CN103849683B - 前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用 - Google Patents

前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了前列腺癌尿液检测试剂盒，所述试剂盒含有一步法RT-PCR扩增试剂，所述一步法RT-PCR扩增试剂含有检测PCA3和PSA的特异引物和探针，检测PCA3的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.5所示；检测PSA的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针如SEQ ID NO.6所示，该试剂盒具有操作流程简便，耗时短，结果判读简单，重复性好，复检率低，模板加入后PCR反应全程闭管，避免了污染导致的假阳性现象。

Description

前列腺癌尿液检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及前列腺癌尿液检测试剂盒，还涉及该试剂盒的应用。
背景技术
前列腺癌为发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，是前列腺腺泡细胞异常无序生长的结果。前列腺癌的发病率具有明显的地理和种族差异。在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位，仅次于肺癌；在亚洲，其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势。前列腺癌一般50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率随年龄增长而增加。我国每年有7万～8万名前列腺癌新病人。而隐匿未被发现的病人数则更多。因此，凡是50岁至70岁的男性都应该定期接受前列腺癌的专科筛查；而直系亲属中有前列腺癌患者的男性，则应将筛查的时间提前到40岁。
前列腺癌在转移发生之前，早发现、及时合理治疗可有效降低该病的死亡率。前列腺癌常规筛查手段有直肠指检、血清前列腺特异抗原（PSA）测定和经直肠超声检查三种，其中，经直肠指检、血清前列腺特异抗原（PSA）测定是最基本的两项检查，一般每年检查一次；发现异常时，再行经直肠超声波检查和超声引导下的前列腺穿刺活检。
PSA（Prostate Specific Antigen）为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79%，特异性20%-59%，平均灵敏度约33%，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定。PSA在血液中有两种存在形式，一种与ACT结合，一种是游离状态。研究发现与良性前列腺病变相比，前列腺癌患者血清中与ACT结合的PSA含量更高一些。当检测出患者血清中PSA含量在4-10ng/mL灰区部分时，可用游离PSA（fPSA）比总PSA（tPSA）来增加检测的特异性，可提高检测特异性约20%。
近年来发现的前列腺癌新的标记物PCA3（Prostate cancer antigen3），在前列腺癌中高表达，可反应前列腺癌进展情况。PCA3位于9号染色体，含有4个外显子，为非编码的mRNA，通过选择性剪切和多聚腺苷酸化产生至少四种不同的转录产物。RT-PCR分析显示PCA3仅在前列腺组织中表达，在其他组织中不表达。Northern blot检测分析50例患者中47例PCA3高表达，而前列腺良性病变组织中不表达或低度表达（Cancer Reserch，1999，Dec，1；59(23)：5975-9）。文献（cancer res.，2002，May1；62（9）：2695-8）报道比较端粒酶RNA和PCA3RNA作为前列腺癌的标记物，PCA3指示作用更优。PCA3为到目前为止针对前列腺癌特异性最优的标志物，含有4个外显子，三个内含子，Gandini et al2003等文献报道，与其它外显子相比，PCA3外显子4用于前列腺癌检测特异性最优。
Gen-probe公司开发的基于PCA3/PSA的尿液检测试剂盒，应用转录介导的扩增（TMA）方法给出PCA3/PSA在尿液中的浓度（copy/mL），然后二者相比后乘以1000即为前列腺癌风险评估值。该方法操作流程繁琐，耗时长，质控及结果判读复杂，复检率较高15.2%，跟临床常规PCR仪器不兼容，需另外购置设备。更重要的是该检测过程中需反复开盖加入试剂，易污染检测环境，导致后续检测结果出现假阳性。
基于以上几点考虑，本发明给出了一种基于PCR方法的PCA3/PSA尿液检测试剂盒，操作流程简便，耗时短，质控方法简便、结果重复性好，复检率低，模板加入后PCR反应全程闭管，避免了污染导致的假阳性现象。且使用该试剂盒用于前列腺癌预示诊断、疗效评估、复发监控准确性好，与临床评价指标符合率高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供前列腺癌尿液检测试剂盒，本发明的目的之二在于提供前列腺癌尿液检测试剂盒的应用。
为实现上述发明目的，提供如下技术方案：
前列腺癌尿液检测试剂盒，所述试剂盒含有一步法RT-PCR扩增试剂，所述一步法RT-PCR扩增试剂含有检测PCA3和PSA的特异引物和探针，检测PCA3的特异引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.5所示；检测PSA的特异引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述一步法RT-PCR扩增试剂还包括10×Buffer，2.5Mm dNTP，25Mm MgCl2，DMSO分析纯；100mMDTT；UDG，逆转录酶和RNA酶抑制剂和水。各组分的用量为10×Buffer2～10μL，2.5Mm dNTP5～8μL，25Mm MgCl21～5μL，DMSO分析纯1～6μL；100mMDTT1～4μL，Roche HS TAQ（货号12032953001），0.1～1μL；UDG（购自NEB，货号EN0362），0.1～1μL；0.1～1.5μL逆转录酶和0.1～2μL RNA酶抑制剂（使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622）；引物混合物1～5μL（10μm），探针（10μm）0.5-2.5μL灭菌纯化水补足50μL，更优选的，10×Buffer5μL，2.5Mm dNTP7μL，25Mm MgCl24μL，引物混合物（10μm）2.5μL，探针（10μm）1.25μL，DMSO分析纯5μL；100mMDTT2.5μLRoche HS TAQ（货号12032953001），0.5μL；UDG（购自NEB，货号EN0362），0.25μL；0.25μL逆转录酶和0.3μLRNA酶抑制剂（其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622），灭菌纯化水16.5μL。
一步法RT-PCR扩增条件为：37～42℃，2-5分钟；50～60℃，15～30分钟；94～95℃，10～30秒，60～65℃，10～30秒，40～50个循环，最后50度冷却30秒，最优的是37℃，5分钟；50℃，15分钟；扩增94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，50度，30秒冷却。
优选的，所述试剂盒还包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、标准品、阳性质控品和阴性质控品。
更优选的，所述样本运输保存液的组分如下，质量分数1%～5%十二烷基硫酸锂，10～20mMNaH2PO4，10～20mM Na2HPO4，0.5～2mM乙二胺四乙酸和0.5～2mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸。最优的是质量分数为3%十二烷基硫酸锂，15mM NaH2PO4，15mM Na2HPO4，1mM乙二胺四乙酸（EDTA），1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），pH6.7；使用时样本运输保存液和直肠指检（DRE）后的尿液样本体积比可以是1：1；1：2；1:3；1:4；1:5；2:1；3:1；4:1；5:1，最优的是1:2。
更优选的，所述磁珠法提取试剂包括捕获液和洗液，所述捕获液的组分如下：所述磁珠法提取试剂包括捕获液和洗液，所述捕获液的组分如下：100～400mM HEPES，0.5～3M LiCl，100～500mM LiOH，50～150mM EDTA和50～400μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠，所述洗液的组分如下：5～20mM HEPES，100～200mM NaCl，4～10mM NaOH，0.5～2mMEDTA，0.1～0.5%(v/v)乙醇，0.01～0.02%（w/v）对羟基苯甲酸甲酯，0.01～0.05%(w/v)尼泊金丙酯，和0.05～0.3%（w/v）月桂醇硫酸酯钠盐。最优的，捕获液的组分如下：浓度为250mM HEPES，1.88M LiCl，310mM LiOH，100mM EDTA，pH6.4和250μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠；洗液的组分如下：10mM HEPES，150mM NaCl，6.5mM NaOH，1mM EDTA，0.3%(v/v)乙醇，0.02%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯，0.01%(w/v)尼泊金丙酯，and0.1%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐，pH7.5。
磁珠法提取样本RNA：100μL～1000μL经样本运输保存液处理的尿液样本，加入1～5倍体积或1/2～1/5倍体积的捕获液，涡旋混匀1-5分钟，42～75℃反应10～60分钟，将反应液置于磁场中静置2～10分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入200μL～2mL洗液，涡旋10-60秒后置于磁场中静置2～10分钟，吸弃液体，加入10～100μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置2～10分钟，将液体转移至新的EP管中，稀释0～5倍后取5μL检测。优选的，200μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入400μL捕获液，涡旋混匀1分钟，60℃反应30分钟，将反应液置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入500μL洗液，涡旋20秒后置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，加入50μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置2分钟，将液体转移至新的EP管中，稀释5倍后取5μL检测。
优选的，所述标准品为含PCA3和PSA基因片段的重组质粒。
优选的，所述阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA。
更优选的，所述阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
2.所述前列腺癌尿液检测试剂盒在评估前列腺癌患病风险、治疗效果和复发监控中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了基于一步PCR方法的PCA3/PSA尿液检测试剂盒，该试剂盒操作流程简便，耗时短，质控方法简便、结果判读简单，重复性好，复检率低，模板加入后PCR反应全程闭管，避免了污染导致的假阳性现象。且使用该试剂盒用于前列腺癌预示诊断、疗效评估、复发监控准确性好，与临床评价指标符合率高。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测散点图。
图2为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测ROC曲线。
图3为前列腺癌尿液检测试剂盒上限检测散点图。
图4为前列腺癌尿液检测试剂盒下限检测ROC曲线。
图5为PCA3标准曲线。
图6为PSA标准曲线。
图7为前列腺癌尿液检测试剂盒检测散点图。
图8为前列腺癌尿液检测试剂盒检测ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1试剂盒检测试剂、检测条件下限检测能力
1.前列腺癌尿液检测试剂盒：包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、一步法RT-PCR扩增试剂、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
样本运输保存液：成分为质量分数为1%十二烷基硫酸锂，10mM NaH2PO4，10mMNa2HPO4，0.5mM乙二胺四乙酸（EDTA），0.5mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），pH6.7；
磁珠法提取试剂：
（1）捕获液：浓度为100mM HEPES，0.5M LiCl，100mM LiOH，50mM EDTA和50μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠（0.7～1.05μMparticles,Sera-MagTM），pH6.4；
（2）洗液：5mM HEPES，100mM NaCl，4mM NaOH，0.5mM EDTA，0.1%(v/v)乙醇，0.01%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯，0.01%(w/v)尼泊金丙酯和0.05%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐，pH7.5。
磁珠法提取样本RNA：100μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入20μL捕获液，涡旋混匀1分钟，42℃反应10分钟，将反应液置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入200μL洗液，涡旋10秒后置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，加入10μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置2分钟，将液体转移至新的EP管中，取5μL检测。
一步法RT-PCR扩增试剂，包括2μL10×Buffer，5μL2.5Mm dNTP，1μL25Mm MgCl2，1μL PCA3和PSA引物混合物（引物浓度分别为10μm，具体序列如下：PCA3上游引物5’-ccaggaagatctgcatggtggg-3’（SEQ ID NO.1）；PCA3下游引物5’-gatgacccaagatggcggc-3’（SEQID NO.2）；PSA上游引物5’-cctgctcgggtgattctg-3’（SEQ ID NO.3）；PSA下游引物5’-gccacgatggtgtccttgat-3’（SEQ ID NO.4）），0.5μL浓度为10μm的探针混合物（PCA3探针：5’-gcacagagatccctgggagaaatgcc-3’（SEQ ID NO.5）；PSA探针：5’-gggcccacttgtctgtaatggtgtgc-3’（SEQ ID NO.6），DMSO分析纯1μL；100mMDTT，1μL；0.1μLRoche HS TAQ（货号12032953001），0.1μL UDG（购自NEB公司，货号EN0362）；0.1μL逆转录酶和0.1μL RNA酶抑制剂（其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622），灭菌纯化水34.3μL。
一步法RT-PCR反应条件：37℃，5分钟；50℃，15分钟；94℃，5分钟；扩增94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒。
标准品：以前列腺癌细胞株LNcap 1μg总RNA逆转录后的cDNA为模板，分别以SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10为引物进行PCR扩增，分别获得670bp的PCA3和589bp的PSA，然后将PCR产物装入T载体（使用Thermo Scientific InsTAclone PCRCloning Kit，货号k1213），测序验证后得到PCA3/PSA重组质粒。
质控品：阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA；阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA。
结果判读：患者的PCA3score为尿液样本中PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000，即
PCA 3 Score = PCA 3 mRNAcoples PSAmRNAcoples × 1000
2.应用本实施例中的检测试剂盒和检测方法，检测来自北京协和医院泌尿科（99例）和上海中山医院泌尿科（45例）的直肠指检后尿液样本，结果如图1所示。检测显示，共有前列腺癌样本60例（北京协和医院泌尿科43例，上海中山医院泌尿科17例），前列腺良性病变84例（北京协和医院泌尿科56例，上海中山医院泌尿科28例），与穿刺活检结果一致，然后将检测的PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000计算每例患者PCA3评分，并经ROC曲线分析（图2）。分析结果显示，曲线下面积0.65，cutoff值取38.3045时，诊断灵敏度60.9%，特异性60.9%。
实施例2试剂盒检测试剂、检测条件上限检测能力
1.前列腺癌尿液检测试剂盒：包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、一步法RT-PCR扩增试剂、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
样本运输保存液：成分为质量分数为5%十二烷基硫酸锂，20mM NaH2PO4，20mM Na2HPO4，2mM乙二胺四乙酸（EDTA），2mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），pH6.7；
磁珠法提取试剂：
（1）捕获液：浓度为400mM HEPES，3M LiCl，500mM LiOH，150mM EDTA和400μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠（0.7～1.05μMparticles,Sera-MagTM)，pH6.4；
（2）洗液：20mM HEPES，200mM NaCl，10mM NaOH，2mM EDTA，0.5%(v/v)乙醇，0.02%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯，0.05%(w/v)尼泊金丙酯和0.3%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐，pH7.5。
磁珠法提取样本RNA：1000μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入5000μL捕获液，涡旋混匀5分钟，75℃反应60分钟，将反应液置于磁场中静置10分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入2000μL洗液，涡旋60秒后置于磁场中静置10分钟，吸弃液体，加入100μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置10分钟，将液体转移至新的EP管中，稀释5倍后取5μL检测。
一步法RT-PCR扩增试剂，包括10μL10×Buffer，8μL2.5Mm dNTP，5μL25Mm MgCl2，5μL PCA3和PSA引物混合物（引物浓度分别为10μm，具体序列如下：PCA3上游引物5’-ccaggaagatctgcatggtggg-3’（SEQ ID NO.1）；PCA3下游引物5’-gatgacccaagatggcggc-3’（SEQID NO.2）；PSA上游引物5’-cctgctcgggtgattctg-3’（SEQ ID NO.3）；PSA下游引物5’-gccacgatggtgtccttgat-3’（SEQ ID NO.4）），5μL浓度为10μm的探针（PCA3探针：5’-gcacagagatccctgggagaaatgcc-3’（SEQ ID NO.5）；PSA探针：5’-gggcccacttgtctgtaatggtgtgc-3’（SEQ ID NO.6），DMSO分析纯6μL；100mMDTT4μL；1μL Roche HS TAQ（货号12032953001），1μL UDG（购自NEB公司，货号EN0362）；1.5μL逆转录酶和2μL RNA酶抑制剂（其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622），灭菌纯化水0μL。
一步法RT-PCR反应条件：37℃，5分钟；50℃，15分钟；94℃，5分钟；扩增94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒。
标准品：以前列腺癌细胞株LNcap1μg总RNA逆转录后的cDNA为模板，分别以SEQ IDNO.7与SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10为引物进行PCR扩增，分别获得670bp的PCA3和589bp的PSA，然后将PCR产物装入T载体（使用Thermo Scientific InsTAclone PCRCloning Kit，货号k1213），测序验证后得到PCA3/PSA重组质粒。
质控品：阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA；阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA。
结果判读：患者的PCA3score为尿液样本中PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000，即
PCA 3 Score = PCA 3 mRNAcoples PSAmRNAcoples × 1000
2.应用本实施例中的检测试剂盒和检测方法，检测来自北京协和医院泌尿科（99例）和上海中山医院泌尿科（45例）的直肠指检后尿液样本，结果如图3所示。检测显示，共有前列腺癌样本60例（北京协和医院泌尿科43例，上海中山医院泌尿科17例），前列腺良性病变84例（北京协和医院泌尿科56例，上海中山医院泌尿科28例），与穿刺活检结果一致，然后将检测的PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000计算每例患者PCA3评分，并经ROC曲线分析（图4）。分析结果显示，曲线下面积0.623，cutoff值取37.9374时，诊断灵敏度60.9%，特异性56.5%。
实施例3
1.前列腺癌尿液检测试剂盒：包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、一步法RT-PCR扩增试剂、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
样本运输保存液：成分为质量分数为3%十二烷基硫酸锂，15mM NaH2PO4，15mMNa2HPO4，1mM乙二胺四乙酸（EDTA），1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），pH6.7；
磁珠法提取试剂：
（1）捕获液：浓度为250mM HEPES，1.88M LiCl，310mM LiOH，100mM EDTA和250μg/mL超顺磁性的共价结合(dT)14的磁珠（0.7～1.05μMparticles，Sera-MagTM），pH6.4；
（2）洗液：10mM HEPES，150mM NaCl，6.5mM NaOH，1mM EDTA，0.3%(v/v)乙醇，0.02%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯，0.01%(w/v)尼泊金丙酯和0.1%(w/v)月桂醇硫酸酯钠盐，pH7.5。
磁珠法提取样本RNA：200μL经样本运输保存液处理的尿液样本加入400μL捕获液，涡旋混匀1分钟，60℃反应30分钟，将反应液置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入500μL洗液，涡旋20秒后置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，加入50μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置2分钟，将液体转移至新的EP管中，稀释5倍后取5μL检测。
一步法RT-PCR扩增试剂，包括5μL10×Buffer，7μL2.5Mm dNTP，4μL25Mm MgCl2，2.5μL PCA3和PSA引物混合物（引物浓度分别为10μm，具体序列如下：PCA3上游引物5’-ccaggaagatctgcatggtggg-3’（SEQ ID NO.1）；PCA3下游引物5’-gatgacccaagatggcggc-3’（SEQ ID NO.2）；PSA上游引物5’-cctgctcgggtgattctg-3’（SEQ ID NO.3）；PSA下游引物5’-gccacgatggtgtccttgat-3’（SEQ ID NO.4）），1.25μL浓度为10μm的探针（PCA3探针：5’-gcacagagatccctgggagaaatgcc-3’（SEQ ID NO.5）；PSA探针：5’-gggcccacttgtctgtaatggtgtgc-3’（SEQ ID NO.6），DMSO分析纯5μL；100mMDTT2.5μL（Roche HS TAQ，货号12032953001），0.5μL UDG（购自NEB公司，货号EN0362）；0.25μL逆转录酶和0.3μL RNA酶抑制剂（其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622），灭菌纯化水16.5μL。
一步法RT-PCR条件：37℃，5分钟；50℃，15分钟；扩增94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒。
标准品：以前列腺癌细胞株LNcap1μg总RNA逆转录后的cDNA为模板，分别以SEQID NO.7与SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.10为引物进行PCR扩增，分别获得670bp的PCA3和589bp的PSA，然后将PCR产物装入T载体（使用Thermo ScientificInsTAclone PCR Cloning Kit，货号k1213），测序验证后得到PCA3/PSA重组质粒。提取重组质粒，并将浓度调至100ng/μL，换算为copy/mL，具体如表1所示。
表1.标准品浓度
编号 PCA3（copy/ml） PSA（copy/ml）
Std1 105 106
Std2 104 105
Std3 103 104
Std4 102 103
阳性质控品：为前列腺癌细胞株LNcap（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA，取5μL检测，参考值以PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000计算，其范围为56.4～60.3。
阴性质控品：为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1（购自上海细胞所）1μg总RNA逆转录后的cDNA，参考值以PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000计算，其范围为18.5～22.6。
2.试剂盒检测方法：
取样本运输保存液与直肠指检（DRE）后的尿液样本按照1：2体积比进行混合后为处理后的尿液样本，-20度可保存11个月，最多反复冻融5次；然后向200μL经样本运输保存液处理的尿液样本中加入400μL捕获液，涡旋混匀1分钟，60℃反应30分钟，将反应液置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，然后向含磁珠的EP管中加入500μL洗液，涡旋20秒后置于磁场中静置2分钟，吸弃液体，加入50μL的无RNase的水溶解RNA，在磁场中静置2分钟，将液体转移至新的EP管中，稀释5倍后取5μL检测。
PCA3标准曲线：以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，以PCA3标准品按表3稀释后的溶液为模板，以实施例1中的热循环条件进行扩增，然后根据扩增曲线的Ct值绘制标准曲线，如图5所示。结果表明PCA3扩增效率为90.1%，扩增曲线斜率为-3.584。
PSA标准曲线：以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，以PSA标准品按表3稀释后的溶液为模板，以实施例1中的热循环条件进行扩增，然后根据扩增曲线的Ct值绘制标准曲线，如图6所示，结果表明PSA扩增效率为103.9%，扩增曲线斜率为-3.231。
结果判读：患者的PCA3score为尿液样本中PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000，即
PCA 3 Score = PCA 3 mRNAcoples PSAmRNAcoples × 1000
应用本实施例中的试剂盒和检测方法，检验检测的重复性。重复检测PCA3Score三个临床样本10次，结果如表2所示，样本收集自北京协和医院：
表2.试剂盒重复性检验结果
重复次数 PCA3Score PCA3Score PCA3Score
1 112 56 15
2 113 55 16
3 114 54 17
4 111 57 18
5 110 58 14
6 109 53 15
7 115 59 16
8 108 54 17
9 114 56 18
10 111 57 14
平均值 111.7 55.9 16
标准差 2.311805451 1.91195072 1.490711985
CV% 0.020696557 0.034203054 0.093169499
由上述结果可知，本发明建立的检测试剂盒和检测方法具有较好的重复性。
临床样本复检率：从北京协和医院泌尿科取43例前列腺癌患者尿液，56例前列腺良性病变患者尿液，从上海中山医院泌尿科取17例前列腺癌患者尿液，28例前列腺良性病变患者尿液，共144例样本，检测后只有2例样本进行了复检，而2例复检样本的PCA3浓度低于PCA3线性范围下限，其原因可能是尿液样本收集操作不规范，尿液样本中DRE后前列腺液未进入尿液中，安排重复收集样本，检测结果在PCA3/PSA线性范围内。因此使用本发明的试剂盒的复检率为1.4%，远低于Gen-probe产品复检率15.2%，差异有统计学意义，P<0.01。
实施例4
应用实施例3中的检测试剂盒和检测方法，检测来自北京协和医院泌尿科（99例）和上海中山医院泌尿科（45例）的直肠指检后尿液样本，结果如图7所示。检测显示，共有前列腺癌样本60例（北京协和医院泌尿科43例，上海中山医院泌尿科17例），前列腺良性病变84例（北京协和医院泌尿科56例，上海中山医院泌尿科28例），与穿刺活检结果一致，然后将检测的PCA3浓度比上PSA浓度乘以1000计算每例患者PCA3评分，并经ROC曲线分析（图8）。分析结果显示，曲线下面积0.807，cutoff值取36.99时，诊断灵敏度72.5%，特异性78.3%。
（1）评估前列腺癌患病风险
应用上述给出的PCA3评分cutoff值，双盲评估60例患者前列腺癌患病风险，样本收集自北京协和医院泌尿科，四格表卡方检验见表3。
表3.四格表卡方检验结果
χ2检验P<0.01，因此两种检测方法相关性较好；KAPPA值为89.8%，表明两种检测方法具有较好的一致性。并且诊断灵敏度92.3%（24/26），特异性97%（33/34），阳性预测值96%（24/25），阴性预测值94.3%（33/35），误诊率（假阳性率）2.9%（1/34），漏诊率（假阴性率）7.7%（2/26），可满足临床检验要求。
（2）评估前列腺癌患者治疗效果
治疗前检测10例上海中山医院前列腺癌患者PCA3score，疗程结束后再检测PCA3score，然后判断治疗效果。判定根据计算公式P=治疗后PCA3score/PCA3score，P≥1判断为治疗无效；0.6＜P＜1判断为病情改善；P≤0.6判断为治疗效果显著，其判定结果如表4所示，同时进行临床评价，结果如表4所示。其判定结果与临床判断结果对比，符合率达90%。
表4.前列腺癌患者治疗效果评估结果
患者编号 治疗前后浓度比值 临床评价
01 2.234 无效
02 0.128 疗效显著
03 0.609 无效
04 0.633 改善
05 1.833 无效
06 3.368 无效
07 1.675 无效
08 0.221 疗效显著
09 0.814 改善
10 1.998 无效
由表4可知，检前列腺癌患者治疗效果测结果与临床判断结果对比，符合率达90%。
（3）对前列腺癌患者进行复发监控
对6例上海中山医院早期前列腺癌患者化疗疗程结束后PCA3score，然后对患者进行跟踪随访，治疗后六周首次检测PCA3score，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，检测四次。然后计算跟踪随访PCA3score与化疗后PCA3score比值P，P>1判断为转移复发，P≤1判断为无进展生存，其结果如表5所示。同时对患者进行临床评价，结果如表5所示。
表5.对前列腺癌患者复发监控结果
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价
01 0.834 0.973 1.031 1.467 转移复发
02 0.148 0.219 0.235 0.369 无进展生存
03 0.023 0.085 0.113 0.416 无进展生存
04 1.313 1.564 1.912 1.541 无进展生存
05 0.684 1.461 1.498 1.694 转移复发
06 0.084 0.144 0.545 0.494 无进展生存
由表5可知，通过PCA3score变化计算其P值，可早于临床症状和体征发现前列腺癌患者复发转移，医生可提前进行干预。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有一步法RT-PCR扩增试剂，所述一步法RT-PCR扩增试剂含有检测PCA3和PSA的特异引物和探针，检测PCA3的特异引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.5所示；检测PSA的特异引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述一步法RT-PCR扩增试剂还包括10×Buffer，2.5mM dNTP，25mM MgCl2，DMSO；100mM DTT；UDG，逆转录酶和RNA酶抑制剂和水。
3.根据权利要求1或2所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样本运输保存液、磁珠法提取试剂、标准品、阳性质控品和阴性质控品。
4.根据权利要求3所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述样本运输保存液的组分如下，质量分数1%~5%十二烷基硫酸锂，10~20 mM NaH2PO4，10~20 mM Na2HPO4，0.5~2 mM乙二胺四乙酸和0.5~2mM 乙二醇二乙醚二胺四乙酸。
5.根据权利要求3所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述磁珠法提取试剂包括捕获液和洗液，所述捕获液的组分如下：100~400 mM HEPES，0.5~3 M LiCl，100~500 mM LiOH，50~150mM EDTA和50~400 μg/mL超顺磁性的共价结合 (dT)14的磁珠，所述洗液的组分如下：5~20 mM HEPES，100~200 mM NaCl，4~10mM NaOH，0.5~2 mM EDTA，0.1~0.5% (v/v) 乙醇，0.01~0.02%（w/v）对羟基苯甲酸甲酯，0.01~0.05% (w/v) 尼泊金丙酯，和0.05~0.3%（w/v）月桂醇硫酸酯钠盐。
6.根据权利要求3所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述标准品为含PCA3和PSA基因的重组质粒。
7.根据权利要求3所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为前列腺癌细胞株LNcap总RNA逆转录后的cDNA。
8.根据权利要求3所述的前列腺癌尿液检测试剂盒，其特征在于：所述阴性质控品为正常前列腺上皮细胞株RWPE-1总RNA逆转录后的cDNA。
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