CN101429540B - 实时定量pcr检测细胞周期蛋白b2基因表达的方法 - Google Patents

实时定量pcr检测细胞周期蛋白b2基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种体外定量检测血液样品中尤其是血清样本中细胞周期蛋白B2基因表达的方法。本发明还提供了在体外检测样品中细胞周期蛋白B2基因表达的方法以及用于定量检测血液样品中细胞周期蛋白B2基因的试剂盒。该试剂盒可以用于肿瘤的临床辅助诊断以及疗效监测。

Description

实时定量PCR检测细胞周期蛋白B2基因表达的方法
技术领域
本发明涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本发明涉及一种新的检测血液尤其是血清中细胞周期蛋白B2基因表达的方法及其试剂盒。 
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前全球每年至少有700万人死于恶性肿瘤，其中我国约130万，恶性肿瘤已成为继心脑血管病之后人类因疾病死亡的第二位原因。恶性肿瘤中90％以上属于上皮来源的实体肿瘤(俗称癌症，如肺癌、肝癌、胃癌等)，这些恶性实体肿瘤(以下简称肿瘤)致死的主要原因是转移，尤其是全身转移。临床观察到，对病理检查无淋巴结转移的早期肿瘤患者，根治性手术后仍有相当一部分因全身转移而最终死亡，提示在手术时体内已经存在少量癌细胞全身播散但应用现有的诊断手段(如影像学和核医学等)尚无法发现，这类隐匿性的转移(Occult Metastasis，或称微转移，Micrometastasis)是患者术后肿瘤复发转移的一个重要根源(1)。 
动物实验揭示，当瘤重达到1克(直径1cm)时，每天约有106癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液，这些癌细胞在血液中很少死亡，它们通过血液循环转运到各器官后很快穿越血管内皮屏障进入组织，其中98％的癌细胞在组织内凋亡并被机体清除，但仍有2％的癌细胞存活下来并发展成为转移病灶(2)。德国学者曾对骨髓中的微转移癌细胞进行培养，证明此类癌细胞能够在体外生长，并且癌细胞活跃生长者生存期短。因此，血液中出现癌细胞是肿瘤转移的一项早期预警指标，预示转移的风险增高。建立肿瘤转移的早期预警系统在临床上具有广泛的应用价值，因为该系统不仅有助于对患者进行预后评估，而且更重要的是可以对术后转移进行早期诊断和及时治疗，以期巩固疗效和改善预后。此外，检测血液中癌细胞还可以作为评估晚期肿瘤化疗疗 效的一项分子标志。文献报道，化疗后血液中癌细胞消失者预后好、生存期长(2，3)。 
几乎所有肿瘤都有一个根本的共同特征：细胞周期调控机制的破坏导致细胞的失控性生长。细胞周期蛋白是细胞周期调控的作用蛋白，它可大致分成两大类：G1周期素(G1 cyclins或START cyclins)及分裂期周期素(mitotic cyclins)。在哺乳类动物中，G1周期素有周期素D及E二种，而分裂期周期素包括周期素A和B1、B2，它们在整个间期中相当稳定，但在有丝分裂时却被迅速而特异地降解。在启动有丝分裂中周期素A和B起重要的协同作用，一旦进入有丝分裂期，周期素B将成为最重要的。它在有丝分裂的中期-后期过渡处降解；是完成有丝分裂所必需的。细胞周期蛋白B2是细胞周期依赖合成的。它与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶1(cdc2)相连接形成一个复合物，这一复合物对于细胞有丝分裂有正向调节的作用，对于细胞进行有丝分裂是关键的(4，5)。三氧化二砷(As2O3)是一种致癌剂可以促进细胞增殖诱导肿瘤的发生，但在体外实验上存在剂量效应外推的不确定性。细胞周期蛋白B2在G2期有最大的表达，且受转录水平的调节(6)，在肺癌、乳腺癌等肿瘤中表达增高，可被认为是一种较好的血清诊断标志物。 
因此近十年来从血液中检测肿瘤标记物受到了国内外学者的普遍关注(8)。随着现代免疫学和分子生物学技术的发展，目前已经能够对血液中的微量肿瘤标记物的mRNA进行检测，表1列举了近年来对6种常见肿瘤患者血液的肿瘤标记物检测的若干结果，报道中有6篇附有2年以上的随访结果，证明血液中检出癌细胞与患者预后呈负相关。根据北京市肿瘤研究所的最新统计资料，这些肿瘤的发病率居北京市区恶性肿瘤的前10位，占恶性肿瘤总发病率的70％以上。 
表1恶性实体肿瘤患者血液中肿瘤标记物检测结果 
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200031
注：CEA：癌胚抗原；CK：细胞角蛋白；S5A：肺癌特异性单抗识别的抗原；MAGE：黑色素瘤抗原；EPCAM：上皮细胞粘附分子；RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应；FCM：流式细胞仪检测；IHC：免疫组化。 
目前从血液中检测肿瘤标记物的技术还不完善，存在许多问题，一是检测方法不统一，包括各家采用的检测技术和肿瘤标志不一致，研究结果很难相互比较：二是敏感性较低，可能会有一部分患者漏诊；三是大部分肿瘤标志基因在正常白细胞中有“非法表达”(Illegitimate Expression)现象，如采用RT-PCR检测CK-19mRNA在一部分健康人外周血中可能出现“假阳性”(10)。 
因此，本领域中迫切需要建立一种敏感性高、特异性好、适用面广的检测方法。 
发明内容
为达到上述目的，本发明第一方面提供了一种体外检测样品中细胞周期蛋白B2的方法，所述方法包括以下步骤： 
在细胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸区间制备标准品； 
根据细胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸区间设计引物及Taqman探针； 
用Taqman技术对细胞周期蛋白B2基因mRNA的相对表达量进行相对定量分析。 
本发明第二方面还提供了一种体外实时定量检测血液样品中细胞周期蛋白B2基因表达的方法，它包括以下步骤： 
用分离胶从血液样品中分离血清； 
从血清中抽提RNA并获得cDNA； 
在细胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸区间制备标准品； 
根据细胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸区间设计引物及Taqman探针；用Taqman技术对细胞周期蛋白B2基因mRNA的相对表达量进行相对定量的分析。 
本发明第三方面提供了一种用于定量检测血清样品中细胞周期蛋白B2基因表达的试剂盒，所述试剂盒包含引物、DNA标准品和Taqman探针，其中所述引物及探针是根据细胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸区间设计得到，所述DNA标准品根据细胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸区间制得。 
本发明的方法通过分离胶从血液中分离血清后，采用实时定量PCR检测血清样本中细胞周期蛋白B2的mRNA表达，从而对血清中的细胞周期蛋白B2的含量做出判断。 
本发明的优点是：一，可用于几乎所有恶性肿瘤的检测，适用面广；二，具有较高的特异性和敏感性。 
具体实施方式
对本领域中所存在的上述问题，本发明提出了一套新的解决方案。 
首先，本发明选择细胞周期蛋白B2作为区分肿瘤患者和正常人的血清分子标志，从而提供了能够适用于所有肿瘤的检测技术。 
在本发明中，发现细胞周期蛋白B2在部分肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌和肾细胞癌等实体肿瘤患者的血清中均呈高表达。而在340例正常人中没有表达。 
肿瘤细胞的一个基本特征是无限制增殖，该特征与细胞周期蛋白B2的mRNA异常表达有关。恶性肿瘤细胞通过启动细胞周期蛋白B2基因的表达促进恶性增殖。由于成年人体内绝大部分细胞，除了原始的干细胞、生殖细胞和活化的淋巴细胞外，均不表达细胞周期蛋白B2，而在部分肿瘤中均可以检测到细胞周期蛋白B2的mRNA，这一特性使得细胞周期蛋白B2成为肿瘤细胞的一种理想标志。因此，细胞周期蛋白B2可以鉴别正常细胞和癌细胞，正常细胞的表型为细胞周期蛋白B2“-”，而癌细胞为细胞周期蛋白B2“+”。第二，在血液中正常白细胞与癌细胞的鉴别也是一个十分棘手的问题。由于血液中癌细胞含量甚少，采用病理形态观察无法找到癌细胞。目前普遍采用RT-PCR等高度敏感的分子检测技术进行分析，但由于正常白细胞存在肿瘤标志基因的非法表达现象，假阳性问题很难排除。通过分离血清可以排除检测过程中正常白细胞的干扰、消除假阳性和提高诊断率。 
实时定量PCR是根据Taqman技术发展起来的一项新颖的基因检测方法，其原理是将靶基因特异性的一组引物和荧光标记探针与模板cDNA进行杂交，然后在聚合酶链反应过程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探针3’-端的荧光淬灭基团，获得荧光激发信号，后者与模板量呈正相关。应用这一技术可以从1-10pg RNA中检测到靶基因mRNA的表达，由于1个细胞中至少含有10pg RNA，因而实时定量PCR的检测极限可以达到1-10个细胞。 
本发明提供了一种相对实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术，用于检测细胞周期蛋白B2基因表达。该方法主要采用目前国际上通用的2-ΔΔCt法进行相对定量分析(16)，通过分析靶基因与内参基因(β-肌动蛋白基因)的比值与标准品中靶基因与内参基因(β-肌动蛋白基因)的比值，得到相对于标准品而言，靶基因相对于内参基因的表达状况，由此来达到定量分析。 
本发明另一方面还提供了几套PCR引物及探针，能够特异性地扩增细胞周期蛋白B2和内参照基因(β-肌动蛋白基因)的mRNA。具体而言，发明人根据Genbank数据库中公开发表的细胞周期蛋白B2(NM_004701.2)和作为内参基因的β-肌动蛋白(NM_001101.2)基因序列，采用internet上公开的引物设计软件(例如ABI公司的引物设计 软件primer express 2.0)，根据细胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸区间和第1078-1316位核苷酸区间分别设计了引物和探针，建立了细胞周期蛋白B2和作为内参基因的β-肌动蛋白基因的实时定量PCR检测方法。 
本发明另一方面还提供了利用标准品来定量检测细胞周期蛋白B2基因在生物样本中的相对表达量的方法。本发明中所涉及到的标准品包括但不限于：从人的血清、全血、或人细胞系中提取的RNA样本。 
然而，本领域技术人员应当能够理解，本文列举的引物和探针仅仅是为了描述本发明。本领域技术人员在阅读了本说明书后，能够采用常规的手段在细胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸区间内通过适当选择其他引物来合成DNA标准品，也能够在细胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸区间内选择其它合适的引物和探针，通过相对定量的2-ΔΔCt法，来达到本发明的目的。 
实时定量PCR通常分为相对定量和绝对定量二类。相对定量分析以靶基因阳性表达的细胞作为标准，通过分析靶基因与内参照基因(如β-肌动蛋白等)的比值，获得待测样本中靶基因表达的相对值。这种方法的优点是容易开发，但所得的数值受阳性标准细胞的影响，不同的实验室若采用不同的阳性细胞作为标准，则结果难以相互比较。 
单细胞实时定量PCR(Single Cell Quantitative Real-time PCR)。将该方法与常规PCR进行了比较，证明单细胞实时定量PCR检测的敏感性可以提高100倍。此外，发明人应用相对定量的方法对10例正常肺组织和55例肺癌组织中细胞周期蛋白B2 mRNA含量进行了分析，确定了正常肺组织中细胞周期蛋白B2基因表达的标准值。按此标准，肺癌组织中细胞周期蛋白B2阳性表达率为69.1％。 
表2：各种肿瘤患者血清中细胞周期蛋白B2的相对表达量 
 070308XC01     肺癌     163956.8     0.12
 070308XC03     肺癌     27632.1     0.02
 070508XC07     肺癌     10340.4     0.01
 070605XC02     肺癌     0     0.00
 070605XC06     肺癌     0     0.00
 070612XC01     肺癌     98.9     0.00
 070616XC09     肺癌     25782.5     0.04
 070616XC14     肺癌     551693.0     0.78
 070620XC01     肺癌     67173.6     0.32
 070620XC04     肺癌     124782.5     0.60
 070328XC06     肺癌     1339.1     0.01
 070529XC03     肺癌     760.6     0.00
 070626XC01     肺癌     135300.4     0.21
 070626XC02     肺癌     141687.8     0.22
 070626XC06     肺癌     189043.2     0.30
 070626XC09     肺癌     0     0.00
 070627XC03     肺癌     24277.9     0.17
 070627XC08     肺癌     8837.7     0.06
 070622XC01     肺癌     196341.6     0.46
 070627XC14     肺癌     31957.3     0.08
 070522XC05     肺癌     20982.6     0.05
 070710XC03     肺癌     2355.6     0.10
 070602XC01     肝癌     0     0.00
 070602XC03     肝癌     0     0.00
 070612XC04     肝癌     0     0.00
 070612XC10     肝癌     523654.7     0.64
 070616XC13     肝癌     0     0.00
 070328XC11     肝癌     2769.9     0.00
 070426XC05     肝癌     4012.4     0.01
 070612XC06     甲状腺癌     0     0.00
 070710XC07     甲状腺癌     2036.4     0.09
[0037] 
 070429XC02   甲状腺癌术后     361843.5     0.10
 070710XC02   甲状腺癌术后     0     0.00
 070315XC01   颈下腺癌术后     36889.1     0.06
 070428XC01   淋巴瘤     0     0.00
 070627XC12   淋巴瘤     47711.7     0.34
 070601XC02   卵巢癌     678719.6     5.28
 070328XC08   卵巢癌     195255.8     1.52
 070605XC05   卵巢癌     0     0.00
 070308XC02   卵巢癌     0     0.00
 070629XC05   卵巢癌     0.3     0.00
 070616XC10   泌尿系感染     862.5     0.00
 070302XC05   前列腺癌     177678.1     0.13
 070605XC04   前列腺癌     5215.4     0.00
 070630XC02   前列腺癌     0     0.00
 070426XC06   食道癌     331076.8     2.58
 070331XC02   结肠癌     518112.6     0.37
 070612XC07   结肠癌     35044.6     0.04
 070626XC08   结肠癌     101819.6     0.16
 070411XC30   乳腺癌     2160758.2     16.80
 070429XC05   乳腺癌     645902.2     0.18
 070612XC05   乳腺癌     27864.8     0.03
 070620XC03   乳腺癌     0     0.00
 070323XC13   乳腺癌     2489.7     0.01
 070627XC06   乳腺癌     43946.4     0.31
 070627XC09   乳腺癌     8829.7     0.06
 070302XC13   乳腺癌     250996.2     0.59
 070522XC14   乳腺癌     0     0.00
 070629XC01   乳腺癌     25.2     0.00
 070704XC06   乳腺癌     61.8     0.00
 070710XC06   乳腺癌     0     0.00
 070109XC01   乳腺癌，乳腺癌     172550.1     0.09
[0038] 
      术后    
 070116XC01     乳腺癌术后     267773.9     2.08
 070116XC04     乳腺癌术后     0     0.00
 070616XC12     乳腺癌术后     7.1     0.00
 070123XC01     乳腺癌术后     59866.3     0.09
 070323XC04     乳腺癌术后     172.4     0.00
 070417XC02     乳腺癌术后     41918.7     0.07
 070508XC02     右乳癌术后     464801.8     0.25
 070612XC03     直肠癌     6485.9     0.01
 070118XC05     子宫内膜癌     1342.4     0.01
 070627XC02     胃癌     0     0.00
 070627XC07     胃癌     67013.1     0.47
 070627XC13     胃癌     0     0.00
 070522XC13     胃癌     13078.9     0.03
 070711XC01     胰腺癌     388352.2     16.31
 070602XC05     食管癌     0     0.00
 070411XC18     食管癌     835833.6     0.24
 070508XC06     食管癌     2217812.8     0.62
 070508XC01     食管癌     11573.2     0.01
 070616XC15     食管癌     402.4     0.00
 070626XC07     食管癌     210594.2     0.33
 070627XC04     食管癌     58326.2     0.41
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200081
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200091
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200101
*：是相对定量，正常人的基准值是100。 
以下借助非限制性实施例详细描述本发明。 
实施例1：实时定量PCR检测技术 
1.1材料与方法 
正常血清样本来自北京军区总医院新兵体检，各种肿瘤患者血清主要取自承德北方医院与保定恒兴中西医结合医院。Trizol RNA抽提试剂盒购自In Vitrogen上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidT′第一链cDNA合成试剂盒购自Promege公司。PCR引物探针由大连宝 生物生物工程公司合成。荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。定量PCR仪为FB-2000(上海枫岭生物科技公司) 
  Cyc B2-8  SEQ ID NO：18  5’AGCTGCTTCCTGCTTGTCTC3’
 SEQ ID NO：19  5’GCACAATGAAGCACACATCC3’    
Cyc B2-9  SEQ ID NO：20  5’CCAGTTCCCAAATCCGAGAA3’  
 SEQ ID NO：21  5’CTGGTCTGAGAAGAGGTTTCATGAG3’    
β-肌动蛋白基因 β-actin-1  SEQ ID NO：22  5’CATCCTCACCCTGAAGTA3’
 SEQ ID NO：23  5’ACACGCAGCTCATTGTAG3’    
 SEQ ID NO：24  5’ FAM-CCCATCGAGCACGGCATCGT-TAM RA3’    
18s rRNA 18s rRNA-1  SEQ ID NO：25  5’ACATCCAAGGAAGGCAGCAG3’
 SEQ ID NO：26  5’TTCGTCACTACCTCCCCGG3’    
 SEQ ID NO：27  5’FAM- CGCGCAAATTACCCACTCCCGA-TAMRA 3’    
细胞周期素B2特异性逆 转录引物 RT CyclinB2-1  SEQ ID NO：28  5’CGCATGCGTCCATTTATA3’
RT Cyclin B2-2  SEQ ID NO：29  5’GTAGGTTTCAGTTGTTTG3’  
RT CyclinB2-3  SEQ ID NO：30  5’GCAAGGTCTTTGACGGCTTT3’  
β-肌动蛋白特异性逆转录引物 RTβ-actin-1  SEQ ID NO：31  5’GGTCATCTTCTCGCGGTT3’
18s rRNA特异性逆转录引物 RT18s rRNA-1  SEQ ID NO：32  5’GGACTCATTCCAATTACAG3’
根据Genbank数据库中公开发表的细胞周期蛋白B2(NM_004701.2)和β-肌动蛋白(NM_001101.2)基因序列，采用Internet公开的ABI公司出产的引物设计软件primer express 2.0，分别设计了几组引物和探针，见表3。 
表3：引物和Taqman探针 
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200111
Figure DEST_PATH_GSB00000982690200121
抽提总RNA后采用紫外分光光度计(美国Nanodrop公司的紫外分光光度计)测定A260及A280。取2μg RNA按试剂盒要求合成cDNA， 反应体积为10μl。 
(1)检测样本总RNA的制备： 
用带有分离胶的管子采血，4,400rpm离心10分钟，取250μl血清分装到1.5ml eppendorf管中，加入750μl Trizol试剂，马上剧烈混匀，短暂离心，开盖加入200μl氯仿，混匀，静置10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清(大约500μl)到另一个1.5ml的eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀沉淀1小时，12000rpm离心10分钟，收集沉淀，用1ml的70％乙醇洗涤一次，晾干沉淀，用10μl的DEPC-H2O溶解。取3μl用紫外分光光度计进行浓度纯度测定。 
(2)逆转录反应，取2μg总RNA配成5.5μl反应体积，进行反转录。选取针对细胞周期蛋白B2、β-肌动蛋白特异反转录引物SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，用MMLV分别对各个样本进行反转录。 
(3)定量PCR反应 
取反转录反应产物，稀释10倍，取5μl为模板，进行定量PCR反应，10X PCR反应缓冲液2.5μl， 
表4.定量PCR反应反应体系计算和配置 
实施例2 
荧光定量PCR法检测血清18S rRNA和细胞周期蛋白B2转录本 在癌症检测中的应用，测定各个反应管的Ct值，应用delta Ct法进行样本中细胞周期蛋白B2相对量的计算分析(图1所显示的是表2中列出的的10种不同类型癌症检测所得到的相对表达量的平均值)。 
用表3中所列的引物和探针分别对表2中的各种样品进行检测。 
不同实验间误差共5％。在检测的来自10种类型癌症(见表2)的所有血清样品中，发现与正常样品相比，细胞周期蛋白B2明显过量表达。 
实施例3 
荧光定量PCR法检测血清18S rRNA和细胞周期蛋白B2转录本在治疗处理后的患者中的应用 
为了检查细胞周期蛋白B2的血清表达水平的实时PCR检测是否能用于监测癌症治疗处理(例如手术、化疗、放疗等)，以及监测治疗后癌症复发的效力。在癌症治疗处理之前和之后，如上所述比较血清细胞周期蛋白B2的表达水平(图2)。发现在治疗(例如手术)之后，上述10种癌症的患者中血清细胞周期蛋白B2水平都显著降低(图2所显示的是平均值±标准方差)。 
实施例4 
荧光定量PCR法检测人细胞系中18S rRNA和细胞周期蛋白B2转录本作为标准品 
为了选择稳定性和一致性高的标准品作为计算细胞周期蛋白B2的血清相对表达水平，从而更准确有效地反映癌症治疗处理(例如手术、化疗、放疗等)，以及监测治疗后癌症复发的情况，我们对人细胞系293T的细胞悬浊液(图3A)和从人细胞系293T中提取的总RNA(图3B)进行了梯度稀释并按照实施例1中的方法进行了细胞周期蛋白B2的荧光定量PCR法检测(图3所显示的是平均值)。发现细胞周期蛋白B2在293T细胞中的相对表达水平和细胞个数(图3A)，以及RNA浓度(图3B)成很好的相关性。另外，我们在6个月内对上述实验进行了多次重复(每周一次)(样本均保存在-80℃)并发现所有实验中细胞周期蛋白B2的相对表达水平具有很好的一致性和 稳定性(标准方差＜10％)(数据未显示)。这些结果表明利用荧光定量PCR法检测人细胞系中18S rRNA和细胞周期蛋白B2转录本可以作为标准品。 
虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。 
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图1显示的是对10种不同类型癌症检测所得到的细胞周期蛋白B2的相对表达量的平均值； 
图2显示的是在癌症治疗处理之前和之后，血清细胞周期蛋白B2表达水平的比较； 
图3显示的是对人细胞系293T的细胞悬浊液(图3A)和从人细胞系293T中提取的总RNA(图3B)进行的细胞周期蛋白B2的荧光定量PCR法检测的结果。 
                    序列表 
<110>北京雅康博生物科技有限公司 
<120>实时定量PCR检测细胞周期蛋白B2基因表达的方法 
<160>32 
<210>1 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>1 
CACAGGATACACAGAGAATG                                   20 
<210>2 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>2 
CTTGATGGCGATGAATTTAG                                   20 
<210>3 
<211>24 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：探针 
<400>3 
ATTGGAAGTCATGCAGCACATGGC                               24 
<210>4 
<211>21 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>4 
GGACATTGATAACGAAGATTG                                  21 
<210>5 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>5 
GCTGCCTGAGATACTGAT                                     18 
<210>6 
<211>23 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：探针 
<400>6 
AGAACCCTCAGCTCTGCAGTGAC                                23 
<210>7 
<211>15 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>7 
GGCACTCTTGCCTTC                                        15 
<210>8 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>8 
GTTCGCCTAATAGTCACA                                     18 
<210>9 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：探针 
<400>9 
CTCATGGCGCTGCTCCGACG                                   20 
<210>10 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
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<400>10 
TTGCAGTCCATAAACCCACA                                   20 
<210>11 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>11 
GAAGCCAAGAGCAGAGCA                                     18 
<210>12 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>12 
TCAACCCACCAAAACAACAA                                   20 
<210>13 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>13 
AGGGTTCTCCCAATCTTCGT                                   20 
<210>14 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>14 
AGCTGCTTCCTGCTTGTCTC                                   20 
<210>15 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>15 
GGTCTTTGACGGCTTTTGAG                                   20 
<210>16 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>16 
CCTACTGCTTCTGTCAAACC                                   20 
<210>17 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>17 
TGTGGGTTTATGGACTGCAA                                   20 
<210>18 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>18 
AGCTGCTTCCTGCTTGTCTC                                   20 
<210>19 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>19 
GCACAATGAAGCACACATCC                                   20 
<210>20 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>20 
CCAGTTCCCAAATCCGAGAA                                   20 
<210>21 
<211>25 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>21 
CTGGTCTGAGAAGAGGTTTCATGAG                              25 
<210>22 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>22 
CATCCTCACCCTGAAGTA                                     18 
<210>23 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>23 
ACACGCAGCTCATTGTAG                                     18 
<210>24 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：探针 
<400>24 
CCCATCGAGCACGGCATCGT                                   20 
<210>25 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>25 
ACATCCAAGGAAGGCAGCAG                                   20 
<210>26 
<211>19 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>26 
TTCGTCACTACCTCCCCGG                                    19 
<210>27 
<211>22 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：探针 
<400>27 
CGCGCAAATTACCCACTCCCGA                                 22 
<210>28 
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<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>28 
CGCATGCGTCCATTTATA                                     18 
<210>29 
<211>18 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>29 
GTAGGTTTCAGTTGTTTG                                     18 
<210>30 
<211>20 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>30 
GCAAGGTCTTTGACGGCTTT                                   20 
<210>31 
<211>18 
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<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>31 
GGTCATCTTCTCGCGGTT                                     18 
<210>32 
<211>19 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<220> 
<223>人工序列的描述：引物 
<400>32 
GGACTCATTCCAATTACAG                                    19 

Claims (1)

1.用于定量检测血清样本中细胞周期蛋白B2基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物、DNA标准品和探针，其中所述DNA标准品根据细胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸区间制得，所述引物为SEQ ID NO：1和2，所述探针为SEQ ID NO：3。
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GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20090513

Assignee: Zhongguancun Technology Leasing Co., Ltd

Assignor: BEIJING ACCB BIOTECH Ltd.

Contract record no.: X2021980013219

Denomination of invention: Detection of cyclin B2 gene expression by real-time quantitative PCR

Granted publication date: 20130710

License type: Exclusive License

Record date: 20211124

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Detection of cyclin B2 gene expression by real-time quantitative PCR

Effective date of registration: 20211130

Granted publication date: 20130710

Pledgee: Zhongguancun Technology Leasing Co., Ltd

Pledgor: BEIJING ACCB BIOTECH Ltd.

Registration number: Y2021980013701

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right