CN107475425A - 用于快速筛查her2基因外显子20突变的特异性引物及应用 - Google Patents

用于快速筛查her2基因外显子20突变的特异性引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物及其应用方法，包括以下步骤：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)设计合成用于扩增HER2基因外显子20的特异性引物共1对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR；(4)曲线分析中得到阳性结果的样本，即发生HER2基因突变。本发明的检测方法不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。

Description

用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域。尤其是涉及一种用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物及其应用。
背景技术
肿瘤是全世界范围内发病率和死亡率最高的疾病，寻找有效地早期诊断及治疗方法已成为当前医学研究领域中的重大课题。肿瘤的发病的过程常常涉及各种基因突变，肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞存在显著差异，在肿瘤细胞发生发展的过程中存在被稳定复制的一些重要的驱动基因突变，可作为生物标志物，对肿瘤的预防、诊断、治疗以及预后判断提供重要的信息。
乳腺癌目前是中国女性发病率第1位的恶性肿瘤,严重威胁着患者的健康。HER-2阳性乳腺癌约占侵袭性乳腺癌的20％～30％,与肿瘤的高侵袭性、高复发风险、进展快速及不良预后相关。大量针对HER-2靶点药物的研发及临床应用,改变了这部分患者的预后,但抗HER-2靶向药物的耐药极大限制了该类药物的应用。随着精准医学测序技术的发展,越来越多的HER-2基因突变被报道,HER-2基因的突变现象可能会对疾病的发生、发展及治疗产生影响,可能是抗HER-2药物耐药的一个重要原因。当HER2基因发生突变时，会导致HER2信号通路异常活化，刺激细胞持续生长或分化，最终导致肿瘤发生。HER2突变主要位于HER2基因第19、20号外显子上。在非小细胞肺癌患者中HER2突变率为2～4％。因此，HER2基因的突变与肿瘤发生、药物治疗及耐药等密切相关。
HRM(高分辨率熔解曲线分析)是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。美中不足的是在进行未知突变筛查、扫描时，只能检测到有无突变，无法确定突变在DNA片段中位置。触底PCR(Touch down(TD)PCR)是一种特殊技术，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。
发明内容
本发明的技术目的首先是提供一种用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物，其结合高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法，可以快速筛查HER2基因外显子是否发生突变，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点，尤其适用于大量人群的快速筛查需求，如健康人群的体检需求。其可以指示HER2基因外显子是否已经突变病变，再通过基因测序法进一步确定突变的具体位置及序列，准确率高，具有极高的实用性价值。
所述用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物的核苷酸序列分别是：
HER2外显子20正向引物 GACTTCACCCCGCCTCAC 如SEQ ID No.1所示
HER2外显子20反向引物 CCCAGCCCTCTGACGTCCAT 如SEQ ID No.2所示
进一步地，本发明提供一种快速筛查HER2基因外显子20突变的体外检测方法，其不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。
所述检测方法是采用上述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。优选的步骤包括：
(1)提取外周血样品基因组DNA；
(2)合成用于扩增HER2基因外显子的特异性引物共1对；
(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；
(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生HER2基因突变。例如附图1中箭头所示，相对于阴性对照出现一个单独的峰，为阳性结果，可以表明存在HER2基因突变。
所述特异性引物，是针对HER2基因外显子特别设计的引物，经过反复试验筛选和验证，最终筛选得到，具有特异性强、扩增效率高等优点。
所述步骤(3)中PCR的反应体系优选的是：总体积为15μL的反应体系包含：mastermix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNasefree H2O。
反应时，向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA 5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应，其中阴性对照是HER2野生型序列，空白对照是无DNA模板。
本发明的检测方法，还有一个明显的技术特征是，所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，对于待检者来说，具有可长途运输、保存时间长、采血简单等优点，是基因检测技术中一项重大的改进。同时步骤(1)中样品基因组DNA的提取可采用商品化试剂盒提取。操作简单易行，也方便高通量检测时使用。
本发明的检测方法可用于快速筛查HER2基因外显子突变。利用HRM联合触底PCR的方法，能够实现在同一实验条件下，快速检测HER2基因20号外显子的多种常见突变，检测样本为健康者或肿瘤患者外周血0.5mL，为HER2基因突变的快速检测提供了一种新的检测方法，可用于分析患者所患肿瘤是否与遗传相关，提示家属是否有肿瘤遗传风险。
实验显示，通过对81例结直肠癌、69例肺癌、79例肝癌、100例乳腺癌以及45例食管癌患者血液中HER2基因20号外显子进行检测，能够成功检测到37例结直肠癌患者、28例肺癌受检者、16例肝癌患者、32例乳腺癌患者、11例食管癌患者血液DNA中HER2基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这124例样本确实存在DNA序列上的改变。证明了本发明方法的准确性。
本发明的检测方法可以应用在任意一种快速筛查HER2基因突变检测试剂盒中。优选包含用于扩增HER2基因外显子的特异性引物共1对，其核苷酸序列分别如上表所示。
检测试剂盒还含有PCR试剂、阴性对照、空白对照，其中阴性对照是HER2野生型序列，空白对照是无DNA模板。
本发明的试剂盒具有如下优点：(1)全部引物能在同一温度下进行稳定的PCR反应，获取特异性的HER2基因片段；(2)检测灵敏度高，特异性强；(3)小反应体系(15μL)，标本和试剂用量少；(4)采用检测样本为外周血干血片，采集容易，保存时间长，运输容易；(5)反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理；(6)试剂价格低廉，成本低。
附图说明
图1为实施例1中阳性样本的HRM溶解曲线图；
图2为实施例1中阴性样本的HRM溶解曲线图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种快速筛查HER2基因外显子20突变的体外检测方法，包括以下步骤：
(1)干血片DNA的提取
总DNA提取按照磁珠法干血斑基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书进行，如下：
1、取一块新的96孔深孔板，然后在每孔加入三片3*3mm的干血斑样品。在96深孔板中加入200μL的缓冲液GA。
2、加入20μL蛋白酶K溶液，涡旋震荡10秒混匀后，放入预热至56度的恒温振荡器中，900rpm恒温震荡裂解30分钟。
3、在上一步样品裂解期间，向新的96孔深孔板中加入10μL磁珠悬浮液G，200μL缓冲液GB和200μL无水乙醇，抽打混匀或震荡混匀10秒。
4、样品裂解后，将步骤3中深孔板短暂离心，冰箱裂解液完全移至步骤4中的深孔板，然后将其放入恒温振荡器，室温900rpm震荡3分钟。
5、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
6、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
7、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL缓冲液GD，抽打混匀或震荡混匀。
8、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。
9、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀3分钟。
10、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，带磁珠完全吸附时小心去除液体，使磁珠继续被吸附。
11、缓慢加入750μL漂洗液PWIII，尽量不要冲起磁珠，静置20秒后用移液器小心去除液体，取下深孔板。
12、加入50-100μL洗脱缓冲液TB或去离子水，抽打混匀或振荡混匀，置于56度，孵育5-10分钟。
13、将深孔板放置于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。
(2)高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR
高分辨率熔解曲线分析的HER2基因外显子20的特异性引物共计1对，序列如下表所示：
HER2外显子20正向引物 GACTTCACCCCGCCTCAC 如SEQ ID No.1所示
HER2外显子20反向引物 CCCAGCCCTCTGACGTCCAT 如SEQ ID No.2所示
配制总体积为15μL的PCR反应体系；
体系包含：master mix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；引物F 1μL；引物R 1μL，其余为RNase free H2O。
将配好的反应体系加入96孔板内，之后按照加样顺序，取5μL样品、阴性对照、空白对照依次加入相应孔内，在96孔板上封膜，振荡混匀，之后短暂离心。
高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR反应条件：95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用LightCycler 480所配分析软件对采集后的曲线进行分析。如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生HER2基因突变，如图1所示。另图2是检测样本中的阴性样本的HRM溶解曲线图，相对于阴性对照，阴性样本的检测曲线未出现明显的差异。
(3)直接测序法进行验证(此为可选步骤)
用高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR的方法得到阳性结果的样本，即发生HER2基因突变。将发生突变的样本剩余的DNA进行基因测序，验证其有无假阳性。
实施例2：临床样本检测
采用实施例1的方法对多例体检人群血液中HER2基因外显子进行检测，首次证实利用HRM法联合触底PCR的方法，能够实现在同一实验条件下，对干血片中提取得到的体检人群的DNA中HER2基因多个外显子的突变进行检测。通过对81例结直肠癌、69例肺癌、79例肝癌、100例乳腺癌以及45例食管癌患者血液中HER2基因20外显子进行检测，能够成功检测到37例结直肠癌患者、28例肺癌受检者、16例肝癌患者、32例乳腺癌患者、11例食管癌患者血液DNA中HER2基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这124例样本确实存在DNA序列上的改变。
81例结直肠癌患者血液样本，其中有37例(第3、11、18、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、45、47、48、52、63、64、65、66、68、69、71、82、85、87、97、98、100号)出现突变，第3、11、18、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、45、47、48、52、63、64、65、66、68、69、71、82、85、87、97、98、100号样本HER2基因外显子20疑似出现核酸序列变化(如图1所示，异常结果图)。经一代测序检测，结果显示第33号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现G/C变异；第11、18、25、28、31、32、36、37、39、45、63、68、82、85、87号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现T/C变异；第3、26、27、29、30、34、35、40、41、42、47、48、52、64、65、66、69、71、97、98、100号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现A/G变异。
69例肺癌患者血液样本，其中有28例(第5、7、8、17、21、24、26、29、30、31、33、37、41、42、43、44、45、46、48、50、54、56、57、58、60、61、68、69号)出现突变，第5、7、8、17、21、24、26、29、30、31、33、37、41、42、43、44、45、46、48、50、54、56、57、58、60、61、68、69号样本HER2基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第21、24、26、29、30、31、33号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现G/C变异；第7、8、17、43、45、46、48、58、68、69号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现T/C变异；第5、37、41、42、44、50、54、56、57、60、61号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现A/G变异。
79例肝癌患者血液样本，其中有16例(第2、4、5、10、13、14、20、26、27、28、64、66、67、72、78、79号)出现突变，第2、4、5、10、13、14、20、26、27、28、64、66、67、72、78、79号样本HER2基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第13、28号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现G/C变异；第26号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现T/C变异；第4、20、27、64、66、67、72号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现A/G变异；第2、5、10、14、78、79号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现T/C变异。
100例乳腺癌患者血液样本，其中有32例(第2、3、15、18、21、22、25、26、27、35、38、39、40、41、43、46、48、49、52、56、62、74、75、76、77、78、79、80、81、82、86、87号)出现突变，第2、3、15、18、21、22、25、26、27、35、38、39、40、41、43、46、48、49、52、56、62、74、75、76、77、78、79、80、81、82、86、87号样本HER2基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第39、40、43号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现G/C变异；第2、15、18、21、25、41、74、76、77、78、79、80、81、82、86、87号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现T/C变异；第3、22、26、27、35、38、46、48、49、52、56、62、75号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现A/G变异。
45例食管癌患者血液样本，其中有11例(第4、7、9、14、24、27、29、32、33、38、40号)出现突变，第4、7、9、14、24、27、29、32、33、38、40号样本HER2基因外显子20疑似出现核酸序列变化。经一代测序检测，结果显示第4、9、14、24、29、32、33、38号样本HER2基因外显子20的第51位核酸出现T/C变异；第7、27、40号样本HER2基因外显子20的第52位核酸出现A/G变异。
结果表明，本发明提供的特异性引物和检测方法可快速检测HER2基因外显子的多种突变，适用于健康人群体检筛查需求。具有检测灵敏度高，特异性强，反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理等特点，筛查出的阳性结果再经过基因测序法确定，可以大为减少早期肿瘤筛查的困难度和检测成本。同时还具有以下优点：
1、可用干血片收集样本：目前现有的HRM相关技术所用的样本主要包括石蜡包埋肿瘤组织或血清，而本发明技术检测的DNA样本来源于干血片。干血片仅需采集外周血0.5mL，外周血取血量少，且干血片易于保存和远距离邮寄，故适用范围更广。目前，对于微量DNA的提取已有成熟的商品化试剂盒可以完成，保证提取DNA的质量。当然，除了干血片，本发明技术也同样可用于其他所有能提取DNA的样本，如肿瘤组织、血清等。故本发明技术的应用范围更广泛且易于推广。
2、筛查用途：目前现有的检测试剂盒、检测方法等检测的样本均为肿瘤患者术后的肿瘤组织，或已明确肿瘤诊断的肿瘤患者血清，而本发明技术通过干血片获得受检者的DNA，样本的采集并不局限于已明确诊断的肿瘤患者，还可用于常规体检筛查。对于携带具有遗传倾向的基因突变，可以进行有效的筛查，从而达到预防肿瘤的目的。因此，本发明提供的HRM方法可快速检测HER2基因20号外显子的多种突变，不仅适用于临床肿瘤患者标本检测，还可用于常规体检者的早期筛查。
3、引物特异性：全部引物能在同一温度下进行稳定的PCR反应，获取特异性扩增片段；检测灵敏度高，特异性强；小反应体系，共计15μL，标本和试剂都用量少；采用检测样本为DNA，来源丰富，可支持组织、胸水、血清，特别是干血片等多种来源的标本；反应简便迅速，便于大样本量检测；试剂价格低廉，高通量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京青航基因科技有限公司
<120> 用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物及应用
<130> P1710164
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacttcaccc cgcctcac 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccagccctc tgacgtccat 20
12

Claims (10)

1.用于快速筛查HER2基因外显子20突变的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列是：
HER2外显子20正向引物：如SEQ ID No.1所示；
HER2外显子20反向引物：如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的特异性引物用于高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR方法快速筛查HER2基因外显子20突变。
3.一种快速筛查HER2基因外显子20突变的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的特异性引物，进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取外周血样品基因组DNA；
(2)合成权利要求1所述的特异性引物共1对；
(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；
(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生HER2基因突变。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中PCR的反应体系是：
总体积为15μL的反应体系包含：master mix 10μL；MgCl2 2.4μL；GC enhancer 0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNase free H2O。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中向所述反应体系中依次加入样品基因组DNA 5μL、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中样品基因组DNA的提取采用试剂盒提取。
9.权利要求1所述的特异性引物或权利要求4所述的检测方法在快速筛查HER2基因突变检测试剂盒中的应用。
10.一种快速筛查HER2基因外显子20突变的检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的特异性引物，以及PCR试剂、阴性对照、空白对照。
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