CN102373197A - 用于定量检测her2扩增的试剂盒 - Google Patents

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陈钊
莫敏俐
李隽�
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Abstract

本发明涉及用于定量检测HER2扩增的试剂盒。具体地说，本发明涉及与分子靶向抗癌药物疗效相关的HER2基因扩增检测方法及检测试剂盒。尤其涉及荧光定量PCR检测方法、试剂盒及其应用。本发明对HER2基因扩增进行检测，并可对分子靶向抗肿瘤药曲妥珠单抗进行疗效预测，进而对肿瘤患者的临床个体化用药方案提供指导。

Description

用于定量检测HER2扩增的试剂盒
技术领域
本发明涉及用于诊断癌症的试剂盒。具体地说，本发明涉及通过定量检测HER2扩增来诊断癌症的试剂盒。
发明背景
我国每年新发乳腺癌约18万例。在近三成乳腺癌患者中，其肿瘤细胞表面的HER2蛋白含量增多，这种情况被称为“HER2阳性”。HER2又被称作人表皮生长因子受体2，在调控细胞的生长、发育和分化中发挥重要作用。一旦过度表达(即HER2阳性)，HER2便会刺激癌细胞疯狂增长，使其侵袭性增加。因此，HER2阳性乳腺癌的进展速度比其它类型乳腺癌更快，恶性程度更高，复发和转移更快[BursteinHJ，N Engl J Med，2005，353(16)：1652-1654]。研究结果表明，如果只接受常规综合治疗，HER2阳性乳腺癌患者的生存时间仅为HER2阴性患者的一半。
HER2阳性乳腺癌患者可从曲妥珠单抗(Herceptin)单药方案或与部分化疗药物联合方案中获益[Piccart-GebHERt MJ，Procter M，et al.NEngl J Med，2005，353(16)：1659-1672；Romond EH，Perez EA，et al.NEngl J Med，2005，353(16)：1673-1684]。单克隆抗体Herceptin与HER2受体细胞外区域结合，具有高度亲和力和特异性，既能阻断HER2受体而产生抗肿瘤效应，又能与人体免疫细胞作用，产生抗体依赖性细胞毒(ADCC)效应和补体介导细胞毒(CDC)效应。Herceptin单药对于HER2阳性的转移性乳腺癌的治疗总有效率为23％，对其中HER2(+++)患者的有效率达31％。目前临床上Herceptin主要用于治疗HER2基因扩增或过度表达且伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者[Pegram MD，KonecnyGE，et al.J Natl Cancer Inst，2004，96(10)：739-749]。由此可见，如果能够及早确定HER2的扩增或表达状态，便可及早使患者接受更佳的治疗方案，让患者拥有更多的生存机会。
在《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2007版)》、《乳腺癌HER2检测指南》(2009版)、《乳腺癌临床实践指南(中国版)》(2009年第一版)中均指出：对于HER2免疫组化结果不明确的患者，需要应用FISH检测来确定。然而，FISH检测价格较为昂贵，导致不少乳腺癌患者丧失了检测机会。有研究表明，实时荧光PCR法与FISH方法检测乳腺癌组织样本的一致性高，且可能具有更高的灵敏度[Gjerdrum LM，Sorensen BS，et al.J Mol Diagn，2004，6(1)：42-51]。
本试验所用人HER2基因扩增定量检测试剂盒(实时荧光PCR法)相对于FISH检测具有以下优点：
1.样本处理过程简便，实验周期短，实验操作易于标准化。
2.价格适中，易于临床推广。
3.定量准确，这是本试剂方法最独特的优点。通过实时荧光PCR扩增曲线参数，定量测定样本中HER2基因拷贝数。
4.减少人为实验误差。FISH检测易因主观因素造成结果误判，同时也受到检测者专业知识和实验室条件的限制，且目前FISH检测试剂价格较高，很难大面积推广。
人HER2基因扩增定量检测试剂盒(实时荧光PCR法)是第一个实现HER2基因扩增检测批量化、标准化的产品。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种HER2基因扩增的定量检测试剂盒。
为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl2、dNTP混合液及可特异性扩增HER2基因的PCR引物与探针的定量检测试剂盒及检测方法：
(1)针对HER2基因组DNA设计上下游引物及特异性的探针，该引物可以特异性的扩增HER2基因组的一段序列，该探针可与HER2特异性结合。
(2)为定量检测HER2扩增比例，本发明设计了内参，针对内参基因ACTB基因组DNA设计上下游引物及特异性的探针，该引物可以特异性的扩增ACTB基因组的一段序列，该探针可与ACTB特异性结合。
(3)为定量检测HER2扩增比例，本发明设计了标准品，对待测样品与标准品进行HER2与内参基因的荧光定量PCR检测。
(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的HER2基因与ACTB基因的比例。
所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。
针对HER2基因组DNA，荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与HER2的碱基特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；所述的荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。优选的，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12。
针对内参基因ACTB基因组DNA，荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与ACTB的碱基特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；所述的荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。优选的，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14。
所述标准品至少包括质粒、基因组DNA或化学合成序列中的一种。优选地，所述标准品为质粒，所述含部分HER2基因序列的质粒的序列为SEQ ID NO：15；所述含部分ACTB基因序列的质粒的序列为SEQ IDNO：16。
所述待检样品包括新鲜组织、石蜡包埋组织。
所述引物由上游引物与下游引物组成。所述HER2引物优选为SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；所述ACTB引物优选为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10。
所述HER2基因扩增的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂：如上所述的引物、探针和对照品。所述试剂盒优选还包括Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl2、dNTP混合液。优选的引物与探针的比例为2∶1-10∶1，优选的正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2所用标准品构建方法示意图。
图2是本发明实施例2质粒图谱，箭头所指即为载体中插入基因PCR产物序列的位置。
图3是本发明实施例2的HER2质粒标准品测序结果图。
图4是本发明实施例2的ACTB质粒标准品测序结果图。
图5是本发明实施例3的标准品扩增曲线图，其中图A是HER2质粒标准品扩增曲线，图B是ACTB质粒标准品扩增曲线。
图6是根据图5绘制的标准曲线图，其中图A是HER2质粒标准曲线，图B是ACTB质粒标准曲线，
图7是本发明实施例3的样本HER2基因扩增曲线图，其中图A是石蜡包埋组织扩增曲线图；图B是新鲜组织扩增曲线图。
图8是本发明实施例3的样本ACTB基因扩增曲线图，其中图A是石蜡包埋组织扩增曲线图；图B是新鲜组织扩增曲线图。
图9是本发明的定量方法示意图。
实施例
以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(Sambrook J.)，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织基因组DNA抽提
我们所测试的人类新鲜乳腺癌肿瘤组织、石蜡包埋乳腺癌组织。
标本DNA抽提
可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提DNA浓度与纯度(OD260/OD280约为1.8，OD260/OD230大于2.0)。下面以使用Promega公司的DNA提取试剂盒为例介绍样本DNA提取步骤：
1.新鲜组织DNA抽提
(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织，置于研钵中，将组织剪碎，加液氮研成粉末。
(2)加入600μl预冷的裂解液于研钵中，用1ml大枪头吹打6次，尽量使组织粉末与裂解液混匀，转移混合物到1.5ml EP管中，上下颠倒6次混匀后65℃水浴20分钟。
(3)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。
(4)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。
(5)转移上清至事先加600μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。
(6)弃上清，加600μl 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀后13,000*g，室温离心1分钟。
(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。
(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。
2.石蜡包埋组织DNA抽提
(1)将1mg或少于1mg的组织放入1.5ml离心管内。
(2)加入新鲜制备的100μl温育缓冲液/蛋白酶K溶液。根据样品的类型，56℃温育过夜。
(3)取出温育的样品管，加入两倍体积的裂解缓冲液。
(4)高速涡旋振荡树脂10秒钟至树脂完全悬浮，加入7μl完全悬浮的树脂。高速涡旋振荡3秒钟后室温温育5分钟。
(5)高速涡旋振荡2秒钟，将管子放在磁分离架上。磁分离立刻进行。
(6)小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。
(7)加入100μl裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。
(8)将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液。
(9)加入100μl配制的1x洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。
(10)将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液。
(11)重复步骤9和10两次，共3次洗涤，并确保在最后一次洗涤后，除去所有的液体。
(12)打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟。
(13)加入25μl洗脱液。
(14)盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。65℃温育5分钟。
(15)取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟。立即放到磁分离架上。
(16)将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。
实施例2：阳性标准品的准备
1载体的准备
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。
2插入片段的准备
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经实施例1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件如下表(表1、表2、表3)：
表1：PCR反应体系(50μl)
Figure BSA00000232243600061
若制备HER2阳性标准品，扩增体系中需要加入HER2-F-1(SEQ IDNO：3)与HER2-R-1(SEQ ID NO：5)引物序列；若制备ACTB阳性标准品，扩增体系中需要加入ACTB-F-1(SEQ ID NO：7)与ACTB-R-1(SEQID NO：9)引物序列。
表2：PCR引物
Figure BSA00000232243600062
Figure BSA00000232243600071
表3：PCR扩增条件
Figure BSA00000232243600072
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD 18-T载体(购自TAKARA公司)。
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为标准品(图3、图4)。
实施例3：人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织基因组DNA HER2基因扩增检测
1.荧光定量PCR反应模板为实施例1提取的乳腺癌样本基因组DNA与实施例2制备的标准品，以双蒸水为阴性对照。
2.反应体系及反应条件(表4、表5、表6、表7)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。
表4：荧光定量PCR反应体系(20μl/管)
Figure BSA00000232243600073
Figure BSA00000232243600081
HER2扩增体系中需要加入HER2-F-1(SEQ ID NO：3)或HER2-F-2(SEQ ID NO：4)与HER2-R-1(SEQ ID NO：5)或HER2-R-2(SEQ ID NO：6)引物序列；ACTB扩增体系中需要加入ACTB-F-1(SEQ ID NO：7)或ACTB-F-2(SEQ ID NO：8)与ACTB-R-1(SEQ ID NO：9)或ACTB-R-2(SEQID NO：10)引物序列(表5)。
表5：引物
HER2扩增体系中需要加入HER2-P-1(SEQ ID NO：11)或HER2-P-2(SEQ ID NO：12)探针序列；ACTB扩增体系中需要加入ACTB-P-1(SEQ ID NO：13)或ACTB-P-2(SEQ ID NO：14)探针序列(表6)。
表6：探针
Figure BSA00000232243600083
Figure BSA00000232243600091
表7：扩增条件
Figure BSA00000232243600092
3.绘制标准曲线
根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制绘制标准曲线。图5为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表依次10稀释为5E-1ng/μl、5E-2ng/μl、5E-3ng/μl、5E-4ng/μl、5E-5ng/μl的质粒标准品的扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图6)。在图6中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度基本一致，最大的差距仅有二十几个碱基的长度，相对于PMD18-T载体2692bp的长度影响不大，所以HER2与ACTB质粒标准品的拷贝数之比≈质量之比。
4.标本HER2基因扩增计算
根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的HER2与ACTB基因组DNA的拷贝数，HER2 DNA与ACTB DNA的比值即为HER2基因扩增量。如图7、图8所示的石蜡包埋组织与新鲜组织HER2的CT值分别为21.05与23.40，内参基因ACTB的CT值分别为25.88与24.95，由分别对应的标准曲线公式(图6)可以求得各自的拷贝数，则所检测样本基因扩增量分别为281％与161％。
5.检测结果
本实施例对50例乳腺癌的组织标本进行了HER2基因扩增的检测。共检测到14例发生扩增，具体的扩增情况见表8
表8：HER2扩增量与扩增例数
Figure ISA00000232243800011
Figure ISA00000232243800051
Figure ISA00000232243800061
Figure ISA00000232243800071
Figure ISA00000232243800091
Figure ISA00000232243800101
Figure ISA00000232243800121
Figure ISA00000232243800131
Figure ISA00000232243800141
Figure ISA00000232243800151
Figure ISA00000232243800161
Figure ISA00000232243800171
Figure ISA00000232243800181
Figure ISA00000232243800191
Figure ISA00000232243800201
Figure ISA00000232243800221
Figure ISA00000232243800231
Figure ISA00000232243800241
Figure ISA00000232243800251
Figure ISA00000232243800261
Figure ISA00000232243800281
Figure ISA00000232243800291
Figure ISA00000232243800301
Figure ISA00000232243800311
Figure ISA00000232243800321
Figure ISA00000232243800331
Figure ISA00000232243800341
Figure ISA00000232243800351
Figure ISA00000232243800361
Figure ISA00000232243800371
Figure ISA00000232243800381
Figure ISA00000232243800391
Figure ISA00000232243800401
Figure ISA00000232243800411
Figure ISA00000232243800421
Figure ISA00000232243800451
Figure ISA00000232243800461
Figure ISA00000232243800471
Figure ISA00000232243800481
Figure ISA00000232243800491
Figure ISA00000232243800501

Claims (10)

1.一种聚合酶链式反应引物，其在适宜的PCR条件与HER2基因或ACTB基因发生反应。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物与下游引物组成。
3.如权利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述引物的序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。
4.一种荧光定量PCR探针，其在适宜的PCR条件下与HER2基因或ACTB基因碱基序列特异性结合。
5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
6.如权利要求4或5所述的探针，其特征在于，所述探针的序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
7.一种质粒，该质粒包含待检测的HER2基因或ACTB基因序列。
8.如权利要求7所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的HER2基因序列为SEQ ID NO：15，ACTB基因序列为SEQ ID NO：16。
9.一种HER2基因扩增的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自以下的试剂：如权利要求1-3任一项所述的引物、权利要求4或5所述的探针、以及权利要求7或8所述的质粒。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，引物与探针的比例为2∶1-10∶1，正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。
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