CN105154447B

CN105154447B - Ac016745.3作为前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN105154447B
Application number: CN201510588895.XA
Authority: CN
Inventors: 李瑶; 鲍升林; 黄文华; 万学超; 张亚龙; 吴海
Original assignee: Shanghai Jiyuan Biological Science & Technology Co Ltd; Fudan University
Current assignee: Shanghai Jiyuan Biological Science & Technology Co Ltd; Fudan University
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2018-01-19
Anticipated expiration: 2035-09-16
Also published as: CN105154447A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为AC016745.3作为一种前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用。AC016745.3是一种lncRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明包括该前列腺癌分子靶标在筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用；包括该前列腺癌分子靶标的抑制剂，以及该抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用；包括含有前列腺癌分子靶标的前列腺癌诊断试剂盒；还包括该前列腺癌分子靶标和诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用等。使用该分子靶标及含有该分子靶标的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性和灵敏度及易于大量筛查的特点。

Description

AC016745.3作为前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌分子靶标AC016745.3及其在诊断试剂盒中的应用，包括通过该生物分子靶标在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的诊断、前列腺癌治疗及状况的监测、前列腺癌指导用药的监测及前列腺癌预后检测等领域的应用。

背景技术

根据《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中相关内容，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。血液中的一些分子标志物已经被应用于一些疾病的诊断，如谷丙转氨酶用于肝炎的诊断，白细胞数目用于判断炎症。血液循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是一种无细胞状态的胞外游离DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，其主要是由短的单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，因此，ctDNA是一种特征性的新的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪，将成为临床肿瘤的早期诊断、预后判定及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。结合新一代测序技术(NGS)将变成“液体活检”，并替代侵入组织性活检。

AC016745.3属于lncRNA（longnon-codingRNA，长链非编码RNA），是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA,参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有较多lncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。早期有效检测肿瘤的发生、发展及提高抗癌药物的疗效对于癌症的治疗尤为重要，发明新型肿瘤标志物作为诊断与治疗的靶点一直是肿瘤研究的热点。

前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。

前列腺癌的临床诊断方式目前主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原（PSA）检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：（1）患者前列腺肿块不大时，易漏诊；（2）部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；（3）患者直肠有疾患时不能使用此检测；（4）医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。正常情况下血液中的PSA不高（不高于4ng／ml），当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时，PSA升高成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性：（1）需要取血检测，对患者有一定的损伤；（2）PSA增高也常见与非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易确诊；（3）PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已经属于中后期，达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简单直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形体、有无钙化及钙化的形态、大小、数目、分布以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质；其局限性是：（1）对致密性的小癌灶容易漏诊；（2）有时候不能提供明确的定性诊断；（3）因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低；（4）对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。

近年来的研究表明，lncRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子靶标，以及前列腺癌诊断试剂盒，以及该前列腺癌分子靶标和前列腺癌诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。

本发明经研究发现AC016745.3在前列腺癌组织样本中的含量比前列腺正常组织样本中的含量高，显示AC016745.3与前列腺癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。因此，本发明提出AC016745.3作为与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子靶标，并提供含有该前列腺癌分子靶标AC016745.3（作为标志物）的诊断试剂盒，以及该分子靶标或诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。

本发明提供的前列腺癌分子靶标AC016745.3，是一种lncRNA，全长508bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

前述的前列腺癌分子靶标AC016745.3，可用于筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物。其抑制剂AC016745.3 siRNA（SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7）可用于制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物。

本发明还提供含有前述前列腺癌分子靶标AC016745.3的诊断试剂盒。该诊断试剂盒可用于前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测等。

前述的前列腺癌分子靶标AC016745.3作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，是通过检测被试者组织样本、血液和尿液中的AC016745.3的含量，并与正常水平AC016745.3含量相比较，以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。

前述的前列腺癌分子靶标AC016745.3作为标志物在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，可把被试者血清、尿液和组织样本中AC016745.3的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。

前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒包括：

（1）组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂；

每50mg组织或200ul血液或200ul尿液，使用：

（2）反转录试剂；

（3）定量PCR试剂；

引物包括AC016745.3和对照β-ACTIN两对引物；

（4）前列腺正常组织cDNA

作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。

前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒结果分析检测样本和阴性对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为标本检测阳性。

前述检测试剂盒所用对照为β-ACTIN，其引物序列如下：

β-ACTIN上游引物序列：5＇-CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3＇（SEQ ID NO.2）

β-ACTIN下游引物序列：5＇-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3＇（SEQ ID NO.3）。

前述检测试剂盒所检测AC016745.3，其引物序列如下：

AC016745.3上游引物序列：5＇-GGTGACGAAAATTCTACATTGCT-3＇（SEQ ID NO.4）

AC016745.3下游引物序列：5＇- ACCTGGCTGGTGTCCTCTG -3＇（SEQ ID NO.5）。

本发明为前列腺癌的诊断和治疗提供了一种新的分子靶标AC016745.3。该分子靶标的抑制剂可用于制备治疗前列腺癌的药物，同时可作为标志物应用于制备诊断试剂盒中。使用该分子靶标及含有该分子靶标的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性、灵敏性和方便大量筛查的特点。该分子靶标适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗及状况的监测、前列腺癌指导用药的监测和前列腺癌预后监测等领域。

附图说明

图1.AC016745.3在前列腺癌组织样本中和正常组织样本中的含量检测。

图2.前列腺癌PC-3细胞系中AC016745.3siRNA对AC016745.3沉默效率。

图3.AC016745.3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖。

图4.药物SB20580显著抑制前列腺癌细胞系中AC016745.3的表达。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照常规实验方法进行。

实施例1：AC016745.3在前列腺癌组织样本中和正常组织样本中的含量检测

本实施例主要步骤如下：

1、组织样本中总RNA的提取

获得前列腺癌根治术患者手术后的组织样本，同时获得淋巴结清扫术的患者切除的组织样本作为对照。提取前述组织样本的总RNA于无DNA和无RNA酶污染的1.5毫升离心管中。

组织样本中提取总RNA的试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop2000c分光光度计，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。

2、定量检测组织样本中的lncRNA

（1）反转录RNA得到cDNA单链

按照下表1配置反转录体系，配置过程在冰上进行。配置好的体系在PCR仪上进行反转录。反应条件为 38摄氏度15分钟，85摄氏度5秒。

表1

表1中X表示加入的RNA体积由RNA浓度来确定，本实验中为X＝500钠克／RNA浓度。前述反转录试剂盒购自大连宝生物有限公司（Takara）。

（2）QPCR定量检测

以cDNA稀释液为实时定量PCR模板，引物终浓度为200nM，反应总体积为10μl。实时定量PCR仪器使用ABI 7900HT sequence Detection System，用384孔板完成。每个样本重复二到三次。在溶解曲线基本符合要求无非特异性扩增的情况下，参考操作手册，采用threshold cycle （Ct）方法获得相对表达量，以β-ACTIN为内参。具体程序参看表2。

表2

。

（3）采用Array Tools4.1.0 进行数据分析

用前述方法可测得样品中目标lncRNA和参照lncRNA的Ct值水平求得目标lncRNA在组织中的相对含量。用β-ACTIN为参照矫正lncRNA的量，通过QPCR检测中经典的2^-ΔCt的方法表示组织样本中lncRNA的水平（-ΔCt为目标lncRNA与对照的Ct值之差）。

3、组织样本中AC016745.3水平诊断前列腺癌

如图1，与正常对照组织样本中AC016745.3的高含量相比，前列腺癌患者组织样本中的AC016745.3含量相对较高，且普遍高于正常组织样本的平均值，正常样本平均值约为肿瘤样本的平均值的5倍，差异有统计学意义。

实施例2：前列腺癌细胞系中AC016745.3-siRNA对AC016745.3沉默效率检测

本实施例中使用的前列腺癌分子靶标AC016745.3的siRNA序列为：

AC016745.3siRNA正义链序列：5＇-GCGUCUAAGAGAGUACUUU -3＇（SEQ ID NO.6）

AC016745.3siRNA反义链序列：5＇-AAAGUACUCUCUUAGACGC -3＇（SEQ ID NO.7）

使用的阴性对照(NC)的siRNA序列为：

NC siRNA正义链序列：5＇-UUCUCCGAACGUGUCACGU -3＇（SEQ ID NO.8）

NC siRNA反义链序列：5＇-ACGUGACACGUUCGGAGAA -3＇（SEQ ID NO.9）。

本实施例主要步骤如下：

1、细胞的siRNA转染（以六孔板为例）

将前列腺癌PC-3细胞系接种到六孔板中，使得次日的细胞汇合度约40-50%，将5μL的Lipofectamine2000和250μLOpti-MEM混合孵育，同时将5ul 20uM/L的siRNA与250μLOpti-MEM混合孵育。静置5min后将两者混合。同时将细胞用PBS洗一遍，换成1.5 ml的Opti-MEM。转染混合物静置20min后，均匀滴加到六孔板中，siRNA的终浓度为50uM/ml。4-6小时后更换成完全培养基继续培养。

2、细胞中总RNA的提取

细胞转染并培养48h后，收集细胞并提取其总RNA，提取方法同实施例1。

3、定量检测细胞中的lncRNA并进行数据分析

定量检测及数据分析方法同同实施例1。

4、AC016745.3 siRNA对AC016745.3沉默效率

如图2，在PC-3转染AC016745.3 siRNA之后，AC016745.3的表达量下降了40％以上。证明AC016745.3 siRNA可以有效敲减AC016745.3在前列腺癌PC-3细胞系中的表达。

实施例3：AC016745.3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖，可用于前列腺癌药物的制备。

本实施例主要步骤如下：

1、细胞的siRNA转染（以六孔板为例）

转染方法同实施例2。

2、细胞增殖实验

细胞消化后重悬，接种于96孔中，并设置只加100μL 1640培养基的对照孔。接种0h、24h、48h后，每孔分别加入10ul CKK-8试剂后，细胞培养箱中继续孵育2小时。使用在酶标仪检测波长450nm处各孔的光吸收值（OD），参比波长630nm(600-650nm)。以各孔光吸收值减去空白孔光吸收值的平均值作为实际光吸收值，取平均值，以0h、24h、48h时间点光吸收值作曲线，反映细胞的增殖情况。

3、AC016745.3-siRNA影响前列腺癌细胞的增殖情况

如图3，AC016745.3-siRNA显著抑制前列腺癌细胞的增殖，可用于前列腺癌药物的制备。

实施例4：药物SB20580能显著抑制前列腺癌细胞系中AC016745.3的表达，可作为潜在前列腺癌的药物。

本实施例主要步骤如下：

1、细胞的处理

将前列腺癌PC-3细胞系接种到六孔板中，使得次日的细胞汇合度约70%，第二天将正常的培养基更换为含有浓度为10μM的培养基，分别培养0小时，2小时，4小时。

2、细胞中总RNA的提取

收集细胞并提取其总RNA，提取方法同实施例1。

3、定量检测细胞中的lncRNA并进行数据分析

定量检测及数据分析方法同同实施例1。

4、药物SB20580对AC016745.3的抑制率

如图4，在使用药物SB20580对细胞处理之后，AC016745.3的表达量在2h和4h后分别下降了15％和50%以上。证明药物SB20580可以有效抑制AC016745.3在前列腺癌PC-3细胞系中的表达，可作为潜在前列腺癌的药物。

实施例5：本前列腺癌的诊断试剂盒的应用

本实施例主要步骤如下：

1、组织样本、血液、尿液中总RNA的提取

按照每50mg组织或200ul血液或200ul尿液使用1mL的Trizol试剂的量处理组织样本、血液、尿液，吹打均匀后转移到无RNA酶的1.5ml Ep管中；向匀浆中加入1/5体积的氯仿，振荡离心管至溶液乳化成乳白状，无分相，12000 rpm 4°C离心15min；吸取上清至新管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20°C2h沉淀； 12000 rpm 4°C离心10min；弃上清，沿管壁轻轻加入1ml 75％乙醇，轻洗EP管，12000 rpm 4°C离心2min；弃上清，短暂离心，用枪吸去剩余上清，置于通风橱内晾干；加入适量DEPC水，用枪吹打使沉淀溶解；定量：电泳检测抽提质量，紫外分光光度计检测OD260/OD280和样品浓度；得到组织样本、血液、尿液中总RNA，放置-80°C保存。

2、检测组织样本、血液、尿液中的AC016745.3相对前列腺正常组织表达量变化

使用试剂盒中试剂，按照实施例1中反应体系与条件，使用试剂盒中前列腺正常组织cDNA作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本、血液、尿液中的AC016745.3相对前列腺正常组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为检测样本阳性。

本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

<110> 复旦大学

<120> AC016745.3作为一种前列腺癌分子靶标及其在诊断试剂盒中的应用

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 508

<212> RNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 1

agcugggaaa acggcaaugg auuaauaaca agaaauuaau ggugaagugg ugacgaaaau 60

ucuacauugc uuagaaagca aauagugaaa ugaacauuua cauucuggca accucagaag 120

uacaacgaac agaggacacc agccagguag ggcaaaggcc ugugcgcccc cuuuugcugu 180

uacauguuua ucagaugcgu gcucuguuuc uguuguauua cauuacuuuu cucuucaaug 240

ucuacugagg aagaacaagu agcuccucag gcaagucaac uguuaacucu gcaguuuuua 300

uuuaaucucc caggaaugua acccuuaacu uuaaagaaug uagugaccau aaaacuuaua 360

aggcauguuu cuuaaggaaa uuguaccugu uuauuuaauc uaucagauau gaauguuaua 420

gaaaauuaaa uuuguccacu uaagcuguag augaacuuuu caccuuucug aucagaaauu 480

caccauuuua uaguauaggu ucuguuau 508

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctctcccaa gtccacacag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggcacgaag gctcatcatt 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtgacgaaa attctacatt gct 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acctggctgg tgtcctctg 19

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<212> RNA

<213> 人工序列

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ccaggaaugu aacccuuaa 19

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uuaaggguua cauuccugg 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgugacacg uucggagaa 19

Claims

1.一种前列腺癌分子靶标AC016745.3在制备抑制前列腺癌细胞增殖的药物中的应用，所述前列腺癌分子靶标AC016745.3是一种lncRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该前列腺癌分子靶标AC016745.3的抑制剂可抑制前列腺癌细胞增殖。

2. 一种前列腺癌分子靶标的抑制剂AC016745.3 siRNA在制备抑制前列腺癌细胞增殖的药物中的应用；所述前列腺癌分子靶标AC016745.3是一种lncRNA，其核苷酸序列为SEQID NO.1所示；其中：

AC016745.3的siRNA序列为：

AC016745.3 siRNA正义链序列为SEQ ID NO.6所示；

AC016745.3 siRNA反义链序列为SEQ ID NO.7所示。