CN103966352B - Pca3、cst1和cst4在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 - Google Patents

Pca3、cst1和cst4在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PCA3、CST1和CST4在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒，将PCA3、CST1和CST4联合用于诊断和预示前列腺癌的特异性和灵敏度高于仅使用PCA3作为标志物；本发明还公开了联合检测上述标志物的试剂盒，其试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，能够用于前列腺癌诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，为医生提前进行干预提供了指导。

Description

PCA3、CST1和CST4在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒
技术领域
本发明属于诊断领域，具体涉及PCA3、CST1和CST4在制备前列腺癌标志物中的应用，还涉及相应的诊断试剂盒。
背景技术
前列腺癌发病率在西方国家位于男性恶性肿瘤首位，其死亡率居各种癌症的第二位，仅次于肺癌。近年来，我国前列腺癌发病率呈现逐年上升的趋势。目前前列腺癌诊断及随访主要采取尿细胞学检查与前列腺镜检相结合的方法，不仅费用昂贵，同时为患者带来较大的痛苦，而且存在感染、出血的风险。采用PSA及DRE等检测手段均难以有效地从良性病变中区分出前列腺癌患者，导致过度前列腺穿刺活检，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。
PSA(Prostate Specific Antigen)为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。
近年来发现的前列腺癌新的标记物PCA3(Prostate cancer antigen3)，在前列腺癌中高表达，可反应前列腺癌进展情况。PCA3位于9号染色体，含有4个外显子，为非编码的mRNA，通过选择性剪切和多聚腺苷酸化产生至少四种不同的转录产物。RT-PCR分析显示PCA3仅在前列腺组织中表达，在其他组织中不表达。Northern blot检测分析50例患者中47例PCA3高表达，而前列腺良性病变组织中不表达或低度表达[Cancer Reserch，1999，Dec，1；59(23)：5975-9]。文献[cancer res.，2002，May1；62(9)：2695-8]报道比较端粒酶RNA和PCA3RNA作为前列腺癌的标记物，PCA3指示作用更优。PCA3为到目前为止针对前列腺癌特异性最优的标志物，含有4个外显子，三个内含子，Gandini et al2003等文献报道，与其它外显子相比，PCA3外显子4用于前列腺癌检测特异性最优。但PCA3在尿样中测量有效率仅80％，因此，急需提高PCA3在尿样中检测的有效率。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin SN和Cystatin S)是人类Cystatin家族成员，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道，CST1/4在胃肠肿瘤组织中的表达量高于正常组织，临床资料分析表明，CST1和CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(TNM分析)相关；生存分析表明，CST1和CST4表达阳性患者的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CST1和CST4是一个独立预后因子；从而提示CST1和CST4可能在胃肠肿瘤的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，CST1和CST4可用于前列腺癌的诊断预示、疗效评估、转移复发监控未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供PCA3、CST1和CST4在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，通过PCA3、CST1和CST4联合检测，提高诊断和预示前列腺癌的特异性；本发明的目的之二在于提供PCA3、CST1和CST4联合检测前列腺癌的试剂盒，该试剂盒具有特异性高，使用方便等优点。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、PCA3、CST1和CST4在制备诊断和预示前列腺癌标志物中的联合应用，所述PCA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CST1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，PCA3、CST1和CST4联合应用的判断公式为P＝exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)/[1+exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)]，其中a＝PCA3得分，b＝CST1得分，c＝CST4得分，PCA3得分＝(PCA3拷贝数/PSA拷贝数)×1000；CST1得分＝(CST1拷贝数/PSA拷贝数)×1000；CST4得分＝(CST4拷贝数/PSA拷贝数)×1000。
更优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2、PCA3、CST1、和CST4联合检测前列腺癌的试剂盒，包括PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA的定量检测试剂；所述PCA3mRNA定量检测试剂包括SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的TaqMAN探针；所述CST1mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的TaqMAN探针；所述CST4mRNA定量检测试剂包括如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括PSA mRNA定量检测试剂，所述PSA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括特异捕获PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSAmRNA mRNA的磁珠，所述特异捕获PCA3mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.5所示的探针，所述特异捕获CST1mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.6所示的探针，所述特异捕获CST4mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.7所示的探针，所述特异捕获PSA mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.8所示的探针。
更优选的，靶序列捕获液中磁珠的浓度为500μg/mL，特异捕获探针的浓度为2μM。
更优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
本发明的有益效果在于：本发明公开了诊断和预示前列腺癌的新标志物，即PCA3、CST1和CST4基因，利用三个标志物联合检测的特异性和灵敏度高于使用其中现有的PCA3标志物；本发明还公开了诊断和预示前列腺癌标志物的试剂盒，该试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，其诊断结果与临床诊断结果一致，在监控过程中还可以及早发现转移复发情况，为医生提前进行干预提供了指导。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为磁珠法从尿液中特异性富集mRNA原理图。
图2为特异性探针和非特异性探针从尿液富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA比较结果(A：CST1；B：CST4；C：PSA；D：PCA3)。
图3为特异性探针和非特异性探针从直肠指检后尿液富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA比较结果富集(A：CST1；B：CST4；C：PSA；D：PCA3)。
图4为特异性探针和非特异性探针从精液PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA比较结果(A：CST1；B：CST4；C：PSA；D：PCA3)。
图5为前列腺癌组织与癌旁组织CST1相对表达量的比值结果图。
图6为前列腺癌组织与癌旁组织CST4相对表达量的比值结果图。
图7为PCA3绝对定量标准曲线。
图8为CST1绝对定量标准曲线。
图9为CST4绝对定量标准曲线。
图10为受试者PCA3基因、CST1基因和CST4基因联合检测ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，优选实施例中所述百分比均为质量百分比。
实施例1、磁珠法从尿液中特异性富集PCA3、CST1、CST4和PSA基因的mRNA
根据PCA3、CST1、CST4和PSA的mRNA序列设计捕获PCA3、CST1、CST4和SDHA基因的mRNA的特异探针(PCA3mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CST1mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，PSA mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4)，具体如下：捕获PCA3mRNA的探针为5’-atctgttttcctgcccatcctttaagttta(dA)30-3’(SEQ ID NO.5)，捕获CST1mRNA的探针为5’-aaagagcacaactgtttcttctgca(dA)30-3’(SEQ ID NO.6)，捕获CST4mRNA的探针为5’-taccaggtctattagaagca(dA)30-3’(SEQ ID NO.7)，捕获内参基因PSA mRNA的探针为5’cgaacttgcgcacacacgtcattggattta(dA)30-3’(SEQ ID NO.8)，上述特异探针能够与磁珠(GE，货号为3815-2103-010150)的olig(dT)互补结合，得结合特异探针的磁珠。
从江苏省肿瘤医院前列腺癌尿液样本10例、直肠指检后尿液10例、精液10例，然后分别富集PCA3、CST1、CST4和PSA基因的mRNA，具体步骤如下：将新鲜体液与样本运输保存液按照体积比为2：1的比例混合，得处理后的体液样本，该处理后的体液样本4℃条件下可保存一周，-20℃条件下可保存1年；然后分别将200μL含有磁珠的靶序列捕获液加入到200μL处理后的体液中，于75℃条件下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后将样品置于磁性分离器上，5分钟后，吸弃上清，加入1mL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离器，5分钟后，吸弃上清；最后室温(18～25℃)静置5分钟，加入洗脱液20μL，枪头吹打混匀，上磁力架5分钟，将上清转移至新的EP管中，富集原理如图1所示。
富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下：110mM LiDS(十二烷基硫酸锂)，10mM NaH2PO4，10mM Na2HPO4，5mM EDTA，7mM EGTA，pH7.5；靶序列捕获液中各组分浓度如下：135mM HEPES，1.25M LiCl，110mM LiOH，10mM EDTA，pH7.0，500μg/mL磁珠，2μM捕获探针；漂洗液中各组分浓度如下：100mM HEPES，350mM NaCl，10mM NaOH，2mM EDTA，3％乙醇，0.2％羟基甲酯，0.1％羟基丙酯，0.1％SDS，pH7.5；洗脱液中各组分浓度如下：20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA。
同时以非特异性探针oligo(dT)按上述相同的方法非特异性富集mRNA。
将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA的相对含量，检测所使用的引物如下：
PCA3mRNA检测引物：上游引物：5’-ccaggaagatctgcatggtggg-3’(SEQ ID NO.9)；
                      下游引物：5’-gatgacccaagatggcggc-3’(SEQ ID NO.10)；
CST1mRNA检测引物：上游引物：5’-agagccaggcaacagacc-3’(SEQ ID NO.11)；
                      下游引物：5’-gttcatggaaggcacagg-3’(SEQ ID NO.12)；
CST4mRNA检测引物：上游引物：5’-atgaacagccagaactgca-3’(SEQ ID NO.13)；
                     下游引物：5’-caagaaggaaggagggag-3’(SEQ ID NO.14)；
PSA mRNA检测引物：上游引物：5’-cctgctcgggtgattctg-3’(SEQ ID NO.15)；
                   下游引物：5’-gccacgatggtgtccttgat-3’(SEQ ID NO.16)；
然后构建如下检测体系：SYBR Green2×Mix10μL(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司)，终浓度分别为250nM的上游引物和下游引物，模板2μL，加ddH2O将体积补充至20μL。
并按如下条件检测：先预变性5分钟，然后在95℃变性10秒、60℃退火15秒、72℃延伸20秒，进行45个循环；最后熔解：95℃，1分钟；40℃，1分钟；65℃，1秒；95℃，1分钟，冷却50℃，30sec。
同时以oligo(dT)非特异性富集的mRNA为对照，检测引物、体系和检测条件按上述方法进行，然后比较特异探针和非特异探针富集PCA3、CST1、CST4和PSA基因mRNA分别在尿液、直肠指检后尿液、精液中的CP值(Cross Point)，结果如图2-4所示，其统计结果如表1～4所示。
表1、CST1mRNA使用特异探针和非特异探针的CP值
表2、CST4mRNA使用特异探针和非特异探针的CP值
表3、PCA3mRNA使用特异探针和非特异探针的CP值
表4、PSA mRNA使用特异探针和非特异探针的CP值
由图2-4和表1-4可知，使用特异探针从尿液、直肠指检后的尿液、精液中富集到的PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA的CP值更小，表明其富集的浓度更高，具有背景低，信噪比高的特点，优于使用非特异探针富集的mRNA。
实施例2、检测CST1和CST4在前列腺癌组织中表达情况
从上海第五人民医院泌尿外科收集前列腺癌、癌旁配对组织样本30例，切至米粒大小，放至RNAlater保存液中-80℃贮存，使用前平衡至室温。然后按照实施例1的方法分别富集前列腺癌和癌旁配对组织的CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA，再分别以CST1检测引物、CST4检测引物和内参基因PSA检测引物检测30例样本前列腺癌和癌旁配对组织中CST1基因和CST4基因相对表达量，检测体系和检测条件与实施例1相同。检测结果采用2-ΔΔCP法计算相对表达量，然后统计前列腺癌与癌旁配对组织相对表达量的比值(C/N)，统计结果如图5和图6所示。由图5和图6可知，CST1基因和CST4基因在前列腺癌组织中明显上调，明显高于癌旁组织的表达量，上述结果预示检测CST1和CST4的表达量可以用于诊断前列腺癌。
实施例3、构建前列腺癌检测试剂盒
1、构建PCA3重组质粒
以前列腺癌细胞株LNcap为材料提取前列腺癌细胞株LNcap总mRNA，然后以提取的mRNA为模板合成cDNA，并根据PCA3基因序列设计构建PCA3重组质粒的引物，上游引物为5’-gccgagggagaccaggaagat-3’(SEQ ID NO.17)，下游引物为5’-ggcccagaaggaaccgtagag-3’(SEQ ID NO.17)，以SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建PCA3重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将PCA3重组质粒用甘油保种，作为检测PCA3基因的标准品。
2、构建CST1重组质粒
以前列腺癌细胞株LNcap为材料提取前列腺癌细胞株T24总mRNA，然后以提取的mRNA为模板合成cDNA，并根据CST1基因序列设计构建CST1重组质粒的引物，上游引物为5’-ctggagccccaaggagga-3’(SEQ ID NO.20)，下游引物为5’-accagtccaggggtggga-3’(SEQID NO.21)，以SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST1重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST1重组质粒用甘油保种，作为检测CST1基因的标准品。
3、构建CST4重组质粒
根据CST4基因序列设计构建CST4重组质粒的引物，上游引物为5’-tctgaggagaccatggcc-3’(SEQ ID NO.23)，下游引物为5’-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’(SEQ ID NO.24)，然后以SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24的核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST4重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST4重组质粒用甘油保种，作为CST4基因的标准品。
分别将PCA3重组质粒、CST1重组质粒和CST4重组质粒，通过双酶切(EcoRⅠ、BamHⅠ)线性化目标序列，割胶回收得到纯的线性化片段。使用体外转录试剂盒，以线性化的序列为模板，在T7RNA聚合酶的作用下，制备得到RNA，经RNA纯化试剂盒纯化后，得到RNA标准品贮液，测定浓度。经Agilent2100作RNA完整性分析，电泳图谱显示除目标序列外无其他明显的杂带及RNA降解带，则可以作为RNA标准品贮液，以备下游使用。
实施例4、绘制PCA3、CST1和CST4的标准曲线
将实施例3获得的PCA3、CST1和CST4mRNA标准品分别作如表5的梯度稀释，具体如下：
表5、mRNA标准品稀释梯度
标准品编号 浓度(copy/μL)
STD1 100000
STD2 10000
STD3 1000
STD4 100
设计定量检测PCA3基因、CST1基因和CST4基因的引物和探针，具体如下：
PCA3定量检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，扩增子序列如SEQ ID NO.26所示，探针为FAM-5’-gcacagagatccctgggagaaatgcc-3’-TAMRA(SEQ ID NO.27)；
CST1定量检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，扩增子序列如SEQ IDNO.28所示，探针为：FAM-5’-tacttcttcgacgtagaggtgggcc-3’-TAMRA(SEQ ID NO.29)；
CST4定量检测引物如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，扩增子序列如SEQ IDNO.30所示，探针为FAM-5’-aacagttgtgctctttcgagatcta-3’-TAMRA(SEQ ID NO.31)。
PSA定量检测引物如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，扩增子序列如SEQ IDNO.32所示，探针为FAM-5’-caacagaagaagccctttgagg-3’-TAMRA(SEQ ID NO.33)。
然后采用一步法RT-PCR分别检测表5中PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA的浓度，检测体系为2μL10×Buffer，3μL2.5mM dNTP，2μL25mM MgCl2，0.75μL的浓度为10μm的上、下游引物，0.5μL浓度为10μm的Taqman探针，DMSO分析纯1μL；10mMDTT1μL；0.1μLRoche HS TAQ(货号12032953001)，0.1μL UDG(购自NEB公司，货号EN0362)；0.1μL逆转录酶和0.1μL RNA酶抑制剂(其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622)，灭菌纯化水8.6μL，反应条件为：37℃，5分钟；50℃，15分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒，然后根据检测结果绘制标准曲线，结果如图7～9所示。
实施例5、CST1或/和CST4基因检测的特异性和灵敏度
从北京协和医院泌尿科收集尿液样本100例，其中前列腺癌患者尿液50例，前列腺炎症等良性病变患者尿液50例。按照实施例1的方法分别富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA，然后按实施例4的一步扩增法对富集PSA mRNA的样本进行检测，以PSA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于结果分析。分析结果显示100例样本中其中可用样本97例，前列腺癌49例，良性病变48例。再继续用实施例4的一步扩增法检测97例可用样本的PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA含量，其检测方法与实施例4相同。分析绝对定量结果，根据检测结果计算PCA3得分、CST1得分和CST4得分，其中PCA3得分＝(PCA3拷贝数/PSA拷贝数)×1000；CST1得分＝(CST1拷贝数/PSA拷贝数)×1000；CST4得分＝(CST4拷贝数/PSA拷贝数)×1000。将检测结果进行Logistic回归统计分析，得出联合检测的判断公式，具体为：P＝exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)/[1+exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)]，(a＝PCA3得分，b＝CST1得分，c＝CST4得分)。P大于或等于0.75，为阳性；P小于0.75，为阴性。根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，如图10所示。由图10可知，PCA3、CST1和CST4单独检测的曲线下面积分别为0.829、0.879和0.853，PCA3、CST1和CST4联合检测的曲线下面积为0.930。结果显示，联合检测诊断效能更优。为了获得更高的特异性，将CST1mRNA和CST4mRNA作为诊断前列腺癌的标志物，并以此构建PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒，其包括如下组分：
PCA3mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物分别如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
CST1mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物分别如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
CST4mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示；
PSA mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；
还包括定量检测的其他常规试剂，包括：10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂以及磁珠法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHAmRNA的试剂。
实施例6、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断前列腺癌
从上海市第五人民医院收集前列腺癌尿液样本30例，良性病变样本30例。将尿液采用实施例1的方法富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA，以PSA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本采用PCA3、CST1与CST4联合检测试剂盒检测PCA3、CST1和CST4的得分，并根据联合检测的判断公式判断阳性和阴性，同时根据临床分析诊断，结果如表6所示。
表6、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断前列腺癌结果
用χ2统计检测结果与临床诊断结果相关性，结果显示，P＜0.05，表明PCA3、CST1和CST4联合检测前列腺癌与临床诊断结果有相关性，且一致性较好，Kappa值为86.7％。
实施例7、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒评估前列腺癌疗效
从江苏省肿瘤医院取10例前列腺癌患者治疗前尿液，用实施例1的方法富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA，以PSA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA的分值，治疗结束后再取患者尿液，用实施例1的方法富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSAmRNA检测PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA的分值。然后利用联合检测的判断公式P＝exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)/[1+exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)]，(a＝PCA3得分，b＝CST1得分，c＝CST4得分)计算P值，然后根据治疗前和治疗后P值变化评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表7所示，同时根据临床症状评估疗效，结果如表4所示。
表7、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒评估前列腺癌疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价
1 降低87％ 疗效显著
2 升高7％ 无效
3 降低44％ 改善
4 降低58％ 改善
5 升高20％ 无效
6 降低17％ 无效
7 降低49％ 改善
8 降低75％ 疗效显著
9 降低40％ 无效
10 降低61％ 改善
由表7可知，使用PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒对10例前列腺癌患者疗效评估结果是有2例疗效显著，5例治疗后病情得到改善，其余3例无疗效。而临床诊断结果为2例疗效显著，4例治疗后病情得到改善，其余4例无疗效。因此采用PCA3、CST1和CST4联合检测的判断结果与临床判断结果一致。
实施例8、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒监控前列腺癌转移复发
对6例疗程结束后的前列腺癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，将尿液用实施例1的方法富集PCA3mRNA、CST1mRNA、CST4mRNA和PSA mRNA，以PSA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中PCA3、CST1和CST4得分，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用联合检测的判断公式P＝exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)/[1+exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)]，(a＝PCA3得分，b＝CST1得分，c＝CST4得分)计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生转移复发，为无进展生存，其结果如表5所示；同时根据临床症状监控前列腺癌转移复发情况，结果如表8所示。
表8、PCA3、CST1和CST4联合检测试剂盒监控前列腺癌移转复发情况
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价
1 0.37 0.41 0.60 0.74 转移复发
2 0.21 0.28 0.25 0.27 无进展生存
3 0.39 0.41 0.45 0.53 无进展生存
4 0.25 0.30 0.26 0.31 无进展生存
5 0.45 0.40 0.46 0.49 无进展生存
6 0.53 0.64 0.68 0.77 转移复发
由表8可知，在跟踪第9个月时6例患者中有2例出现转移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存，与临床评价结果一致，但是在监控过程中PCA3、CST1和CST4联合检测能够预测前列腺癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预提供指导。
综上所述，PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA可以联合应用，作为诊断和预示前列腺癌的标志物，并且同时检测PCA3mRNA、CST1mRNA和CST4mRNA3个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志物，能够提高诊断的准确性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.检测PCA3 mRNA、CST1 mRNA和CST4 mRNA的试剂在制备PCA3、CST1和CST4联合诊断和预示前列腺癌试剂盒中的应用，所述PCA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CST1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CST4 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测PCA3 mRNA、CST1 mRNA和CST4 mRNA的试剂联合诊断和预示前列腺癌的判断公式为P=exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)/[1+exp(-3.914+0.025a+0.025b+0.019c)]，其中a为PCA3 得分，b为CST1 得分，c为CST4得分，PCA3得分=（PCA3拷贝数/PSA拷贝数）×1000；CST1得分=（CST1拷贝数/PSA拷贝数）×1000；CST4得分=（CST4拷贝数/PSA拷贝数）×1000。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
4.PCA3、CST1和CST4联合诊断和预示前列腺癌的试剂盒，其特征在于，包括PCA3 mRNA、CST1 mRNA和CST4 mRNA的定量检测试剂；所述PCA3 mRNA定量检测试剂包括SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的TaqMAN探针；所述CST1 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示的TaqMAN探针；所述CST4 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示的TaqMAN探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PSA mRNA 定量检测试剂，所述PSA mRNA 定量检测试剂包括如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示的TaqMAN探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异捕获PCA3 mRNA、CST1 mRNA、CST4 mRNA和PSA mRNA的磁珠，所述特异捕获PCA3 mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.5所示的探针，所述特异捕获CST1 mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.6所示的探针，所述特异捕获CST4 mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.7所示的探针，所述特异捕获PSA mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.8所示的探针。
7.根据权利要求4~6任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
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