CN105154581A - 一种非小细胞肺癌的诊断和预示方法和生物检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌的诊断和预示方法和生物检测试剂盒，通过将多个肿瘤标志物联合应用于非小细胞肺癌的诊断和预示，特异性和灵敏度均明显高于使用单一肿瘤标志物对非小细胞肺癌的诊断和预示；本发明进一步提供了基于所述多个标志物的生物检测试剂盒，该试剂盒使用方便，特异性好、灵敏度高，能够用于非小细胞肺癌的诊断，治疗过程中的疗效评估以及治疗后转移复发的监控，临床应用前景非常高。

Description

一种非小细胞肺癌的诊断和预示方法和生物检测试剂盒

技术领域

本发明属于肿瘤诊断领域，具体涉及非小细胞肺癌的诊断和预示方法和生物检测试剂盒，用于辅助诊断和预示非小细胞肺癌。

背景技术

肺癌是一种严重威胁人类健康的疾病，随着其发病率和死亡率的逐年升高，越来越引起研究者的关注。2013年全球新发肺癌300万例，占全球肿瘤的20％，其病死率居男性恶性肿瘤第一位，在女性居第二位(仅次于乳腺癌)，2013年全球死于肺癌的人数高达260万人。我国肺癌现状更为严峻，2005～2010年，我国肺癌发病人数增加16.8万，如果我国吸烟人数和空气污染不及时控制，到2025年，我国每年肺癌发病人数将超过100万，成为世界第一肺癌大国。2008年4月29日中国卫生部公布的第3次全国死因调查结果，我国肺癌死亡率在过去30年增加了4倍多(465％)，并已经取代肝癌成为我国首位肿瘤死亡原因(占全部恶性肿瘤死亡的22.7％)。

非小细胞肺癌是最常见的肺癌类型，约占肺癌总数的85％，也是威胁肺癌患者生存的最主要原因。非小细胞肺癌早期诊断困难，发现肿瘤时已有超过40％的患者出现远处转移；而且治疗手段有限，生存率低，5年生存率不超过15％。基于肿瘤的组织学类型和临床表现进行的传统分期对于判断预后、预测复发和指导疗效的效力有限。今年来，从分子生物学特征研究非小细胞肺癌的基因、表观遗传乃至基因表达等层面有了更深的认识，这有助于从本质上认识肿瘤的发病机制，肿瘤风险评估，有利于早期诊断，实现个体化治疗。

迄今尚未见半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中CystatinSN和CystatinS与非小细胞肺癌相关的报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA在诊断和预示非小细胞肺癌方面的联合应用，通过CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测，提高诊断和预示非小细胞肺癌的特异性；本发明的第二目的在于提供CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒，该试剂盒具有特异性高、灵敏度高和使用方便等优点。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种诊断和预示非小细胞肺癌的试剂，该试剂中含有能够用于检测标志物CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA浓度的试剂；所述CystatinSNmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CystatinSmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

进一步地，所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。

上述试剂在诊断和预示非小细胞肺癌方面的应用，用该试剂检测出标志物CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度后，联合CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度对非小细胞肺癌进行诊断和预示，联合公式为：

$P=\frac{\exp (-2.414+0.007a+0.016b)}{1+\exp (-2.414+0.007a+0.016b)},$

其中，a＝CystatinSNmRNA浓度，b＝CystatinSmRNA浓度。

进一步地，所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。

一种诊断和预示非小细胞肺癌的试剂盒，包含CystatinSNmRNA定量检测试剂和CystatinSmRNA定量检测试剂；所述CystatinSNmRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的TaqMAN探针；所述CystatinSmRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.22所示的TaqMAN探针。

进一步地，所述试剂盒还包括RPN1mRNA定量检测试剂，RPN1mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述RPN1mRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.24所示的TaqMAN探针。

进一步地，所述试剂盒还包括特异捕获CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的磁珠，所述特异捕获CystatinSNmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.4所示探针，所述特异捕获CystatinSmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.5所示探针，所述特异捕获RPN1mRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.6所示探针。

进一步地，所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、DMSO、DTT、Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。

附图说明

图1：特异性探针和非特异性探针富集CystatinSNmRNA比较结果；

图2：特异性探针和非特异性探针富集CystatinSmRNA比较结果；

图3：特异性探针和非特异性探针富集RPN1mRNA比较结果；

图4：非小细胞肺癌组织与癌旁组织中CystatinSNmRNA浓度的比值结果图(C/T表示非小细胞肺癌组织/癌旁组织)；

图5：非小细胞肺癌组织与癌旁组织中CystatinSmRNA浓度的比值结果图(C/T表示非小细胞肺癌组织/癌旁组织)。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：磁珠法特异性富集尿液中CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA

根据CystatinSN、CystatinS和RPN1(核糖体结合蛋白1)的mRNA序列设计捕获CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的特异探针(CystatinSNmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1，CystatinSmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2，RPN1mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3)：捕获CystatinSNmRNA的探针为5’-aaagagcacaactgtttcttctgca(dA)30-3’(SEQIDNO.4)，捕获CystatinSmRNA的探针为5’-taccaggtctattagaagca(dA)30-3’(SEQIDNO.5)，捕获内参基因RPN1mRNA的探针为5’-gatgagcttctcattctcaatgtacg(dA)30-3’(SEQIDNO.6)。上述特异探针能够与磁珠(GE，货号为3815-2103-010150)的olig(dT)互补结合，得结合特异探针的磁珠。

富集步骤如下：将新鲜尿液与样本运输保存液按照体积比为2：1的比例混合，得处理后的尿液样本，该处理后的尿液样本4℃条件下可保存一周，-20℃条件下可保存1年；然后分别将200μL含有磁珠的靶序列捕获液加入到200μL处理后的尿液中，于75℃条件下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后将样品置于磁性分离器上，5分钟后，吸弃上清，加入1mL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离器，5分钟后，吸弃上清；最后室温(18～25℃)静置5分钟，加入洗脱液20μL，枪头吹打混匀，上磁力架5分钟，将上清转至新的EP管中。

富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下：110mMLiDS(十二烷基硫酸锂)，10mMNaH₂PO₄，10mMNa₂HPO₄，5mMEDTA，7mMEGTA，pH7.5；靶序列捕获液中各组分浓度如下：135mMHEPES，1.25MLiCl，110mMLiOH，10mMEDTA，pH7.0，500μg/mL磁珠，2μM捕获探针；漂洗液中各组分浓度如下：100mMHEPES，350mMNaCl，10mMNaOH，2mMEDTA，3％乙醇，0.2％羟基甲酯，0.1％羟基丙酯，0.1％SDS，pH7.5；洗脱液中各组分浓度如下：20mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA。

同时以非特异性探针oligo(dT)以上述相同的方法非特异性富集mRNA。

将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的相对含量，检测所使用的引物如下：

CystatinSNmRNA检测引物：上游引物：5’-agagccaggcaacagacc-3’(SEQIDNO.7)

下游引物：5’-gttcatggaaggcacagg-3’(SEQIDNO.8)

CystatinSmRNA检测引物：上游引物：5’-atgaacagccagaactgca-3’(SEQIDNO.9)

下游引物：5’-caagaaggaaggagggag-3’(SEQIDNO.10)

RPN1mRNA检测引物：上游引物：5’-gtgcgacagagtgagcgaaat-3’(SEQIDNO.11)

下游引物：5’-tgagcttgccagccaccag-3’(SEQIDNO.12)

然后构建如下检测体系：SYBRGreen2×Mix10μL(购于东洋纺生物科技有限公司)，终浓度分别为250nM的上游引物和下游引物，模板2μL，加ddH₂O将体积补充至20μL。并按如下条件检测：先预变性5分钟，然后在95℃变性10秒、60℃退火15秒、72℃延伸20秒，进行45个循环；最后熔解：95℃，1分钟；40℃，1分钟；65℃，1秒；95℃，1分钟，冷却50℃，30sec。同时以oligo(dT)非特异性富集的mRNA为对照，检测引物、体系和检测条件按上述方法进行，然后比较CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的CP值(CrossPoint)，结果如图1～3所示。

由图1～3可知，使用特异探针富集到的CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的CP值更小，表明其富集的浓度更高，具有背景低、信噪比高的特点，优于使用非特异探针富集的mRNA。

实施例2：检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA在非小细胞肺癌组织中表达情况

从江苏省肿瘤医院肿瘤内科收集非小细胞肺癌、癌旁配对组织样本30例，切至米粒大小，放至RNAlater保存液中-80℃贮存，使用前平衡至室温。然后按照实施例1的方法分别富集非小细胞肺癌和癌旁配对组织的CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA，再分别以CystatinSNmRNA检测引物、CystatinSmRNA检测引物和内参基因RPN1mRNA检测引物检测30例样本非小细胞肺癌和癌旁配对组织中CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA相对表达量，检测体系和检测条件与实施例1相同。检测结果采用2^-△△CP法计算相对表达量，然后统计非小细胞肺癌与癌旁配对组织相对表达量的比值(C/N)，统计结果如图4和图5所示。由图4和图5可知，CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA在非小细胞肺癌组织中表达量明显高于癌旁组织的表达量，上述结果预示检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA含量可以用于诊断非小细胞肺癌。

实施例3：构建非小细胞肺癌检测试剂盒

1、构建CystatinSN重组质粒

以非小细胞肺癌细胞株HCC827为材料提取非小细胞肺癌细胞株总mRNA，然后以提取的mRNA为模板合成cDNA，并根据CystatinSN基因(或称CST1基因)序列设计构建CystatinSN重组质粒的引物，CystatinSN重组质粒的上游引物为5’-ctggagccccaaggagga-3’(SEQIDNO.13)，下游引物为5’-accagtccaggggtggga-3’(SEQIDNO.14)，以SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CystatinSN重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CystatinSN重组质粒用甘油保种，作为检测CystatinSN基因的标准品。

2、构建CystatinS重组质粒

根据CystatinS基因(或称CST4基因)序列设计构建CystatinS重组质粒的引物，上游引物为5’-tctgaggagaccatggcc-3’(SEQIDNO.16)，下游引物为5’-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’(SEQIDNO.17)，然后以SEQIDNO.16和SEQIDNO.17的核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CystatinS重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST4重组质粒用甘油保种，作为CystatinS基因的标准品。

分别将CystatinSN重组质粒和CystatinS重组质粒，通过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切线性化目标序列，割胶回收得到纯的线性化片段。使用体外转录试剂盒，以线性化的序列为模板，在T7RNA聚合酶的作用下，制备得到RNA，经RNA纯化试剂盒纯化后，得到RNA标准品贮液，测定浓度。经Agilent2100作RNA完整性分析，电泳图谱显示除目标序列外无其他明显的杂带及RNA降解带，则可以作为RNA标准品贮液，以备下游使用。

实施例4：绘制CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的标准曲线

将实施例3获得的mRNA标准品作梯度稀释，具体如下：STD1(100000拷贝/μL)、STD2(10000拷贝/μL)、STD3(1000拷贝/μL)和STD4(100拷贝/μL)。

设计定量检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的引物和探针，具体如下：

CystatinSNmRNA定量检测引物如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，扩增子序列如SEQIDNO.19所示，探针为：FAM-5’-tacttcttcgacgtagaggtgggcc-3’-TAMRA(SEQIDNO.20)；

CystatinSmRNA定量检测引物如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，扩增子序列如SEQIDNO.21所示，探针为FAM-5’-aacagttgtgctctttcgagatcta-3’-TAMRA(SEQIDNO.22)；

RPN1mRNA定量检测引物如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，扩增子序列如SEQIDNO.23所示，探针为FAM-5’-tggtgctgaagtcggcggtggaggct-3’-TAMRA(SEQIDNO.24)。

然后采用一步法RT-PCR前述CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的梯度浓度，检测体系为2μL10×Buffer，3μL2.5mMdNTP，2μL25mMMgCl₂，0.75μL浓度为10μm的CystatinSNmRNA或CystatinSmRNA的上、下游引物，0.5μL浓度为10μm的SEQIDNO.20或SEQIDNO.22探针，DMSO分析纯1μL；10mMDTT1μL；0.1μLRocheHSTAQ(货号12032953001)，0.1μLUDG(购自NEB公司，货号EN0362)；0.1μL逆转录酶和0.1μLRNA酶抑制剂(其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622)，灭菌纯化水8.6μL，反应条件为：37℃，5分钟；50℃，15分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒，然后根据检测结果绘制标准曲线，得出标准曲线方程。结果表明，CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA定量检测引物特异性好，在100～100000拷贝/μL范围内且相关性好，R²>0.99。CystatinSNmRNA线性方程为：y＝3.1517x+45.364(R²＝0.9981)；CystatinSmRNA线性方程为：y＝3.9315x+48.577(R²＝0.9982)。

实施例5、CystatinSNmRNA或/和CystatinSmRNA检测的特异性和灵敏度

从江苏省人民医院泌尿科收集尿液样本100例，其中非小细胞肺癌患者尿液50例，肺炎等良性病变患者尿液50例。按照实施例1的方法分别富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA，然后按实施例4的一步扩增法对富集RPN1mRNA的样本进行检测，以RPN1扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于结果分析。分析结果显示100例样本中可用样本97例，非小细胞肺癌49例，良性病变48例。再继续用实施例4的一步扩增法检测97例可用样本的CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA含量，其检测方法与实施例4相同。然后根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)。结果显示，CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA单独检测时，曲线下面积分别为0.798和0.707，应用Logistic回归统计方法得出CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测的判断公式如下：

$P=\frac{\exp (-2.414+0.007a+0.016b)}{1+\exp (-2.414+0.007a+0.016b)},$

其中，a＝CystatinSNmRNA浓度，b＝CystatinSmRNA浓度；当P大于或等于0.75，为阳性；当P小于0.75，为阴性，联合诊断的曲线下面积为0.842。因此，采用CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测非小细胞肺癌的特异性更高。为了获得更高的特异性，将CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA作为诊断非小细胞肺癌的标志物，并以此构建CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒，其包括如下组分：

CystatinSNmRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；

CystatinSmRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示；

RPN1mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQIDNO.21所示；

还包括定量检测的其他常规试剂，包括：10×Buffer，dNTP，MgCl₂，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂以及磁珠法富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的试剂。

实施例6：CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒诊断非小细胞肺癌

从江苏省鼓楼医院收集非小细胞肺癌尿液样本30例，良性病变样本30例。将尿液采用实施例1的方法富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本采用CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的相对表达量，并根据联合检测的判断公式判断阳性和阴性，同时根据临床分析诊断，结果如表1所示。

表1CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒诊断非小细胞肺癌结果

用χ²统计检测结果与临床诊断结果相关性，结果显示，P＜0.05，表明CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测非小细胞肺癌与临床诊断结果有相关性，一致性较好，Kappa值为87.3％。

实施例7：CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒评估非小细胞肺癌疗效

从江苏省肿瘤医院取10例非小细胞肺癌患者治疗前尿液，用实施例1的方法富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度，治疗结束后再取患者尿液，用实施例1的方法富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA后检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA浓度。然后利用CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测的判断公式，然后根据治疗前和治疗后P值变化评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表2所示，同时根据临床症状评估疗效，结果如表2所示。

表2CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒评估非小细胞肺癌疗效结果

患者编号	治疗前后浓度变化百分比	临床评价
			1	降低7％	无效
2	升高6％	疗效显著
			3	降低68％	改善
4	降低54％	改善
			5	升高8％	无效
6	降低71％	疗效显著
			7	降低49％	改善
8	降低39％	无效
			9	降低17％	无效
10	降低36％	改善

由表2可知，使用CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒对10例非小细胞肺癌患者疗效评估结果是有1例疗效显著，5例治疗后病情得到改善，其余4例无疗效。而临床诊断结果为2例疗效显著，4例治疗后病情得到改善，其余4例无疗效。因此采用CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测的判断结果与临床判断结果一致性达90％。

实施例8：CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒监控非小细胞肺癌转移复发

对6例疗程结束后的非小细胞肺癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，将尿液用实施例1的方法富集CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA，以RPN1扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用联合检测的判断公式计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生转移复发，为无进展生存，其结果如表3所示；同时根据临床症状监控非小细胞肺癌转移复发情况，结果如表3所示。

表3CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测试剂盒监控非小细胞肺癌移转复发情况

患者编号	6周	3个月	6个月	9个月	临床评价
						1	0.14	0.16	0.12	0.11	无进展生存
2	0.27	0.43	0.58	0.78	转移复发
						3	0.59	0.62	0.67	0.86	转移复发
4	0.39	0.46	0.51	0.56	无进展生存
						5	0.42	0.34	0.56	0.65	无进展生存
6	0.25	0.27	0.29	0.28	无进展生存

由表3可知，在跟踪第9个月时6例患者中有2例出现转移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存，与临床评价结果一致，但是在监控过程中CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA联合检测能够预测非小细胞肺癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预提供指导。

综上所述，CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA可以联合应用，作为诊断和预示非小细胞肺癌的标志物，并且同时检测CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA2个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志物，能够提高诊断的准确性。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>崔长友

<120>一种非小细胞肺癌的诊断和预示方法和生物检测试剂盒

<130>1

<160>24

<170>PatentInversion3.3

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<211>780

<212>DNA

<213>智人（Homosapiens）

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gggctccctgcctcgggctctcaccctcctctcctgcagctccagctttgtgctctgcct60

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aggccaccaaagatgactactacagacgtccgctgcgggtactaagagccaggcaacaga300

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<210>4

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

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<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

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<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

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<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

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<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

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<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

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<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

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<210>15

<211>441

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

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<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

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<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tgtaccaggtctattagaagcaag24

<210>18

<211>647

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tctgaggagaccatggcccggcctctgtgtaccctgctactcctgatggctaccctggct60

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ttgtgctctttcgagatctacgaagttccctgggaggacagaatgtccctggtgaattcc420

aggtgtcaagaagcctaggggtctgtgccaggccagtcacaccgaccaccacccactccc480

acccactgtagtgctcccacccctggactggtggcccccaccctgcgggaggcctcccca540

tgtgcctgtgccaagagacagacagagaaggctgcaggagtcctttgttgctcagcaggg600

ctctctgccctccctccttccttcttgcttctaatagacctggtaca647

<210>19

<211>113

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

aagagccaggcaacagaccgttgggggggtgaattacttcttcgacgtagaggtgggccg60

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<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tacttcttcgacgtagaggtgggcc25

<210>21

<211>296

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

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<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

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<210>23

<211>101

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

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<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

tggtgctgaagtcggcggtggaggct26

Claims (8)

1.一种诊断和预示非小细胞肺癌的试剂，其特征在于：该试剂中含有能够用于检测标志物CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA浓度的试剂；所述CystatinSNmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述CystatinSmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的诊断和预示非小细胞肺癌的试剂，其特征在于：所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。

3.权利要求1所述的试剂在诊断和预示非小细胞肺癌方面的应用，其特征在于：用该试剂检测出标志物CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度后，联合CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度对非小细胞肺癌进行诊断和预示，联合公式为：

$P=\frac{\exp (-2.414+0.007a+0.016b)}{1+\exp (-2.414+0.007a+0.016b)},$

其中，a＝CystatinSNmRNA浓度，b＝CystatinSmRNA浓度。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。

5.一种诊断和预示非小细胞肺癌的试剂盒，其特征在于：包含CystatinSNmRNA定量检测试剂和CystatinSmRNA定量检测试剂；所述CystatinSNmRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的TaqMAN探针；所述CystatinSmRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.22所示的TaqMAN探针。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RPN1mRNA定量检测试剂，RPN1mRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述RPN1mRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO.24所示的TaqMAN探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异捕获CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的磁珠，所述特异捕获CystatinSNmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.4所示探针，所述特异捕获CystatinSmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.5所示探针，所述特异捕获RPN1mRNA的磁珠上结合有SEQIDNO.6所示探针。

8.根据权利要求5～7任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括10×Buffer、dNTP、MgCl₂、DMSO、DTT、Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。