CN103966350B - CST1 mRNA和CST4 mRNA或其编码的蛋白质在制备尿道癌标志物中的应用及其试剂盒 - Google Patents

CST1 mRNA和CST4 mRNA或其编码的蛋白质在制备尿道癌标志物中的应用及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CST1mRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质在制备尿道癌标志物中的应用及其试剂盒，将CST1mRNA和CST4mRNA或其所编码的蛋白质联合用于诊断和预示尿道癌，其特异性和灵敏度高于使用其中一个标志物；本发明还公开了联合检测上述标志物的试剂盒，其试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，能够用于尿道癌诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，为医生提前进行干预提供了指导。

Description

CST1 mRNA和CST4 mRNA或其编码的蛋白质在制备尿道癌标志物中的应用及其试剂盒
技术领域
本发明属于诊断领域，具体涉及Cystatin SN和Cystatin S在制备尿道癌标志物中的应用，还涉及诊断尿道癌的试剂盒。
背景技术
尿道癌属于尿道上皮肿瘤，在两性中均可发病，临床上比较少见，其中男性居多。它是尿道肿瘤里最常见的肿瘤，为恶性肿瘤。按其起源不同：分为鳞状上皮癌，移行上皮癌，腺癌，透明细胞癌，尿道泄殖腔源性癌，腺样囊性癌，类癌，混合性癌，cowper尿道附属腺癌。以鳞状上皮癌最多见，多发生于前段或中段尿道，移行上皮癌多发生于后尿道，腺癌多发生于中段尿道。尿道癌主要为手术治疗，放射治疗可以作为术前术后辅助治疗和已有转移无法行手术治疗的患者，亦可联合化疗。但是效果不是很理想，早发现早治疗将最大程度的提高生存率。因此，寻找到特异的尿道癌肿瘤标志物成为亟待解决的问题。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin SN和Cystatin S是人类Cystatin家族成员，分别由CST1基因和CST4基因编码。Cystatin SN和Cystatin S为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等，可以作为乳腺癌标志物。而CST1和CST4在胃肠肿瘤组织中的表达量高于正常组织，并且CST1和CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(TNM分析)相关；生存分析表明，CST1和CST4高表达患者的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CST1和CST4是一个独立预后因子；从而提示CST1和CST4可能在胃肠肿瘤的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，未见CST1和CST4与尿道癌相关性的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供CST1mRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示尿道癌标志物中的联合应用，通过CST1mRNA和CST4mRNA联合检测，提高诊断和预示尿道癌的特异性；本发明的目的之二在于提供CST1mRNA和CST4mRNA联合检测尿道癌的试剂盒，该试剂盒具有特异性高，使用方便等优点；本发明的目的之三在于提供Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示尿道癌标志物中的联合应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1.CST1mRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示尿道癌标志物中的联合应用，所述CST1mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，CST1mRNA和CST4mRNA联合应用的判断公式为P＝exp(-1.283+0.002a+0.001b)/[1+exp(-1.283+0.002a+0.001b)]，其中a＝CST1拷贝数，b＝CST4拷贝数。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
2、CST1mRNA和CST4mRNA联合检测尿道癌的试剂盒，包括CST1mRNA和CST4mRNA的定量检测试剂；所述CST1mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的TaqMAN探针；所述CST4mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括SDHA mRNA定量检测试剂，所述SDHA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的TaqMAN探针。
优选的，所述试剂盒还包括特异捕获CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特异捕获CST1mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.4所示的探针，所述特异捕获CST4mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.5所示的探针，所述特异捕获SDHA mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.6所示的探针。
更优选的，靶序列捕获液中磁珠的浓度为500μg/mL，特异捕获探针的浓度为2μM。
优选的，所述试剂盒还包括10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
3、Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示尿道癌标志物中的联合应用，编码Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码Cystatin S的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，Cystatin SN和Cystatin S联合应用的判断公式为P＝exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+exp(-6.508+0.023a+0.022b)]，其中a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度。
优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
本发明的有益效果在于：本发明公开了诊断和预示尿道癌的新标志物，即CST1mRNA 和CST4mRNA或其所编码的蛋白质，利用两个标志物联合检测的特异性和灵敏度高于使用其中一个标志物；本发明还公开了诊断和预示尿道癌标志物的试剂盒，该试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，其诊断结果与临床诊断结果一致，在监控过程中还可以及早发现转移复发情况，为医生提前进行干预提供了指导。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为磁珠法从尿液中特异性富集mRNA原理图。
图2为特异性探针和非特异性探针富集CST1基因比较结果。
图3为特异性探针和非特异性探针富集CST4基因比较结果。
图4为特异性探针和非特异性探针富集SDHA基因比较结果。
图5为尿道癌组织与癌旁组织CST1相对表达量的比值结果图。
图6为尿道癌组织与癌旁组织CST4相对表达量的比值结果图。
图7为CST1绝对定量标准曲线。
图8为CST4绝对定量标准曲线。
图9为受试者CST1基因和CST4基因联合检测ROC曲线。
图10为ELISA检测Cystatin SN在尿道癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示尿道癌组织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
图11为ELISA检测Cystatin S在尿道癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示尿道癌组织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
图12为Cystatin SN蛋白标准曲线。
图13为Cystatin S蛋白标准曲线。
图14为Cystatin SN和Cystatin S标志物单独检测及联合检测的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、磁珠法从尿液中特异性富集CST1、CST4和SDHA基因的mRNA
根据CST1、CST4和SDHA的mRNA序列设计捕获CST1、CST4和SDHA基因的mRNA的特异探针(CST1mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，SDHA mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3)，具体如下：捕获CST1mRNA的探针为5’-aaagagcacaactgtttcttctgca(dA)30-3’(SEQ ID NO.4)，捕获CST4mRNA的探针为5’-taccaggtctattagaagca(dA)30-3’(SEQ ID NO.5)，捕获内参基因SDHA(泛醌还原酶)mRNA的探针为5’-ggagcgaatggctggcgggacg(dA)30-3’(SEQ ID NO.6)，上述特异探针能够与磁珠(GE，货号为3815-2103-010150)的olig(dT)互补结合，得结合特异探针的磁珠。
富集CST1、CST4和SDHA基因的mRNA，具体步骤如下：将新鲜尿液与样本运输保存液按照体积比为2：1的比例混合，得处理后的尿液样本，该处理后的尿液样本4℃条件下可保存一周，-20℃条件下可保存1年；然后分别将200μL含有磁珠的靶序列捕获液加入到200μL处理后的尿液中，于75℃条件下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后将样品置于磁性分离器上，5分钟后，吸弃上清，加入1mL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离器，5分钟后，吸弃上清；最后室温(18～25℃)静置5分钟，加入洗脱液20μL，枪头吹打混匀，上磁力架5分钟，将上清转移至新的EP管中，富集原理如图1所示。
富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下：110mM LiDS(十二烷基硫酸锂)，10mM NaH2PO4，10mM Na2HPO4，5mM EDTA，7mM EGTA，pH7.5；靶序列捕获液中各组分浓度如下：135mM HEPES，1.25M LiCl，110mM LiOH，10mM EDTA，pH7.0，500μg/mL磁珠，2μM捕获探针；漂洗液中各组分浓度如下：100mM HEPES，350mM NaCl，10mM NaOH，2mM EDTA，3％乙醇，0.2％羟基甲酯，0.1％羟基丙酯，0.1％SDS，pH7.5；洗脱液中各组分浓度如下：20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA。
同时以非特异性探针oligo(dT)按上述相同的方法非特异性富集mRNA。
将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的相对含量，检测所使用的引物如下：
CST1检测引物：上游引物：5’-agagccaggcaacagacc-3’(SEQ ID NO.7)
              下游引物：5’-gttcatggaaggcacagg-3’(SEQ ID NO.8)
CST4检测引物：上游引物：5’-atgaacagccagaactgca-3’(SEQ ID NO.9)
              下游引物：5’-caagaaggaaggagggag-3’(SEQ ID NO.10)
SDHA检测引物：上游引物：5’-attactccaagcccatcc-3’(SEQ ID NO.11)
              下游引物：5’-gcacagtcagcctcgttc-3’(SEQ ID NO.12)
然后构建如下检测体系：SYBR Green2×Mix10μL(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司)，终浓度分别为250nM的上游引物和下游引物，模板2μL，加ddH2O将体积补充至20μL。
并按如下条件检测：先预变性5分钟，然后在95℃变性10秒、60℃退火15秒、72℃延伸20秒，进行45个循环；最后熔解：95℃，1分钟；40℃，1分钟；65℃，1秒；95℃，1分钟，冷却50℃，30sec。
同时以oligo(dT)非特异性富集的mRNA为对照，检测引物、体系和检测条件按上述方法进行，然后比较CST1、CST4和SDHA基因mRNA CP值(Cross Point)，结果如图2-4所示。
由图2-4可知，使用特异探针富集到的CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的CP值更小，表明其富集的浓度更高，具有背景低，信噪比高的特点，优于使用非特异探针富集的mRNA。
实施例2、检测CST1和CST4在尿道癌组织中表达情况
从上海第五人民医院泌尿外科收集尿道癌、癌旁配对组织样本30例，切至米粒大小，放至RNAlater保存液中-80℃贮存，使用前平衡至室温。然后按照实施例1的方法分别富集尿道癌和癌旁配对组织的CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，再分别以CST1检测引物、CST4检测引物和内参基因SDHA检测引物检测30例样本尿道癌和癌旁配对组织中CST1基因和CST4基因相对表达量，检测体系和检测条件与实施例1相同。检测结果采用2-ΔΔCP法计算相对表达量，然后统计尿道癌与癌旁配对组织相对表达量的比值(C/N)，统计结果如图5和图6所示。由图5和图6可知，CST1基因和CST4基因在尿道癌组织中明显上调，明显高于癌旁组织的表达量，上述结果预示检测CST1mRNA和CST4mRNA含量可以用于诊断尿道癌。
实施例3、构建尿道癌检测试剂盒
1、构建CST1重组质粒
以尿道癌细胞株A498为材料提取尿道癌细胞株T24总mRNA，然后以提取的mRNA为模板合成cDNA，并根据CST1基因序列设计构建CST1重组质粒的引物，上游引物为5’-ctggagccccaaggagga-3’(SEQ ID NO.13)，下游引物为5’-accagtccaggggtggga-3’(SEQ ID NO.14)，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST1重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID  NO.15所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST1重组质粒用甘油保种，作为检测CST1基因的标准品。
2、构建CST4重组质粒
根据CST4基因序列设计构建CST4重组质粒的引物，上游引物为5’-tctgaggagaccatggcc-3’(SEQ ID NO.16)，下游引物为5’-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’(SEQ ID NO.17)，然后以SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17的核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为：94℃变性5分钟；94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸1分钟，进行45个循环；72℃延伸5分钟，4℃冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST4重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST4重组质粒用甘油保种，作为CST4基因的标准品。
分别将CST1重组质粒和CST4重组质粒，通过双酶切(EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ)线性化目标序列，割胶回收得到纯的线性化片段。使用体外转录试剂盒，以线性化的序列为模板，在T7RNA聚合酶的作用下，制备得到RNA，经RNA纯化试剂盒纯化后，得到RNA标准品贮液，测定浓度。经Agilent2100作RNA完整性分析，电泳图谱显示除目标序列外无其他明显的杂带及RNA降解带，则可以作为RNA标准品贮液，以备下游使用。
实施例4、绘制CST1和CST4的标准曲线
将实施例3获得的mRNA标准品作如表1和表2的梯度稀释，具体如下：
表1、CST1RNA标准品稀释梯度
标准品编号 浓度(copy/μL)
STD1 100000
STD2 10000
STD3 1000
STD4 100
表2、CST4RNA标准品稀释梯度
标准品编号 浓度(copy/μL)
STD1 100000
STD2 10000
STD3 1000
STD4 100
设计定量检测CST1基因和CST4基因的引物和探针，具体如下：
CST1定量检测引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，扩增子序列如SEQ ID NO.19所示，探针为：FAM-5’-tacttcttcgacgtagaggtgggcc-3’-TAMRA(SEQ ID NO.20)；
CST4定量检测引物如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，扩增子序列如SEQ ID NO.21所示，探针为FAM-5’-aacagttgtgctctttcgagatcta-3’-TAMRA(SEQ ID NO.22)。
SDHA定量检测引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，扩增子序列如SEQ ID NO.23所示，探针为FAM-5’-caacagaagaagccctttgagg-3’-TAMRA(SEQ ID NO.24)。
然后采用一步法RT-PCR分别表1和表2中CST1RNA和CST4RNA的浓度，检测体系为2μL10×Buffer，3μL2.5mM dNTP，2μL25mM MgCl2，0.75μL浓度为10μm的CST1或CST4的上、下游引物，0.5μL浓度为10μm的SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.22探针，DMSO分析纯1μL；10mMDTT1μL；0.1μLRoche HS TAQ(货号12032953001)，0.1μL UDG(购自NEB公司，货号EN0362)；0.1μL逆转录酶和0.1μL RNA酶抑制剂(其成分使用Thermo逆转录试剂盒，货号K1622)，灭菌纯化水8.6μL，反应条件为：37℃，5分钟；50℃，15分钟；94℃，5分钟；94℃，10秒，60℃，30秒，45个循环，最后50℃冷却30秒，然后根据检测结果绘制标准曲线，结果如图7和图8所示。
实施例5、CST1或/和CST4基因检测的特异性和灵敏度
从北京协和医院泌尿科收集尿液样本100例，其中尿道癌患者尿液50例，尿道炎症等良性病变患者尿液50例。按照实施例1的方法分别富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，然后按实施例4的一步扩增法对富集SDHA mRNA的样本进行检测，以SDHA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于结果分析。分析结果显示100例样本中其中可用样本97例，尿道癌49例，良性病变48例。再继续用实施例4的一步扩增法检测97例可用样本的CST1mRNA和CST4mRNA含量，其检测方法与实施例4相同，根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，并应用Logistic回归统计方法得出CST1mRNA和CST4mRNA联合检测的判断公式：P＝exp(-1.283+0.002a+0.001b)/[1+exp(-1.283+0.002a+0.001b)](a＝CST1拷贝数，b＝CST4拷贝数)，当P大于或等于0.75，为阳性；当P小于0.75，为阴性。然后绘制联合检测工作特征曲线(ROC曲线)，如图9所示。结果显示，CST1mRNA和CST4mRNA单独检测时曲线下面积分别为0.742和0.676，CST1mRNA和CST4mRNA联合检测时曲线下面积为0.765。由此可知，采用CST1与CST4联合检测尿道癌的特异性更高。为了获得更高的特异性，将CST1mRNA和CST4mRNA作为诊断尿道癌的标志物，并以此构建CST1和CST4联合检测试剂盒，其包括如下组分：
CST1mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
CST4mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
SDHA mRNA定量检测引物和TaqMAN探针，其引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，TaqMAN探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
还包括定量检测的其他常规试剂，包括：10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂以及磁珠法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHAmRNA的试剂。
实施例6、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断尿道癌
从上海市第五人民医院收集尿道癌尿液样本30例，良性病变样本30例。将尿液采用实施例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，以SDHA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本采用CST1与CST4联合检测试剂盒检测CST1mRNA和CST4mRNA相对表达量，并根据CST1和CST4联合检测的判断公式判断阳性和阴性，同时根据临床分析诊断，结果如表3所示。
表3、CST1和CST4联合检测试剂盒诊断尿道癌结果
用χ2统计检测结果与临床诊断结果相关性，结果显示，P＜0.05，表明CST1和CST4联合检测尿道癌与临床诊断结果有相关性，且一致性较好，Kappa值为86.7％。
实施例7、CST1和CST4联合检测试剂盒评估尿道癌疗效
从江苏省肿瘤医院取10例尿道癌患者治疗前尿液，用实施例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA后，以SDHA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中CST1mRNA和CST4mRNA的浓度，治疗结束后再取患者尿液，用实施例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA后检测CST1mRNA和CST4mRNA浓度。然后利用CST1和CST4联合检测的判断公式P＝exp(-1.283+0.002a+0.001b)/[1+exp(-1.283+0.002a+0.001b)](a代表CST1浓度，b代表CST4浓度)计算P值，然后根据治疗前 和治疗后P值变化评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表4所示，同时根据临床症状评估疗效，结果如表4所示。
表4、CST1和CST4联合检测试剂盒评估尿道癌疗效结果
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价
1 升高15％ 无效
2 下降37％ 改善
3 降低88％ 疗效显著
4 降低49％ 改善
5 升高1％ 无效
6 降低36％ 改善
7 降低79％ 疗效显著
8 降低36％ 无效
9 降低8％ 无效
10 降低38％ 改善
由表4可知，使用CST1和CST4联合检测试剂盒对10例尿道癌患者疗效评估结果是有2例疗效显著，5例治疗后病情得到改善，其余3例无疗效。而临床诊断结果为2例疗效显著，4例治疗后病情得到改善，其余4例无疗效。因此采用CST1和CST4联合检测的判断结果与临床判断结果一致性为90％。
实施例6、CST1和CST4联合检测试剂盒监控尿道癌转移复发
对6例疗程结束后的尿道癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，将尿液用实施例1的方法富集CST1mRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，以SDHA扩增曲线呈现“S”型，且CP值小于35的样本用于检测尿液中CST1和CST4mRNA浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，利用联合检测的判断公式P＝exp(-1.283+0.002a+0.001b)/[1+exp(-1.283+0.002a+0.001b)](a代表CST1浓度，b代表CST4浓度)计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生转移复发，为无进展生存，其结果如表5所示；同时根据临床症状监控尿道癌转移复发情况，结果如表5所示。
表5、CST1和CST4联合检测试剂盒监控尿道癌移转复发情况
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价
1 0.18 0.16 0.19 0.20 无进展生存
2 0.46 0.59 0.64 0.75 转移复发
3 0.38 0.41 0.55 0.60 无进展生存
4 0.29 0.40 0.36 0.45 无进展生存
5 0.48 0.50 0.65 0.74 转移复发
6 0.24 0.26 0.31 0.29 无进展生存
由表5可知，在跟踪第9个月时6例患者中有2例出现转移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存，与临床评价结果一致，但是在监控过程中CST1和CST4联合检测能够预测尿道癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预提供指导。
综上所述，CST1mRNA和CST4mRNA可以联合应用，作为诊断和预示尿道癌的标志物，并且同时检测CST1mRNA和CST4mRNA2个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志
物，能够提高诊断的准确性。
实施例7、构建Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒
为探究尿道癌组织中Cystatin SN和Cystatin S的表达情况，构建检测Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒。试剂盒中抗Cystatin SN单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为：MAB1285)；兔抗人Cystatin SN多克隆抗购自北京义翘神州生物技术有限公司；抗Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为：MAB1296)；兔抗人Cystatin S多克隆抗(货号为：11542-RP02)，购自北京义翘神州生物技术有限公司，其各组分及其浓度如表6所示。
表6、检测Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒
实施例8、Cystatin SN和Cystatin S在尿道癌组织中的表达情况
取2例尿道癌及配对的癌旁组织样本，进行15％的SDS-PAGE。电泳完毕后，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含有质量分数为5％的脱脂奶粉和质量分数为0.1％Tween-20的PBS于室温(18-25℃)下封闭2小时，分别加入抗Cystatin SN单克隆抗体和抗Cystatin S单克隆抗体于4℃温育过夜，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤3次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG于37℃温育1小时，用含有0.15％Tween-20的PBST洗涤4次，再用PBST洗涤 1次，之后用TMB过氧化物酶底物显色检测。同时以β-actin为内参蛋白，按照上述方法进行检测，结果分别如图10和图11所示。结果表明，在尿道癌组织中Cystatin SN和Cystatin S表达量高于癌旁组织中的表达量。
实施例9、Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒的特异性和灵敏度评价
将构建的Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒分别检测浓度为0pg/mL，50pg/mL，100pg/mL，250pg/mL，500pg/mL和1000pg/mL的Cystatin SN蛋白和Cystatin S蛋白，并在450nm条件下检测OD值，然后根据检测结果绘制标准曲线，Cystatin SN蛋白标准曲线如图12所示，Cystatin S蛋白标准曲线如图13所示。由图12和图13可知，Cystatin SN和Cystatin SN的ELISA检测试剂盒的线性范围为50～1000pg，在线性范围内相关系数r≥0.990。
利用Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒对北京协和医院泌尿科收集尿液样本100例，其中尿道癌患者尿液50例，尿道炎症等良性病变患者尿液50例。应用Cystatin SN和Cystatin S ELISA检测试剂盒进行检测，根据检测结果进行Logistic回归统计分析，给出联合检测的判断公式：具体为：P＝exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+exp(-6.508+0.023a+0.022b)]，(a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)，并根据P值判断是否患病，当P大于或等于0.75为阳性；当P小于0.75为阴性。根据检测结果绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，结果如图14所示。结果显示Cystatin SN和Cystatin S标志物单独检测曲线下面积分别为0.815和0.82，及联合检测的检测曲线下面积为0.957。由此可知，利用Cystatin SN和Cystatin S为标志物联合检测的效果更优。
实施例10、Cystatin SN和Cystatin S的ELISA检测试剂盒诊断尿道癌
从上海市第五人民医院收集尿道癌尿液样本30例，良性病变样本30例。应用Cystatin SN和Cystatin S ELISA检测试剂盒检测上述60例样本，然后根据Cystatin SN和Cystatin S联合检测的判断公式P＝exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+exp(-6.508+0.023a+0.022b)](a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)计算P值，根据P值判断阳性和阴性，同时根据临床诊断，结果如表7所示。
表7、Cystatin SN和Cystatin S联合诊断尿道癌结果
利用χ2统计Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒诊断结果与临床诊断结果的相关性，结果显示P＜0.05，表明Cystatin SN和Cystatin S联合诊断尿道癌与临床诊断结果有相关性，且 一致性较好，Kappa值为93.3％。
实施例11、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒用于尿道癌疗效评估
从江苏省肿瘤医院取10例尿道癌患者治疗前尿液，检测尿液中Cystatin SN蛋白和Cystatin S蛋白浓度，治疗结束后再取患者尿液检测CystatinSN蛋白和Cystatin S蛋白浓度。利用Cystatin SN和Cystatin S联合检测的判断公式P＝exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+exp(-6.508+0.023a+0.022b)](a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)计算P值，然后根据治疗前和治疗后P值评估疗效，判断标准为：P值与治疗前相比下降小于30％，判断为治疗无效；P值与治疗前相比下降大于或等于30％，判断为病情改善；P值与治疗前相比下降大于或等于70％，判断为治疗效果显著，其评估结果如表8所示；同时根据临床症状评估其疗效，结果如表8所示。
表8、CystatinSN和Cystatin S联合评估尿道癌疗效
患者编号 治疗前后浓度变化百分比 临床评价
1 升高2％ 无效
2 下降39％ 改善
3 下降85％ 疗效显著
4 下降50％ 改善
5 升高13％ 无效
6 下降39％ 改善
7 下降90％ 疗效显著
8 下降43％ 无效
9 下降9％ 无效
10 下降44％ 改善
由表8可知，使用Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒对尿道癌疗效评估结果是10例患者中，有2例疗效显著，有5例治疗后病情得到改善，其余3例无疗效，而临床诊断结果是10例患者中，有2例疗效显著，有4例患者病情得到改善，其余4例无治疗效果。因此，使用Cystatin SN/Cystatin S蛋白联合检测试剂盒与临床判断结果相比其符合率达90％。
实施例12、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒用于尿道癌转移复发监控
对6例疗程结束后的尿道癌早期患者进行跟踪随访，治疗后6周首次取尿液，并检测尿液中Cystatin SN和Cystatin S蛋白浓度，以后每三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次。根据检测结果，Cystatin SN和Cystatin S联合检测的计算公式P＝exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+exp(-6.508+0.023a+0.022b)](a＝Cystatin SN浓度，b＝Cystatin S浓度)计算P值，当P大于或等于0.75时，为转移复发；当P小于0.75时，表明未发生转移复发，为无进展生存，其结果如表9所示，并于9个月时根据临床症状监控其转移复发情况，其结果如表9所示。
表9、Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒监控尿道癌移转复发结果
患者编号 6周 3个月 6个月 9个月 临床评价
1 0.38 0.46 0.39 0.32 无进展生存
2 0.36 0.49 0.59 0.71 转移复发
3 0.28 0.21 0.25 0.26 无进展生存
4 0.49 0.58 0.46 0.45 无进展生存
5 0.56 0.58 0.65 0.79 转移复发
6 0.37 0.37 0.39 0.41 无进展生存
由表9可知，Cystatin SN和Cystatin S联合检测试剂盒监控结果是6例患者中有2例出现转移复发，其余4例未发生转移复发，为无进展生存，与临床判断结果一致。但是在监控过程中Cystatin SN和Cystatin S联合检测能够预测尿道癌移转复发的趋势，可以为医生提前进行干预提供指导。
综上所述，Cystatin SN和Cystatin S联合可以作为诊断和预示尿道癌的标志物，同时检测2个标志物的灵敏度和特异性高于检测单一标志物，能够提高诊断的准确性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.检测CST1 mRNA和CST4 mRNA的试剂在制备CST1 mRNA和CST4 mRNA联合诊断和预示尿道癌的试剂盒中的应用，所述CST1 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CST4 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测CST1 mRNA和CST4 mRNA的试剂联合诊断和预示尿道癌的判断公式为P=exp(-1.283+0.002a+0.001b)/[1+ exp(-1.283+0.002a+0.001b)]，其中a=CST1拷贝数，b=CST4拷贝数。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
4.CST1 mRNA和CST4 mRNA联合检测尿道癌的试剂盒，其特征在于，包括CST1 mRNA和CST4 mRNA的定量检测试剂；所述CST1 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的TaqMAN探针；所述CST4 mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的TaqMAN探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SDHA mRNA 定量检测试剂，所述SDHA mRNA 定量检测试剂包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的TaqMAN探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异捕获CST1 mRNA、CST4 mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特异捕获CST1 mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.4所示的探针，所述特异捕获CST4 mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.5所示的探针，所述特异捕获SDHA mRNA的磁珠结合有如SEQ ID NO.6所示的探针。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括10×Buffer，dNTP，MgCl2，DMSO，DTT，Taq酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
8.检测Cystatin SN和Cystatin S的试剂在制备Cystatin SN和Cystatin S联合诊断和预示尿道癌的试剂盒中的应用，其特征在于：编码Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码Cystatin S的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：检测Cystatin SN和Cystatin S的试剂联合诊断和预示尿道癌的判断公式为P=exp(-6.508+0.023a+0.022b)/[1+ exp(-6.508+0.023a+0.022b)]，其中a=Cystatin SN浓度，b=Cystatin S浓度。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
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