的区域中的一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失，和/或HER2基因的扩增突变。
当检测BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因的外显子的区域中的一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失时，所述“分析测序结果”指将测序结果与基因的参考序列进行比对。
当样品的HER2基因发生扩增时，其目标产物的扩增拷贝数也会相应增高，通过计算均一化后样品HER2基因目标序列拷贝数与对照样品中相应拷贝数的比值可确定样品中HER2基因是否存在扩增现象，具体算法如下：
K＝(Cn/C)*(S/An)
其中K为扩增比例，Cn为正常样品检测结果中所有扩增序列的总拷贝数，C为被检测样品检测结果中所有扩增序列的总拷贝数，S为被检测样品结果中HER2基因目标序列的拷贝数，An为正常样品检测结果中HER2基因目标序列的拷贝数，当K值大于或等于1.3时，则认为HER2基因存在扩增突变现象。
因此，当检测HER2基因的扩增突变时，所述“分析测序结果”指对测序结果应用上述算法，并确定HER2基因存在扩增突变现象。
根据本发明的另一个方面，提供上述引物组或试剂盒在制备用于辅助诊断癌症或肿瘤的试剂中的应用。
根据本发明的又一方面，提供上述引物组或试剂盒在制备用于癌症或肿瘤预后判断的试剂中的应用。
根据本发明的再一方面，提供上述引物组或试剂盒在指导癌症或肿瘤治疗临床用药的试剂中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述样品是组织样品。在本发明的另一些实施方案中，所述样品是主体的外周血。
本发明可适用的癌症或肿瘤包括但不仅限于肺癌、结直肠癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、胃间质瘤、黑色素瘤、卵巢癌。
在一些实施方案中，样品为癌症组织样品或肿瘤组织样品，或者来自癌症患者或肿瘤患者的外周血。例如，由此得到的检测结果可用于指导用药方案。
在一些实施方案中，样品为疑似癌症样品或疑似肿瘤组织样品，或者来自疑似癌症主体或疑似肿瘤主体的外周血。例如，由此得到的癌症驱动基因突变结果可以辅助癌症的诊断。
本发明所述的“癌症组织样品”或“肿瘤组织样品”是指包含癌细胞或肿瘤细胞的样品，“疑似癌症组织样品”或“疑似肿瘤组织样品”是指可能包含癌细胞的样品。示例性的样品包括但不限于，癌组织活检、病理切片等。
本申请提供的试剂盒和检测方法采用多重PCR和高通量测序技术，能够同时高效且等效率地扩增目标基因片段并同时检测多个样品中多个癌症驱动基因中的多处突变，具体地，可检测肿瘤样品五种常见驱动基因EGFR、PIK3CA、KRAS、BRAF和/或HER2的突变高发区域(EGFR外显子18、19、20、21，PIK3CA外显子9、20，BRAF外显子11、15，KRAS外显子2、3、HER2外显子19、20、21)发生的碱基突变，扩增和检测效率高，且扩增均匀，还可以检测肿瘤常见驱动基因HER2基因的扩增突变，且对低频突变检测效果好。在多重PCR中，引物对的设计对于扩增产物的质量有一定的影响，例如，扩增产物的量是否足够用于高通量测序以及扩增产物的量是否平衡分布等，而本发明所提供的多个引物对能够均匀扩增目标片段，良好地满足多重PCR以及随后的高通量测序的要求，避免检测中出现假阳性，并减少HER2基因扩增突变检测计算中均一化的误差，保证结果的准确性。
根据本发明所提供的突变检测结果可用于指导临床用药方案，上述引物组或试剂盒所测基因突变可为肿瘤治疗中靶向药物的重要靶点，目前已有不少针对该基因的药物，如针对EGFR基因为靶点的有吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)，针对BRAF基因突变的药物有维罗非尼(Vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)，针对HER2基因突变或扩增的有拉帕替尼(Lapatinib)、阿法替尼(Afatinib)以及曲妥珠单抗(Trastuzumab)等。因此，本发明所提供的突变检测结果可以为肺癌EGFR靶向药物(例如厄洛替尼、吉非替尼)、BRAF靶向药物(例如维罗非尼、达拉非尼)、EGFR&HER2双靶点药物(例如达沙替尼)和MEK靶点药物的用药选择提供指导和依据。本发明提供的突变检测结果还可以用于辅助诊断或者可用于制备肿瘤诊断试剂；或者，可用于某些癌症的预后判断，例如，NCCN(美国国立综合癌症网络)中就指出，携带BRAF V600E突变的转移性结直肠癌(mCRC)患者其预后就相比BRAF野生型的患者要差。
应当理解，利用本发明的引物组、试剂盒或检测方法对多个癌症驱动基因的多个突变进行检测的意义不仅在于提供提高覆盖度，减少漏检率，还在于对单个个体中双基因/位点或多基因/位点突变的检测，例如，可以为临床用药方案提供更准确的指导。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
附图说明
图1是使用15对检测引物对进行多重PCR+高通量测序的测序深度(coverage)统计结果。
图2是使用15对检测引物对和100对平衡引物对进行多重PCR+高通量测序的测序深度(coverage)统计结果。
图3是用15对检测引物对进行扩增与用市售产品Ion AmpliSeqTM Cancer Panel v1(LifeTechnologies公司)对相同目标片段进行扩增的平均测序深度对比。其中，黑色长条为用SEQ IDNO:1-30的15对检测引物进行扩增的平均测序深度(所用数据136例肺癌样品)，灰色长条为IonAmpliSeqTM Cancer Panel v1针对本发明所涉及的15个目标区域的平均测序深度(所用数据76例肺癌样品)。
图4是样品L738的多重PCR+高通量测序突变检测结果BRAF V600E突变和相应的Sanger测序检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向和反向信号峰图。
图5是样品L1649的多重PCR+高通量测序突变检测结果BRAF D594G突变和相应Sanger测序的检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向和反向信号峰图。
图6是样品L1649的多重PCR+高通量测序突变检测结果KRAS L19F突变和相应Sanger测序检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向和反向信号峰图。
图7是样品L1155的多重PCR+高通量测序突变检测结果EGFR L858R突变和相应Sanger测序检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向信号峰图。
图8是样品L1252的多重PCR+高通量测序突变检测结果EGFR L858R突变和相应Sanger测序检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向和反向信号峰图。
图9是样品L1517的多重PCR+高通量测序突变检测结果EGFR L858R突变和相应Sanger测序检测结果对比图，其中左图是多重PCR+高通量测序突变检测结果，右图是相应的Sanger检测结果的正向信号峰图。
图10A是样品L1602的多重PCR+高通量测序突变检测结果，结果显示具有12个碱基的插入突变ERBB2c.2310_2311ins12(插入序列：GCATACGTGATG)。
图10B是对样品L1602的插入突变ERBB2c.2310_2311ins12(插入序列：GCATACGTGATG)的Sanger测序检测结果。
图11是对样品K145利用多重PCR+高通量测序和FISH对HER2扩增突变的检测结果对比图，其中左图是对照样品与K145的K值比较，其中对照样品为正常样品，右图是FISH检测结果截图。
图12是对样品K146利用多重PCR+高通量测序和FISH对HER2扩增突变的检测结果对比图，其中左图是对照样品与K146的K值比较，其中对照样品为正常样品，右图是FISH检测结果截图。
图13是对样品K149利用多重PCR+高通量测序和FISH对HER2扩增突变的检测结果对比图，其中左图是对照样品与K149的K值比较，其中对照样品为正常样品，右图是FISH检测结果截图。
图14是对样品K150利用多重PCR+高通量测序和FISH对HER2扩增突变的检测结果对比图，其中左图是对照样品与K150的K值比较，其中对照样品为正常样品，右图是FISH检测结果截图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施例并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1：利用SEQ ID NO:1-30的检测引物对和SEQ ID NO:31-230的平衡引物对对基因组DNA进行扩增
所用样品为136例肺癌样品，应用SEQ ID NO:1-30的检测引物对和SEQ ID NO:31-230的平衡引物对对基因组DNA进行多重PCR扩增后，采用ion PGM测序仪进行测序，具体实施方法如下：
a)基因组DNA提取
按照标准FFEP(福尔马林固定、石蜡包埋)肿瘤组织基因组DNA提取方法，用E.Z.N.A.FFEP DNA试剂盒(Omega Bio-Tek)，根据生产商提供的使用说明，从FFEP处理的组织中提取基因组DNA。将提取的DNA进行凝胶电泳和OD值测量进行质量控制，并用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies)进行定量。要求DNA浓度大于50ng/μl，A260/A280在1.6-2.0之间。
b)扩增产物文库的建立
文库制备的第一步即为多重PCR，利用SEQ ID NO:1-30和SEQ ID NO:31-230所示的115对引物对对10ng基因组DNA进行多重PCR，扩增出KRAS、BRAF、EGFR、PIK3CA和HER2基因的外显子区域和100对平衡引物的目标扩增区域。再将得到的扩增产物进行末端修复、接头连接、标签连接(区分不同样品)、纯化、修复缺口和PCR扩增，从而得到所需要的DNA文库。具体过程如下所示：
多重PCR反应体系如表3所示：
表3多重PCR反应体系
反应条件如表4所示：
表4多重PCR反应条件
其中5X Ion AmpliSeq HiFi Master Mix(Life Technologies)为PCR混合反应容液，主要包含PCR反应所需的DNA连接酶、dNTP及反应缓冲液。多重PCR完成后，每个样品反应管中加入2μl的FuPa Reagent(Life Technologies)，该试剂可特异性地将扩增产物两端的引物进行部分切除，反应条件如表5所示：
表5切除反应条件
引物剪切完成后，需要给扩增产物加上标签接头(Barcode Adapter)，标签接头为特异的DNA短序列，不同的样品可接上不同的标签接头进行区分，反应体系如表6所示：
表6标签接头反应体系
反应温度如表7所示：
表7标签接头反应温度
样品加上标签序列后，需对扩增产物进行纯化，纯化过程采用常见的磁珠法，所用试剂为Agencourt AMPure XP(购自美国Beckman公司)，该试剂所含磁珠在不同浓度下可吸附不同长度的DNA序列，其实验过程大致为：1)首先将上述PCR产物(约30μl)加入已将好45μl AgencourtAMPure XP(体积为PCR产物的1.5倍)的离心管中，用移液枪反复吹吐混匀后室温静置5min，之后将离心管放在磁力架上，磁珠受磁力作用可沉淀在管壁上使溶液澄清，吸走上清液保留沉淀；2)加150ul新鲜配制的70％乙醇清洗沉淀，然后吸走乙醇，重复2次；3)清洗结束，短暂离心后放回磁力架上，吸掉残余的液体，室温干燥5min。干燥结束后撤离磁力架，加50μl的PlatinumPCR SuperMix High Fidelity(Life Technologies)和2μl的Library Amplification Primer(Life Technologies)，上下吹吐10次混匀；4)将离心管重置在磁力架上2min，等溶液澄清后转移上清到一个新的PCR小管里。
纯化完成，再将纯化后的产物进行PCR扩增，该扩增只是将目标产物量进行翻倍，反应温度如表8所示：
表8翻倍PCR扩增反应条件
PCR完成后，需将扩增产物进行再次纯化，主要是去除多余的试剂如缓冲物、酶、dATP等，该纯化步骤和第一次纯化大致相同，但第一步有所差别，过程如下：1)将上述PCR产物(约50μl)加入已加好25μl Agencourt AMPure XP(体积为PCR产物的0.5倍)的离心管中，用移液枪反复吹吐混匀后室温静置5min，之后将离心管放在磁力架上，磁珠受磁力作用可沉淀在管壁上使溶液澄清，将上清液吸至新的离心管中保留，弃除沉淀；2)往保留下来的上清液中加入60μl(体积为上清液的1.2倍)的Agencourt AMPure XP，反复吹吐混匀后室温静置5min，然后将离心管放在磁力架上，待澄清后弃掉上清；3)加150μl新鲜配制的70％乙醇清洗沉淀，然后吸走乙醇，重复2次；3)清洗结束，短暂离心后放回磁力架上，吸掉残余的液体，室温干燥5min。干燥结束后撤离磁力架，加30μl的low TE液，反复吹吐混匀；4)将离心管重置在磁力架上2min，等溶液澄清后转移上清到一个新的PCR小管里，该上清溶液即为最终的DNA文库；
文库制备完成后，需采用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies)或分光光度计进行定量。要求DNA浓度大于5ng/μl。
c)通过乳液PCR制备模板
DNA文库建好以后，需在Ion One TouchTM系统上进行模版制备，Ion OneTouch系统(LifeTechnologies)包含两个模块：Ion OneTouch仪器和Ion OneTouchTMES-富集系统，配套试剂为Ion PGM Template OT2200Kit的试剂盒。
制备过程的具体实验步骤遵循试剂盒说明书，先将已添加不同标签的样品用无核酸酶水进行稀释，确保最终浓度为1.8ng/ml，并把多个样品混合在一起(根据最后上样的芯片的通量情况，大概8至10个样品混合成一管)，在Ion OneTouch仪器(Life Technologies)上，自动运行乳液PCR、乳液打破、富集珠子等过程。将富集好的珠子用Qubit 2.0荧光计进行定量，需要满足10％-30％的浓度。然后，用Ion OneTouchTMES-富集系统(Life Technologies)对珠子上的模板的双链变成单链，然后进一步富集珠子，由此富集好的珠子浓度能够达到50％以上。
d)PGM(Life Technologies)上机测序
实验的最后一步是将制备好的模版上机测序，实验中采用的测序仪为Ion PGM测序仪(LifeTechnologies)，配套的试剂为Ion PGMTM Sequencing 200Kit v2试剂盒。
上机过程遵循试剂盒说明书所述的实验步骤，将Ion PGM测序仪(Life Technologies)进行初始化，将Ion OneTouchTMES-富集系统富集的Ion Sphere样品颗粒按Ion PGM Sequencing 200Kitv2上机试剂盒(Life Technologies)说明书进行操作，准备Ion 316芯片(Life Technologies)吸取15μL样品进行上机测序，反应运行时间约为2-3小时，完成测序过程，获得测序原始序列。
对测序原始序列中目标片段的平均测序深度(coverage)进行统计。SEQ ID NO:1-30的15对检测引物扩增目标序列的平均测序深度如图1所示。SEQ ID NO:1-30的15对检测引物和SEQ IDNO:31-230的100对平衡引物扩增目标序列的平均测序深度如图2所示。在图1和图2中，横坐标为各个引物对的编号，纵坐标为相应引物对的均一化后的测序深度(coverage)值，均一化的目的是消除每次样品检测所带来的误差，通过计算单个样品数据中各个扩增子(amplicon)的测序深度(coverage)值在总测序深度(coverage)值中的比例，再乘以均一化值，获得平均测序深度。图1和图2为136例样品数据的平均测序深度(coverage)值，其均一化值均为315000。图2中平均测序深度(coverage)值(覆盖度)为2695x，平均读长119bp。
由图1可以看出，SEQ ID NO:1-30的15对检测引物对成功扩增相应的目标片段，各个片段的扩增效率差异不大。由图2可以看出，SEQ ID NO:1-30的15对检测引物对和SEQ ID NO:31-230的100对平衡引物对成功扩增相应的目标片段，大部分片段的扩增效率差异不大。
此外，将上述15对检测引物对进行扩增的测序深度与用市售产品Ion AmpliSeqTM CancerPanel v1(Life Technologies公司)对相同目标片段进行扩增的测序深度的对比如图3所示。Ion AmpliSeqTMCancer Panel v1是由Life Technologies公司2012年推出的肿瘤基因突变检测组合，该项目共有189对引物对，可同时扩增189个扩增子(amplicon)，以同时检测与肿瘤相关的45个基因多达739个热点突变。
图3中，黑色长条为用SEQ ID NO:1-30的15对检测引物进行扩增的平均测序深度(所用数据为136例肺癌样品)，灰色长条为Ion AmpliSeqTMCancer Panel v1针对本发明所涉及的15个目标区域的平均测序深度(所用数据为76例肺癌样品)，由图3结果可见，本发明的15对检测引物对对本发明所涉及的15个目标区域的扩增具有更高的效率和覆盖度。
实施例2：应用多重PCR+高通量测序技术对多种肿瘤样品的DNA突变检测及Sanger验证
1、多重PCR+高通量测序检测碱基突变
取肺癌2例、结直肠癌1例、食管癌1例、胃癌1例、卵巢癌1例共6例石蜡样品，应用SEQID NO:1-30进行多重PCR扩增后，采用Ion PGM测序仪进行测序，多重PCR和高通量测序的具体步骤同实施例1。
将测序结果与参考序列进行比对，得到突变检测结果，如表9所示。
表96例样品的多重PCR+高通量测序碱基突变检测结果
2、对检测结果进行Sanger验证
分别针对上述各个样品所检测位点设计引物，后分别进行PCR扩增，对PCR产物跑电泳后切胶纯化，然后利用一代Sanger测序仪对目标序列进行验证测序。Sanger测序技术又称一代测序技术，是本领域公认的测序金标准，本实施例中使用的Sanger测序方法及流程采用的是本领域的通用标准及流程。
a)样品L738
验证结果如图4所示，左边为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在A->T的突变，根据峰面积估计频率在10-20％之间，验证成功。
b)样品L1649
验证结果如图5、图6所示，左边为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图，从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析后表明图5和图6的箭头位置分别存在T->C及C->A的突变，根据峰面积估计频率均在20％左右，验证成功；
c)样品L1155
验证结果如图7所示，左边为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，右边为Sanger验证信号峰图，从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析后表明箭头位置分别存在A->C突变，根据峰面积估计频率约在20％左右，验证成功；
d)样品L1252
验证结果如图8所示，左边为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在T->G的突变，根据峰面积估计频率在10-20％之间，验证成功。
e)样品L1517
验证结果如图9所示，左边为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，右边为Sanger验证信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在T->G的突变，根据峰面积估计频率在5-10％之间，验证成功。
f)样品L1602
验证结果如图10A和图10B所示，图10A为多重PCR+高通量测序获得的检测结果图，图10B为Sanger验证的正向和反向信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在12个碱基GCATACGTGATG的插入突变，根据峰面积估计频率在40％左右，验证成功。
实施例3：应用多重PCR+高通量测序技术检测肿瘤样品HER2扩增突变及FISH验证
1、多重PCR+高通量测序检测HER2扩增突变
当样品的HER2基因发生扩增时，其目标产物的扩增拷贝数也会相应增高，通过计算均一化后样品HER2基因目标序列拷贝数与对照样品中相应拷贝数的比值可确定样品中HER2基因是否存在扩增现象。
取7例食管癌和21例乳腺癌石蜡样品，应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ IDNO:31-230进行多重PCR扩增后，采用Ion PGM测序仪进行测序，检测HER2基因扩增突变，其中多重PCR和高通量测序的具体步骤同实施例1，从测序结果中获得正常样品检测中所有扩增序列的总拷贝数Cn，被检测样品的所有扩增序列的总拷贝数C，被检测样品结果中HER2基因目标序列的拷贝数S，正常样品结果中HER2基因目标序列的拷贝数An，并按照下式计算扩增比例K值：
K＝(Cn/C)*(S/An)    (式1)
同时用FISH(荧光原位杂交技术)对上述样品的HER2扩增突变进行检测，结果如表10所示，其中样品编号后标记为e的是食管癌样品，样品编号后标记为b的是乳腺癌样品。
表10肿瘤样品HER2扩增检测K值及其FISH验证结果
样品编号 FISH检测结果 K值
1e - 0.2
2b - 0.4
3b - 0.5
4e - 0.5
5b - 0.6
6e - 0.6
7b* / 0.7
8e* / 0.8
9e - 1.1
10b + 1.3
11b + 1.4
12b + 1.4
13b + 1.4
14b + 1.6
15b + 1.8
16e + 1.8
17b + 2
18b + 2
19b + 2
20b + 2.3
21b + 2.4
22b + 2.5
23b + 2.8
24b + 2.8
25b + 3.2
26b + 3.6
27b + 3.9
28e + 3.9
*因背景染色问题而无法判断结果。
根据表10数据，判定K值的阈值为1.3，即当K值大于或等于1.3时，则认为HER2基因存在扩增现象。
另取4例食管癌石蜡样品，应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ ID NO:31-230进行多重PCR扩增后，采用Ion PGM测序仪进行测序，检测HER2基因扩增突变，其中基因组DNA提取、扩增产物文库的建立、通过乳液PCR制备模板、PGM上机测序步骤同实施例2，从测序结果中获得正常样品检测中所有扩增序列的总拷贝数Cn，被检测样品的所有扩增序列的总拷贝数C，被检测样品结果中HER2基因目标序列的拷贝数S，正常样品结果中HER2基因目标序列的拷贝数An，并按照下式计算扩增比例K值：
K＝(Cn/C)*(S/An)    (式1)
检测结果如表11所示。
表114例样品的多重PCR+高通量测序扩增突变检测结果
样品编号 性别 年龄 检测结果 结果对应的附图
K145 男 49 阳性 图11
K146 男 72 阳性 图12
K149 女 61 阴性 图13
K150 男 67 阴性 图14
2、FISH验证
利用FISH(荧光原位杂交技术)对上述样品的扩增突变检测结果进行验证检测，探针采用GLPHER-2/CEN 17探针，FISH是本领域用于检测肿瘤HER2基因扩增的经典方法，本实施例中使用FISH检测方法及流程采用的是通用标准及流程。
a)样品K145
验证结果如图11所示，左边为应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ IDNO:31-230进行多重PCR+高通量测序获得的HER2扩增突变检测结果图，右边为FISH检测结果截图，从FISH结果中可见，样品中HER2基因呈簇状扩增，验证一致；
b)样品K146
验证结果如图12所示，左边为应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ IDNO:31-230进行多重PCR+高通量测序获得的HER2扩增突变检测结果图，右边为FISH检测结果截图，从FISH结果中可见，样品中HER2基因呈簇状扩增，验证一致；
c)样品K149
验证结果如图13所示，左边为应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ IDNO:31-230进行多重PCR+高通量测序获得的HER2扩增突变检测结果图，右边为FISH检测结果截图，从FISH结果中可见，Her-2/CEN17比值小于1.8，样品中HER2基因并无扩增现象，验证一致；
d)样品K150
验证结果如图14所示，左边为应用检测引物对SEQ ID NO:1-30和平衡引物对SEQ IDNO:31-230进行多重PCR+高通量测序获得的HER2扩增突变检测结果图，右边为FISH检测结果截图，从FISH结果中可见，Her-2/CEN17比值小于1.8，样品中HER2基因并无扩增现象，验证一致。
实施例3：应用多重PCR+高通量测序技术检测低频突变
多重PCR+二代高通量测序方法检测DNA突变过程中，存在多次PCR扩增步骤，可将突变信号放大数百至数千倍，因此可有效地检测低频突变，相比一代Sanger测序更高的灵敏度。
为了验证这一点，本发明人选取了13例突变阳性肿瘤样品(其中12例为KRAS G12D阳性，1例为KRSAS G12C阳性)，包括11例结直肠癌样品、1例肺癌样品和1例脑胶质瘤样品，并分别应用三种检测方法对这些样品进行检测，其中一种为本发明方法即多重PCR+Ion PGM测序方法，第二种为一代Sanger测序法，第三种为ARMS法。其中ARMS法可针对特定的突变设计探针，其灵敏度可达到1％。本实施例中采用的Sanger一代测序法与ARMS法为本领域通用的技术，多重PCR和Ion PGM高通量测序的具体步骤同实施例1。为保证准确性，部分样品ARMS法重复检测了三次。
实验结果如表12所示。
表12用三种检测方法检测低频突变
由表12的结果可知：
(1)应用Ion PGM进行高通量测序对低频率突变的检测具有较好的准确性；
(2)ARMS检测重复3次后，检测突变频率与Ion PGM检测的频率相差较小，大都在1％-5％之间，而如果不重复，其检测突变频率与Ion PGM检测的频率可能有一定偏差；
(3)Sanger测序检测低频突变，尤其是对由Ion torrent检测为低于15％的突变频率进行检测时，其突变峰与杂峰可能出现无法区分的情况，造成漏检。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (10)

1.用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因的一个或多个外显子的突变的引物组，包含用于在一个多重PCR中同时扩增选自BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因的一个或多个基因的一个或多个外显子的多个区域的检测引物对，其包含选自下列引物对中的至少3对、至少4对、至少5对、至少6对、至少7对、至少8对、至少9对、至少10对、至少11对、至少12对、至少13对、至少14对、或全部15对引物：
用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:1和2所示；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:3和4所示；
用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:9和10所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:11和12所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:13和14所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:15和16所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:17和18所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:19和20所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:21和22所示；
用于扩增HER2基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:23和24所示；
用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:25和26所示；
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:27和28所示；和/或
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:29和30所示。
2.权利要求1的引物组，其中所述多重PCR的反应条件为99℃预热2min，每个循环99℃变性15s，60℃退火4min，共23个循环，最后储存于10℃备用。
3.权利要求1或2的引物组，其进一步包含用于检测HER2基因扩增突变的平衡引物对，所述平衡引物对包括选自下列引物对中的多对引物：
如SEQ ID NO:31和32所示的引物对；
如SEQ ID NO:33和34所示的引物对；
如SEQ ID NO:35和36所示的引物对；
如SEQ ID NO:37和38所示的引物对；
如SEQ ID NO:39和40所示的引物对；
如SEQ ID NO:41和42所示的引物对；
如SEQ ID NO:43和44所示的引物对；
如SEQ ID NO:45和46所示的引物对；
如SEQ ID NO:47和48所示的引物对；
如SEQ ID NO:49和50所示的引物对；
如SEQ ID NO:51和52所示的引物对；
如SEQ ID NO:53和54所示的引物对；
如SEQ ID NO:55和56所示的引物对；
如SEQ ID NO:57和58所示的引物对；
如SEQ ID NO:59和60所示的引物对；
如SEQ ID NO:61和62所示的引物对；
如SEQ ID NO:63和64所示的引物对；
如SEQ ID NO:65和66所示的引物对；
如SEQ ID NO:67和68所示的引物对；
如SEQ ID NO:69和70所示的引物对；
如SEQ ID NO:71和72所示的引物对；
如SEQ ID NO:73和74所示的引物对；
如SEQ ID NO:75和76所示的引物对；
如SEQ ID NO:77和78所示的引物对；
如SEQ ID NO:79和80所示的引物对；
如SEQ ID NO:81和82所示的引物对；
如SEQ ID NO:83和84所示的引物对；
如SEQ ID NO:85和86所示的引物对；
如SEQ ID NO:87和88所示的引物对；
如SEQ ID NO:89和90所示的引物对；
如SEQ ID NO:91和92所示的引物对；
如SEQ ID NO:93和94所示的引物对；
如SEQ ID NO:95和96所示的引物对；
如SEQ ID NO:97和98所示的引物对；
如SEQ ID NO:99和100所示的引物对；
如SEQ ID NO:101和102所示的引物对；
如SEQ ID NO:103和104所示的引物对；
如SEQ ID NO:105和106所示的引物对；
如SEQ ID NO:107和108所示的引物对；
如SEQ ID NO:109和110所示的引物对；
如SEQ ID NO:111和112所示的引物对；
如SEQ ID NO:113和114所示的引物对；
如SEQ ID NO:115和116所示的引物对；
如SEQ ID NO:117和118所示的引物对；
如SEQ ID NO:119和120所示的引物对；
如SEQ ID NO:121和122所示的引物对；
如SEQ ID NO:123和124所示的引物对；
如SEQ ID NO:125和126所示的引物对；
如SEQ ID NO:127和128所示的引物对；
如SEQ ID NO:129和130所示的引物对；
如SEQ ID NO:131和132所示的引物对；
如SEQ ID NO:133和134所示的引物对；
如SEQ ID NO:135和136所示的引物对；
如SEQ ID NO:137和138所示的引物对；
如SEQ ID NO:139和140所示的引物对；
如SEQ ID NO:141和142所示的引物对；
如SEQ ID NO:143和144所示的引物对；
如SEQ ID NO:145和146所示的引物对；
如SEQ ID NO:147和148所示的引物对；
如SEQ ID NO:149和150所示的引物对；
如SEQ ID NO:151和152所示的引物对；
如SEQ ID NO:153和154所示的引物对；
如SEQ ID NO:155和156所示的引物对；
如SEQ ID NO:157和158所示的引物对；
如SEQ ID NO:159和160所示的引物对；
如SEQ ID NO:161和162所示的引物对；
如SEQ ID NO:163和164所示的引物对；
如SEQ ID NO:165和166所示的引物对；
如SEQ ID NO:167和168所示的引物对；
如SEQ ID NO:169和170所示的引物对；
如SEQ ID NO:171和172所示的引物对；
如SEQ ID NO:173和174所示的引物对；
如SEQ ID NO:175和176所示的引物对；
如SEQ ID NO:177和178所示的引物对；
如SEQ ID NO:179和180所示的引物对；
如SEQ ID NO:181和182所示的引物对；
如SEQ ID NO:183和184所示的引物对；
如SEQ ID NO:185和186所示的引物对；
如SEQ ID NO:187和188所示的引物对；
如SEQ ID NO:189和190所示的引物对；
如SEQ ID NO:191和192所示的引物对；
如SEQ ID NO:193和194所示的引物对；
如SEQ ID NO:195和196所示的引物对；
如SEQ ID NO:197和198所示的引物对；
如SEQ ID NO:199和200所示的引物对；
如SEQ ID NO:201和202所示的引物对；
如SEQ ID NO:203和204所示的引物对；
如SEQ ID NO:205和206所示的引物对；
如SEQ ID NO:207和208所示的引物对；
如SEQ ID NO:209和210所示的引物对；
如SEQ ID NO:211和212所示的引物对；
如SEQ ID NO:213和214所示的引物对；
如SEQ ID NO:215和216所示的引物对；
如SEQ ID NO:217和218所示的引物对；
如SEQ ID NO:219和220所示的引物对；
如SEQ ID NO:221和222所示的引物对；
如SEQ ID NO:223和224所示的引物对；
如SEQ ID NO:225和226所示的引物对；
如SEQ ID NO:227和228所示的引物对；
如SEQ ID NO:229和230所示的引物对。
4.权利要求1或2的引物组，由下列(i)-(iii)任一组的检测引物对组成：
(i)用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示；和
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:13和14所示；
(ii)用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:3和4所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:9和10所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:11和12所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:15和16所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:17和18所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:19和20所示；和
用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:21和22所示；
(iii)用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:7和8所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:13和14所示；和
用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:25和26所示。
5.权利要求3的引物组，由下列(i)的检测引物对和(ii)的平衡引物对组成：
(i)用于扩增HER2基因的外显子19的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:23和24所示；
用于扩增HER2基因的外显子20的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:25和26所示；
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:27和28所示；和
用于扩增HER2基因的外显子21的区域的引物对，其序列如SEQ ID NO:29和30所示；
(ii)SEQ ID NO:31-230所示的引物对。
6.用于检测样品中一个或多个癌症驱动基因突变的试剂盒，包含权利要求1-5任一项的引物组。
7.权利要求6的试剂盒，其还包含以下的一种或多种试剂：
用于从所述样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物对进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂；以及
用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。
其中，优选所述高通量测序是Ion Torrent测序。
8.体外同时扩增样品中一个或多个癌症驱动基因的一个或多个外显子的多个区域的方法，包括以下步骤：
(1)获得样品的基因组DNA；
(2)利用权利要求1-5任一项的引物组或权利要求6-7任一项的试剂盒对所述基因组DNA进行多重PCR扩增。
9.体外非诊断目的检测样品中一个或多个癌症驱动基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)获得样品的基因组DNA；
(2)利用权利要求1-5任一项的引物组或权利要求6-7任一项的试剂盒对所述基因组DNA进行多重PCR扩增；
(3)对扩增产物进行高通量测序，优选Ion Torrent测序；以及
(4)分析测序结果，确定BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA和/或HER2基因中是否发生突变。
10.权利要求8或9的方法，其中所述多重PCR的反应条件为99℃预热2min，每个循环99℃变性15s，60℃退火4min，共23个循环，最后储存于10℃备用。
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