CN103667444A

CN103667444A - 一种与胰腺癌相关的肿瘤标记物及其应用

Info

Publication number: CN103667444A
Application number: CN201310461171.XA
Authority: CN
Inventors: 吴斌
Original assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN103667444B

Abstract

本发明属于基因工程和医药领域，涉及一种新的胰腺癌早期诊断的肿瘤标记物，更具体地说公开了一种与胰腺癌相关的血清/组织肿瘤标记物及其应用。该标志物为CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)的组合。该标志物及其引物、抗体可用于诊断试剂盒应用，用于胰腺癌的辅助诊断。

Description

一种与胰腺癌相关的肿瘤标记物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种与胰腺癌相关的血清/组织肿瘤标记物及其应用。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度高，预后极差的肿瘤，且发病率在世界范围内有逐年上升的趋势。美国癌症协会资料显示，胰腺癌的发病率已居恶性肿瘤的第10位，病死率居恶性肿瘤第4位，5年生存率仅为5%。由于胰腺的解剖学位置较深，腹部疼痛、体重减轻、黄疸等临床特异性的症状不易被发现，多数患者确诊时已发生癌症转移。因此，早期诊断是提高胰腺癌治愈率的关键因素，寻找敏感性、特异性高的肿瘤标志物成为临床科学研究的重点目标。

血清肿瘤标志物是胰腺癌诊断常用方法之一，CA19-9、CA242、CEA等。这些标记物单独作为诊断胰腺癌的指标尚不精确，敏感性较低，并且在其他消化道肿瘤及良性疾病中也有升高，因此对胰腺癌早期诊断的价值有限。另外，一些基因肿瘤标志物也用于临床胰腺癌的早期诊断，但始终未能达到诊断的目的。因此，寻找敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标志物仍是胰腺癌早期诊断中亟待解决的问题。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatins,CSTs）能抑制细胞内外的半胱氨酸蛋白酶，在肿瘤的生长、血管生成、浸润和转移起重要作用，可作为肿瘤诊断和预后估计的标志物。Cystatins最早是由Anastasi等采用亲和层析的方法首次在鸡蛋清中分离得到的对半胱氨酸蛋白酶有抑制作用的一种蛋白质，作为一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂的超家族，依据其分子结构主要分成三大类：⑴胞内cystatin也称stefis,包括A和B2个成员；⑵分泌型cystatins,包含有C、D、E/M、F、G、S、Sv和SA等成员；⑶血浆中的激肽原,包含低分子质量和高分子质量激肽原。目前这个家族中，研究较多，并且与恶性肿瘤关系较为明确的主要是CystatinA、B、C和M等。CST1、CST4、CST2均属于Cystatin家族中的II型分泌蛋白，近年来有研究发现，Cyatatin SN在胃癌组织中呈现高表达，并与胃癌细胞的侵袭转移相关。又有研究结果表明，其在直肠癌细胞中和患者血液中有高表达。基于Cystatin家族的功能，将其作为临床肿瘤标记物具有很大的临床应用价值及前景。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与胰腺癌相关的血清/组织肿瘤标记物。

本发明的第二个目的是提供上述血清/组织肿瘤标记物的mRNA引物及抗体。

本发明的第三个目的是提供上述血清/组织肿瘤标记物的mRNA引物及抗体在胰腺癌辅助诊断中的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种检测胰腺癌的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案得以实施：

一种与胰腺癌相关的血清/组织基因标记物，该标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA中的一种或多种的组合。

优选地，所述的标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA的组合。

本发明同时提供了CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA在制备胰腺癌诊断试剂或胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

更具体地说，本发明提供了CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测试剂在制备胰腺癌诊断试剂或胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

所述的检测试剂包括检测引物，序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。

或者，所述的检测试剂包括CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白抗体。

所述的抗体可以通过商品化的途径获得。

发明同时提供给了一种用于诊断胰腺癌的试剂盒，含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA基因检测试剂。

或者，用于诊断胰腺癌的试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白检测试剂。

或者，用于诊断胰腺癌的试剂盒含有基因检测试剂和蛋白检测试剂中的一种或多种。发明同时提供了一种用于检测胰腺癌的引物，序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

表1CystatinSN,S,SA引物序列

Actin基因检测是RT-PCR检测的参比基因，相对定量时采用的参比基因。

发明人发现，将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测引物具有良好的特异性，用于诊断胰腺癌具有很高的准确率，在已有病例中，其准确率达100%。由于CystatinSN、CystatinS和CystatinSA三者具有高度同源性，上述引物针对三者的同源序列涉及，其扩增产物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA三者的混合物。

为了验证本发明的诊断有效性，发明通过以下方法进行验证：（1）收集病人及对照组资料及组织血清样本和临床资料。（2）血清/组织样本基因芯片差异表达谱分析：选择胰腺癌癌灶组织及正常对照组织样本，检测其mRNA基因芯片表达及含量分析，分析胰腺癌样本与对照样本间的表达差异。（3）血清/组织肿瘤标记物mRNA及蛋白水平验证：设计标记物引物，使用引物及抗体，采用qRT-PCR及western blot通过mRNA及蛋白水验证标记物。

本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血清及组织样本，系统收集完整的临床资料等，采用基因芯片检测筛选，qRT-PCR及western blot方法验证。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择：

（1）经病理学明确诊断的胰腺癌病例；

（2）患者胰腺癌组织及血清样本收集；

（3）正常对照组织及血清样本收集。

2.Roche NimbleGen芯片筛选差异表达基因：

（1）病人癌灶及对照组正常组织总RNA提取；

（2）总RNA逆转录得到cDNA样品；

（3）预扩增产物进行芯片检测，得到mRNA的表达谱；

（4）数据分析与处理寻找高差异表达基因。

3.Real-Time RT-PCR(qRT-PCR)验证差异表达基因核酸表达：

（1）癌灶及正常组织样本总RNA提取，随后总RNA逆转录得到cDNA样品；

（2）设计引物；

（3）荧光染料体系进行PCR反应；

（4）检测并比较胰腺癌患者与正常对照样本中CST1、CST4、CST2mRNA量的变化。

4.western-blot验证标记物蛋白表达：

（1）癌灶及正常组织样本蛋白质提取；

（2）western blot检测并比较胰腺癌患者与正常对照样本中CST1、CST4、CST2蛋白量的变化。

5.统计分析方法：

在基因芯片数据分析方面，我们运用SAM（Significance Analysis of Microarrays）R程序包进行统计检验；进行变化差异基因验证时，我们采用student t检验组织和血清中mRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。

我们运用Roche NimbleGen芯片对3例胰腺癌病例和3例健康人对照中的基因mRNA表达差异进行分析，我们是以“胰腺癌病例”参比“健康人对照”的信号比计算基因表达的变化倍数，采用了SAM（Significance Analysis of Microarrays）R程序包进行差异表达基因的筛选（SAMcompare分析），按变化倍数和统计检验的显著性来筛选差异基因。对有其中表达上调倍数最大的前三个基因进行了组织及血清的mRNA和蛋白表达验证，进而观察本研究结果的稳定程度。

以下是本发明进一步的说明：

以上述3例胰腺癌病例及3例健康人对照为探索性样本，我们运用Roche NimbleGen芯片检测胰腺癌中mRNA的表达，获得了相关结果。

根据Roche NimbleGen芯片检测，本发明人检测到在“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组的组织中存在上调差异表达（q-value≤5%且Fold Change≥2）的前30个基因如下所示（按照上调倍数由大至小排列，列出的为基因缩写和美国生物技术信息中心数据库的该基因编号即NCBI Gene ID）：CST1（1469），CST4（1472），CST2（1470），DKK1（22943），IGFL2（147920），NDUFV3（4731），SFN（2810），DSPG3（1833），MMP1（4312），LOC441282（441282），AKR1B10（57016），CYP2S1（29785），GALNT5（11227），CXCL5（6374），MATN3（4148），CCR8（1237），PI3（5266），ABP1（26），GSDML（55876），DUOX2（50506），CYP2S1（29785），COL11A1（1301），ADAMDEC1（27299），WNT2（7472），COMP（1311），GJB3（2707），CCL20（6364），LOC653107（653107），FAM101A（144347），CCL20（6364）。下调调差异表达（q-value≤5%且Fold Change≤0.5）的前30个基因如下所示（按照下调倍数由大至小排列，列出的为基因缩写和美国生物技术信息中心数据库的该基因编号即NCBIGene ID）：BRUNOL4（56853），GAS2（2620），RPH3AL（9501），DPP6（1804），TMEM61（199964），KIF1A（547），LOC440910（440910），USP2（9099），CLGN（1047），IGSF1（3547），BRUNOL4（56853），KIAA1155（400961），GLS2（27165），HS6ST2（90161），KIRREL2（84063），PCLO（27445），KCNK3（3777），ERO1LB（56605），SLC16A12（387700），CAMK2B（816），APLP1（333），KIAA1324（57535），SLC38A4（55089），CA4（762），SCGN（10590），SH3GL2（6456），OGDHL（55753），NRCAM（4897），FTCD（10841），HS6ST3（266722）。

附图说明

图1为芯片样品表达模式聚类图；

图2为qRT-PCR检测CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)mRNA表达差异；^*代表P<0.05；

图3为CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)mRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达差异（N：正常组织，T：肿瘤组织）；

图4为western blot检测CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)蛋白质表达差异（N：正常组织，T：肿瘤组织）。

具体实施方式

实施例1样本收集及处理

临床收集胰腺癌患者及对照组组织样本各3例，系统收集病人临床资料。

实施例2胰腺癌和正常组织中mRNA的Roche NimbleGen芯片检测

将3例胰腺癌患者和3例健康人对照经Roche NimbleGen芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、分别取“胰腺癌病例”组和“健康人对照”组患者的胰腺组织，加入Trizol试剂，使用氯仿异丙醇法抽提total RNA；

2、分光光度计定量测量total RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整度；

3、反转录合成单链cDNA。反转录的反应体系包括5μL单链合成Mix（单链缓冲液Mix4μL，单链合成酶1μL），5μl（0.2μg）的总RNA，该体系在42℃孵育2h；

4、二链cDNA合成。冰上制备，反应体系包括20μL二链合成Mix（无核酸酶纯水13μL，二链缓冲液Mix5μL，二链合成酶2μL），10μL单链cDNA合成产物，该体系在65℃孵育10min；

5、体外转录合成aRNA。体外转录的反应体系包括30μL体外转录Mix（无核酸酶纯水4μL，T7体外转录Mix20μL，T7酶Mix6μL），30μl双链cDNA合成产物，该体系在40℃孵育16h；

6、反转录。aRNA经纯化后用微量分光光度计测量浓度，取7.5μL（5μg）aRNA加入4μLRandom primer(9N)，混匀后，将EP管放入PCR仪，65℃5min。随后进行反转录反应，体系包括4×CbcSciptⅡ缓冲液5μL，0.1M DTT2μL，CbcSciptⅡ反转录酶1.5μL，11.5μL上述样品和引物混合物。混匀后，将该体系在25℃孵育10min，37℃孵育1.5h。程序结束后，分别向每管反应体系中加入5μL反应终止液，65℃孵育10min。

7、荧光标记。将反转录纯化产物浓缩至14μL，加入4μL Random primer(9N)，混匀后，95℃变性3min。随后进行荧光标记反应，体系包括5×klenow缓冲液5μL，cy3-dCTP荧光染料1μL，Klenow Fragment酶1.2μL，18.2μL上述样品和引物混合物。混匀，置于冰上，在37℃反应1.5h，70℃孵育5min。

8、芯片检测。上述步骤得到的荧光标记DNA经纯化后与芯片杂交，而后进行芯片清洗，通过扫描仪（NimbleGen MS200Microarray Scanner）进行信号扫描。

9、数据分析与处理：采用NimbleScan2.6软件进行图像分析，将图像信号转化为数字信号。用RMA算法进行归一化和背景扣除，得到每个基因归一化后的信号值。然后，用400的信号值为cutoff对每个样品的信号可信度进行判断P（Present）和A（Absent）。最后，我们以“胰腺癌病例”参比“健康人对照”的信号比计算基因表达的变化倍数，采用了SAM（Significance Analysis of Microarrays）R程序包进行差异表达基因的筛选（SAMcompare分析），按变化倍数和统计检验的显著性来筛选差异基因。差异基因的筛选标准是：q-value≤5%且Fold Change≥2或≤0.5。q-value（%）为该基因被判断为差异基因时的FDR，类似于P-value，差异越显著，q-value（%）越小。我们发现在胰腺癌组织中显著上调的基因486个，显著下调基因482个，已在上文中罗列出了部分mRNA表达显著变化的基因。同时，我们用表达基因进行聚类分析，发现“胰腺癌病例”和“健康人对照”各自聚类(说明书附图，图1)。该图采用红色表示上调表达基因，绿色表示下调表达基因，如图所示样品1、3、9为胰腺癌病例样品，样品4、6、10为健康人对照，各自形成聚类，说明两组样品的差异明显,进一步证明了实验数据的可靠性。聚类分析所采用的数据源自归一化后基因的信号值，运用R语言及其扩展包中的聚类方法，采用hierarchical，average linkage算法进行。

实施例3组织中CST1、CST4、CST2mRNA qRT-PCR实验

1.根据基因芯片结果，选择差异表达基因CST1、CST4、CST2用qRT-PCR方法进一步验证。

2.组织样本总RNA提取，使用氯仿抽提法提取组织样本的总RNA，具体步骤如下：

（1）取病人冻存胰腺组织样品，敲取大小约2mm×2mm×2mm组织块，加入1ml Trizol试剂对组织进行裂解，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解组织；

（2）将上述组织的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15～30℃下放置5分钟；

（3）在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（4℃）离心30分钟；

（4）离心后取上层水相置于新EP管中,按照1份上层水相体积加入1体积异丙醇的量，加入等体积异丙醇，在低温下（-20℃）放置30分钟，12000g（2℃～8℃）离心30分钟；

（5）弃去上清，EP管中加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（4℃）离心15分钟，弃去上清；

（6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

（7）用RNase-free water溶解RNA沉淀。

（8）取2ul RNA样品，加入Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定RNA浓度

3.逆转录获取cDNA样本，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTraAce-α-TM（code No.FSK-100）说明书操作。

在20μl反应体系中加入下列组分：2μg组织总RNA，1μl oligo（dT）20，4μl5×RT buffer、1μl10mM的dNTP Mix和1μl RNase inhibitor（10U/μl）,1μl ReverTra Ace，其余用RNasefree H₂O补平，然后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应20min，99℃热处理5min，降温到4℃处理5min，然后瞬时离心后，-40℃保存。

用于合成定量PCR分析所需cDNA一链的总RNA需预先用DNAase I处理。取总RNA20-50μg，10×DNase I Buffer5μl，DNase I（RNase-free，5U/μl）0.5μl，RNase Inhibitor（40U/μl）1μl，用DEPC H₂O补平至50μl后37℃反应20-30min；加入50μl的DEPC H₂O和100μl的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入100μl（等量）的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀；离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中；加入10μl（1/10量）的3M NaOAc（pH5.2）；加入250μl（2.5倍量）

的冷无水乙醇，-20℃放置30-60min；离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，干燥后用适量的DEPC H₂O溶解。

4.普通PCR及qPCR：

(1)普通PCR：

反应体系（12μl）：

PCR程序：

(2)qPCR步骤：

荧光定量Real-time PCR采用Kapa公司的Real-time PCR Master Mix kit（SYBR Green）进行，其Real-time PCR反应体系和条件如下：

PCR反应程序：

95℃3min→95℃10sec→60℃15sec→72℃20sec→72℃5min共40cycles，每个样品做3个平行重复，另以β-actin为内部参照物。

5.数据处理与分析：两组样本mRNA表达量比值可用方程2^-△Ct表示，其中△Ct=靶基因Ct值-actin Ct值，我们将Actin作为参比基因，计算相对表达量。（Actin引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4见表1）

6.两组样本进行t检验，发现实验结果P=0.001<0.05，差异具有统计学意义。（图2）

实施例4组织中CST1、CST4、CST2蛋白western blot实验

1.组织样本蛋白提取

（1）取病人冻存胰腺组织样品，敲取大小约2mm×2mm×2mm组织块，加入蛋白提取液400ul，碾磨均匀，倒入离心管，超声粉碎机粉碎1min×3次，静置消化30min，以上操作均在冰上进行。

（2）4℃环境下离心13000rpm，20min。

（3）取上清，分装后保存于-80℃冰箱备用。

（4）样品蛋白定量：

按照上表配好各样品后，用酶标仪检测各样品吸光度，从而算出各样品蛋白浓度。

（5）依据蛋白浓度确定每孔上样量，公式如下：

V_总体积=V_{样品总体积}+V _loading _buffer

V_{样品总体积}=V_ddH2O+V_样品

V_样品=（每孔蛋白质量X孔数）/蛋白浓度

（6）各样本100℃加热5min，分装备用。

2.western blot检测CST1、CST4、CST2蛋白表达

（1）配胶

2）将胶倒入平板灌胶模具内，再轻轻加入1～2ml异丙醇。

3）待下层胶凝固，直接倒弃上层异丙醇，用滤纸吸干液滴。

4）按比例配制浓缩胶，倒入模具，立即插入梳子。

（2）上样

1）待胶凝固后，将模具放入电泳槽，于电泳槽内加入电泳缓冲液。

2）空跑5min，加入样品和marker，调整电压至60V，待条带穿过分离胶，调整电压至120V。

（3）转膜

2）取胶，放入转膜液30min（上层浓缩胶弃取）

3）取滤纸、NC膜放入转膜液中，浸泡30min。

4）30min后，将各层按以下顺序从下向上铺设：滤纸、NC膜、胶、滤纸、滤纸。稳压12V，转膜时间40-55min，依测定蛋白大小而定。

5）取出NC膜，放入丽春红染色，观察蛋白是否已转至NC膜上。

（4）封闭

1）配制5%脱脂奶封闭液

2）倒掉丽春红，加入5%脱脂奶20ml，室温下轻轻振荡1.5～2小时。

（5）一抗杂交

1）倒弃奶液，PBST10min×3润洗。

2）用5%BSA抗体稀释液稀释抗体

3）取稀释袋，剪片，压边，放入NC膜，加入稀释的抗体，封口。

4）4℃摇床，过夜。

（6）二抗杂交

1）过夜后，剪开杂交袋，倒出一抗稀释液。

2）用PBST润洗NC膜一遍，放于摇床10min×3遍。

3）用5%BSA抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗

4）将NC膜放入新杂交袋，注入二抗，室温下轻轻振荡1h。

5）1h后，用TBS润洗，10min×5遍。

（7）显影

1）在暗室中，将4.5μL H₂O₂加入ECL并倒入皿中，将NC膜从TBS中取出，用滤纸吸干背面TBS，放入ECL液，即可见荧光发出。

2）将NC膜放入压片盒，盖上塑料薄膜。

3）取胶片，沿压片盒下缘放入，压片。压片时间视信号强弱而定。

4）显影液清水定影液清水

CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)mRNA和蛋白的在正常组织和胰腺癌患者组织中的表达结果分别如图3和图4所示。由结果可知，相对于参照蛋白（在两类组织中均有表达），CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)在正常组织中不表达，而在胰腺癌患者组织中高度表达，两组结果差异非常明显。说明CystatinSN（CST1）、CystatinS(CST4)、CystatinSA(CST2)作为胰腺癌相关的肿瘤标记物，在诊断胰腺癌方面具有非常高的特异性、准确率和应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学附属第三医院

<120> 一种与胰腺癌相关的肿瘤标记物及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>

<400> 1

ggtacagcgt gcccttca 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>

<400> 2

ttgggctggg acttggta 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>

<400> 3

gtcttcccct ccatcgtg 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 4

agggtgagga tgcctctctt 20

Claims

1.一种与胰腺癌相关的基因标记物，其特征在于该标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA中的一种或多种的组合。

2.如权利要求1所述的标记物，其特征在于所述的标记物为CystatinSN、CystatinS和CystatinSA的组合。

3.如权利要求1所述的基因标记物，其特征在于为血清/组织基因标记物。

4.CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA在制备胰腺癌诊断试剂或胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

5.CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA检测试剂在制备胰腺癌诊断试剂或胰腺癌诊断试剂盒中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的检测试剂包括检测引物，序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的检测试剂包括CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白抗体。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的抗体为与CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白特异性识别的抗体。

9.一种用于诊断胰腺癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA基因检测试剂；或者所述试剂盒含有CystatinSN、CystatinS和/或CystatinSA蛋白检测试剂。

10.一种用于检测胰腺癌的引物，其特征在于序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。