CN104004840A - 用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒。本发明的试剂盒包括ITGB5、TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的上下游引物；其中ITGB5引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，TIMP1的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明的试剂盒对前列腺癌具有极高的敏感性与特异性，不仅可用于早期诊断前列腺癌，还能鉴别惰性前列腺癌、主动监测前列腺癌疾病进展。
Description
技术领域
本发明涉及用于筛查与诊断前列腺癌的试剂盒。具体地说，本发明涉及用于早期筛查与诊断前列腺癌的分子标记物、试剂盒，以及该试剂盒的使用方法。
背景技术
肿瘤发病率与死亡率：据2012年全国肿瘤登记地区发病率(粗率)285.91/10万，中国人口标化率为146.87/10万，累计率(0～74岁)为22.08％。全国肿瘤登记地区恶性肿瘤死亡率(粗率)为180.54/10万，中国人口标化率为85.06/10万，我国居民因癌死亡的累计率(0～74岁)为12.94％。因此，提高肿瘤早期诊断和综合防治能力显得极为迫切需要。
前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌。随着饮食结构的改变、人口老年化和医疗水平的提高，我国前列腺癌的发病率和检出率呈逐年升高趋势。上海市疾控中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。流行病学调查显示，中国前列腺癌发病率已从1993年的1.71/10万男性人口增加到2005年的7.9/10万男性人口，年增幅13％。前列腺疾病是老年男性的主要疾病。我国已进入老年社会，而我们居民饮食结构也发生很大改变，肉食摄取量增加。依次推算，预计至2020年，我国前列腺癌发病率将超过40/10万人口男性，接近欧美国家水平，成为危害男性健康的第一肿瘤“杀手”，而早期前列腺癌行根治性治疗能达到治愈的效果。因此，早期诊断对前列腺癌的防治有着重大意义，直接关系老年男性健康。目前前列腺癌的诊断主要有以下几种方法：
(1)前列腺特异性抗原(PSA)测定：PSA是一种蛋白酶，通常只在前列腺液和精液测得，如果在血液中测得前列腺特异性抗原存在，往往可作为患者发生良性或恶性前列腺病变的标志。前列腺特异性抗原作为单一检查，目前具有较好的前列腺癌阳性诊断预测率，有效降低晚期和转移性前列腺癌患者的发生率。随着PSA筛查的普及，前列腺癌患者检出率明显提高，大部分为早期癌症患者。早期癌症患者接受根治治疗后能生存10年以上，治疗效果好。但PSA存在以下缺陷：前列腺特异性抗原对前列腺腺体本身有特异性，但对前列腺肿瘤没有特异性。所以临床上仅50％的前列腺癌因PSA升高而被检出。例如，目前临床筛查前列腺癌的PSA阈值设定在4ng/ml。现实的临床数据是：在PSA诊断阈值设定在4.0ng/ml时，其敏感性在67.5-80％，但特异性仅47％；当PSA阈值限定在3ng/ml,敏感性提高到90％，但特异性降低到30％以下。其次，在PSA<4.0ng/ml，有接近20％的临床隐匿性前列腺癌被诊断出。临床还存在的问题是：近30％前列腺癌患者PSA可能不升高，只在正常范围内(即PSA<4.0ng/ml)波动。PSA帮助前列腺癌患者得到早期诊断及治疗后，也带来一个目前困惑患者和医生的大问题，即前列腺癌的过度治疗。因为PSA也帮助许多患者前列腺内很多体积非常小的病灶、或病理分化不明显前列腺癌病灶得到发现与诊断。但现有的病理识别标准和PSA变化不能鉴别诊断惰性前列腺癌(无临床意义的前列腺癌)，增加医疗费用，使许多本可临床观察，而不需手术或放疗或内分泌治疗的患者接受过度医疗。目前临床还没有一个很好的方法鉴别这种惰性前列腺癌。再其次，PSA还能用于前列腺癌患者根治术后或接受治疗后的疾病进展评估。但因PSA无前列腺癌肿瘤特异性，在没有临床其它体征确诊前，临床只能称PSA升高为生化复发。
(2)直肠指诊：在体格检查中，直肠指诊是发现、诊断前列腺癌的最有帮助的第一线检查，但是直肠指诊是一种非特异性的检查，发现前列腺癌时常常病理分级已达恶性程度较高的级别，也即到了前列腺癌的晚期。直肠指诊联合PSA检测一定程度上提高前列腺癌诊断阳性率，但对于PSA<4.0ng/ml的前列腺癌患者，直肠指诊阳性率仅10-20％；对于PSA>4.0ng/ml的前列腺癌，直肠指诊阴性率约12-32％，阳性率约42-72％。
(3)经直肠超声检查与前列腺穿刺活检：经直肠超声检查是诊断前列腺癌的一种非常有价值的手段，它可帮助医师检查患者的前列腺以及周围组织结构寻找可疑病灶，并能初步判断肿瘤的体积大小。此外。它还能帮助引导医师进行前列腺可触及或不可触及的病变的穿刺活检。而即便在超声引导下，系统的前列腺六点穿刺的假阳性率仍可高达23％～42％。经直肠超声检查在前列腺癌诊断特异性方面也较低，发现一个前列腺低回声病灶要与多种疾病相鉴别。
(4)其它影像学检查：(a)计算机断层扫描(CT)检查：由于CT检查不能显示正常前列腺的三个带(外周带、中央带和移行带)，加之多数肿瘤组织的密度与正常腺体近似或相同，因此CT不能用来诊断早期前列腺癌；(b)磁共振扫描(MRI)：磁共振有很好的软组织分辨率，能直接多方向平面(三维)成像，因此，MRI对前列腺的检查优于其它影像学方法。但经腹部MRI仅可发现60％的前列腺癌。
(5)其他分子标记物包括HK-2、PSMA、p27基因和IGF-1等，报道这些基因与前列腺癌分级分期有关，但缺乏前列腺癌特异性，且敏感性也不高。HK-2联合PSA诊断前列腺癌敏感性约74％；PSMA表达于70％的良性前列腺上皮细胞，78％的前列腺上皮内瘤，80％的侵袭性前列腺癌；p27为肿瘤抑制基因，同前列腺癌分级、精囊浸润和淋巴结转移有关；血液中IGF-1高表达较低表达的前列腺癌相对危险性提高2.4倍。但这些分子标记物均难以用来诊断前列腺癌。
综上所述可知，现有检查手段存在诸多缺陷：现有技术不能从血液检测早期诊断前列腺癌和尿液标记物，仅能诊断ERG融合基因阳性前列腺癌且稳定性不够；特别是对于满足世界老年男性人口健康筛查巨大临床和社会需求方面存在缺陷。目前尚缺乏有效的血清学标记和其他简单有效的方法来诊断前列腺癌；此外，现有的诊断前列腺癌的方法敏感性和特异性不高，还不能用来诊断早期前列腺癌。
发明内容
为克服现有的诊断前列腺癌方法的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于早期筛查与诊断前列腺癌的分子标记物。
本发明的另一目的在于提供一种具有高敏感性与特异性的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒。
与此相应地，本发明还提供了一种用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法。
为实现上述目的，本发明提供的用于早期筛查与诊断前列腺癌的分子标记物为分泌性基因ITGB5、TMEM176B和TIMP1或其中任何两个基因。
上述ITGB5、TMEM176B和TIMP1基因是利用Affymetirx U1332.0plus全基因芯片筛选出的前列腺癌差异表达基因，为分泌性蛋白，在血液中能检测的其表达水平。
本发明提供的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其包括ITGB5、TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的上下游引物；其中ITGB5引物对如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示，TIMP1的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒还包括内参基因18S引物对，18S引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、cDNA合成试剂和荧光定量试剂。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其所述RNA提取试剂包括life试剂盒、β-巯基乙醇和无水乙醇；所述cDNA合成试剂包括逆转录酶、5X逆转录buffer、RNA酶抑制剂、dNTP、锚定寡核苷酸(dT)18引物、随机六聚寡核苷酸引物和PCR级水；所述荧光定量试剂为SYBR Green qPCR SuperMix。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒还包括RNA纯度和完整性检测试剂。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，所述RNA纯度检测试剂包括PCR级水，所述RNA完整性检测试剂包括琼脂糖凝胶电泳。
本发明提供的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
(1)外周血RNA的提取：以含1％β-巯基乙醇的细胞裂解液提取全血中总RNA，RNA样品溶解后转移到过滤柱中，经洗涤、干燥、孵育后保存备用；
(2)总RNA纯度和完整性的检测；
(3)以步骤1所得总RNA为模板，合成cDNA；
(4)以ITGB5，TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的引物对及内参基因18S引物对为上下游引物，以步骤(3)所得cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测外周血中ITGB5，TMEM176B和TIMP1或其中任何两个基因的mRNA的表达量；其中，ITGB5引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，TIMP1的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
(5)基于目标基因的相对表达水平ΔCT，使用logistic回归模型来建立前列腺癌或惰性前列腺癌的预测模型；比较预测模型的危险评分值及阈值，诊断前列腺癌及惰性前列腺癌；其中，相对表达量ΔCT＝(2-ΔΔCT)的平均值±标准偏差；ΔΔCT＝(待测样品中目的基因ΔCΤ′-参照样品中目的基因ΔCT')的平均值±标准偏差(若无参照样品则选择ΔCT'最大的样品为参照进行计算)；ΔCT′＝(目的基因CΤ′-内参CT)的平均值±标准偏差。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法，外周血RNA的提取试剂还包括life试剂盒和无水乙醇；RNA纯度检测过程中，RNA用PCR级水稀释20倍，RNA完整性检测过程中采用1％琼脂糖凝胶电泳；合成cDNA使用的试剂包括逆转录酶、5X逆转录buffer、RNA酶抑制剂、dNTP、锚定寡核苷酸(dT)18引物、随机六聚寡核苷酸引物和PCR级水；荧光定量试剂为SYBRGreen qPCR SuperMix。
上述用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法，所述方法的原理为：利用定量RT-PCR联合检测人外周血ITGB5，TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的mRNA表达量，建立数学模型公式，定量前列腺癌危险评分，建立前列腺癌诊断阈值，通过比较结果与阈值来筛查与诊断前列腺癌。
本发明的有益效果为：本发明以前列腺癌差异表达基因为分子标记物，建立了用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒及其使用方法。该试剂盒及方法对前列腺癌具有极高的敏感性与特异性，不仅可用于早期诊断前列腺癌，还能鉴别惰性前列腺癌而避免过度治疗、主动监测前列腺癌疾病进展，有望取代目前在临床广泛使用的血前列腺特异性抗原(PSA)。此外，本发明的方法是检测血液中分子标记物的mRNA表达水平，可提高穿刺前列腺癌穿刺诊断率(鉴于老年男性人口数量极大，临床使用的方法是先用血液标记物筛查，最有再用前列腺穿刺活检通过病理确诊)，有效减低盲目前列腺穿刺导致的临床费用和并发症。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：引物
在本发明的实施例中，根据ITGB5、TMEM176B、TIMP1及18S基因设计的引物如下：
ITGB5引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，分别为：
正义引物:GGAAGTTCGGAAACAGAGGGT；
反义引物:CTTTCGCCAGCCAATCTTCTC；
扩增得到的片断为106bp。
TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，分别为：
正义引物：ATGACGCAAAACACGGTGATT；
反义引物：GCAGTTGTGTCAAAGCTGACT；
扩增得到的片断为109bp。
TIMP1引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，分别为：
正义引物：CATCCTGTTGTTGCTGTGGC；
反义引物：AACTTGGCCCTGATGACGAG；
扩增得到的片断为108bp。
18S引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，分别为：
正义引物：CCTGGATACCGCAGCTAGGA；
反义引物：GCGGCGCAATACGAATGCCCC；
扩增得到的片断为112bp。
实施例二：以ITGB5、TMEM176B和TIMP1为目的基因的方法步骤
1、外周血RNA的提取
在本发明中，血液中RNA的提取均使用Life试剂盒，另外还用到β-巯基乙醇、无水乙醇。该实施例中所使用的试剂和试剂的量仅是示例性的，本领域技术人员可根据实际情况作相应调整。如不特别指出，所用无酶水、EP管、枪头均经无酶处理和高压蒸汽灭菌。
提取外周血总RNA前，先准备好含1％β-巯基乙醇的全血标本细胞裂解液。为了准备足够的溶液去提取不超过0.2ml全血的RNA，要在0.2ml细胞裂解液中添加2ul的β-巯基乙醇。从0.2ml新鲜全血中提取总RNA的具体步骤为：
1)取0.2ml的新鲜全血标本置入1.5ml无酶的微量离心管中，加入0.2ml含1％β-巯基乙醇的细胞裂解液，充分涡旋以破坏、裂解血细胞，常温下以12000×g离心裂解物2min，将上清转移到另一个干净的1.5ml无酶微量离心管；
2)在步骤1)所述的无酶微量离心管加入200ul无水乙醇，涡旋震荡或用移液器(使用无酶的枪头)抽吸数次使沉淀消散；
3)将步骤2)所得样品(包括任何剩余的沉淀)转移到过滤柱(Spin Cartridge，过滤柱为Life-RNA试剂盒中提供，试剂盒编号：12183018A)中(过滤柱放在收集管中)，常温下以12000×g离心15秒，弃去滤液；
4)过滤柱中加入700ul wash buffer I，常温下以12000×g离心15秒,弃去滤液和收集管，再将过滤柱放入一个新的收集管中；
5)在过滤柱中加入500ul添加了乙醇的wash buffer II，常温下12000×g离心15秒，弃去滤液，将过滤柱插回收集管中，重复该步骤一次；
6)过滤柱在常温下以12000×g离心1min，使附着了RNA的膜干燥，弃去收集管，将过滤柱插入恢复管中；
7)在过滤柱中心加入30ul-3×100ul不含核糖核酸酶的水(Rnase-free water)(注意：此部分所加的量要根据RNA的产量，如：浓度小于100ug则用30-100ul；浓度小于100-500ug则用100-200ul)，室温孵育1min(最好延长2分钟，让RNA充分孵育)，过滤柱和恢复管在常温下以不小于12000×g离心2min(如果进行连续的洗脱，则要收集所有的洗脱液到同一个管子中)。
8)将提取的RNA于-80℃储存或者分析RNA的产量和质量。
2、总RNA纯度和完整性检测
1)纯度检测：取2ul RNA样品，用PCR级水(PCR级水为Roche7号试剂)稀释20倍，在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
2)总RNA完整性检测：取RNA样品1ul，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
3、cDNA的合成
以总RNA为模板逆转录合成cDNA过程中，采用的试剂盒为Roche第一链cDNA合成试剂盒。其中，逆转录酶为Roche1号试剂；5X逆转录buffer为Roche2号试剂；RNA酶抑制剂为Roche3号试剂；dNTP为Roche4号试剂；锚定寡核苷酸(dT)18引物为Roche5号试剂；随机六聚寡核苷酸引物为Roche6号试剂；PCR级水为Roche7号试剂。
合成过程中，使用的无核酸酶枪头、枪盒以及EP管均需高温、高压消毒；所使用的移液器的规格为2.5ul、10ul、20ul、100ul。
合成cDNA时，使用于-80℃保存的总RNA前，将其于冰上融化。按表1所示反应体系加样品于EP管中(其中总RNA的添加体积由RNA标本的实际浓度决定，保证最终总RNA为1ug；水与总RNA的体积之和为10ul)，样品加好后以PCR仪65°加热10min；之后立即将EP管放入冰浴中，立刻加入表2所示反应体系(用枪头轻轻混匀逆转录试剂，不能涡旋)；稍微离心反应液，将其放入PCR仪中，按表3反应条件运行PCR仪。冰浴后，合成好的cDNA管可以在4℃保存1-2小时，或-20℃长期保存。
表1
※：总RNA的添加体积由RNA标本的实际浓度决定，保证最终总RNA为1ug；水与总RNA的体积之和为10ul。
表2
表3
4、实时荧光定量PCR分析检测目的基因
通过实时荧光定量PCR分析检测目的基因SEQ--TIMP1、ITGB5和TMEM176B，其中内参基因为18S。实时荧光定量PCR分析的反应体系如表5所示。表5所述cDNA最多可稀释20倍，本实验中cDNA使用前用无酶水按1:1稀释；表5中的上游引物和下游引物如表4所示(表4中的引物即为SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:8所示引物)，SYBR Green qPCR SuperMix(SuperMix混合试剂的浓度为2x)购自Roche公司，定量PCR仪为ABI Roche480SequenceDetection System。
实时荧光定量分析的反应条件为：50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s读板，40cycles；融解曲线分析：温度60℃-95℃，每个样重复3次。
表4
表5
5、结果计算与分析
基于目标基因的相对表达水平(ΔCT)，使用logistic回归模型来建立前列腺癌或惰性前列腺癌的预测模型。其中，相对表达量ΔCT＝(2-ΔΔCT)的平均值±标准偏差；
ΔΔCT＝(待测样品中目的基因ΔCΤ′-参照样品中目的基因ΔCT')的平均值±标准偏差(若无参照样品则选择ΔCT'最大的样品为参照进行计算)；
ΔCT'＝(目的基因CΤ′-内参CT)的平均值±标准偏差。
我们定义Risk score＝logit(P)＝b0+b1ΔCT1+b2ΔCT2+…+bnΔCTn，其中P为发生阳性结局事件(前列腺癌或惰性前列腺癌)的概率。通过统计学软件分析我们获得了相应的系数(bn)，前列腺癌的诊断模型表述为Riskscore＝0.61×ΔCTTIMP1+0.96×ΔCTTMEM16B-0.60×ΔCTITGB5-12.99，其对应的前列腺癌的诊断阈值为0.57，危险评分值大于-0.57即诊断为前列腺癌；惰性前列腺癌的预测模型表述为
Risk score＝14.69+1.09×ΔCTTIMP1+0.79×ΔCTTMEM16B-2.97×ΔCTITGB5，其对应的惰性前列腺的诊断阈值为-0.04，危险评分值小于-0.04则诊断为惰性前列腺癌。
使用该预测模型我们发现能正确预测惰性前列腺癌，敏感性为90％，特异性为95％。使用前列腺癌的诊断模型对32例BPH和48例前列腺癌进行分析，该模型正确诊断了44例前列腺癌(敏感性91.7％)，正确排除了30例非肿瘤病例(特异性93.7％)。使用惰性前列腺癌预测模型对40例惰性前列腺癌和40例非惰性前列腺癌进行预测，我们发现该模型正确预测了36例惰性前列腺癌(敏感性90％)，而38例非惰性前列腺癌被该模型正确的排除了(特异性95％)。
实施例三：以ITGB5和TMEM176B为目的基因的方法步骤
以ITGB5和TMEM176B为目的基因筛查与诊断前列腺癌，实时荧光定量PCR分析检测过程中将目的基因选择为ITGB5和TMEM176B，ITGB5的上、下引物分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2，TMEM176B的上、下引物分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。结果计算方法为：前列腺癌的诊断模型表述为Riskscore＝1.21×ΔCTTMEM16B-0.67×ΔCTITGB5-6.35，其对应的前列腺癌的诊断阈值为-0.47，危险评分值大于-0.47即诊断为前列腺癌，相应的敏感性为90.7％，特异性为92.7％；惰性前列腺癌的预测模型表述为Risk score＝23.67+1.07×ΔCTTMEM176B-2.72×ΔCTITGB5，其对应的惰性前列腺的诊断阈值为0.12，危险评分值小于0.12则诊断为惰性前列腺癌，相应的敏感性为89.0％，特异性为90.0％。本实施例的其他步骤如外周血RNA的提取、总RNA纯度和完整性检测、cDNA的合成的方法等及内参基因均同实施例二。
实施例四：以TIMP1、ITGB5为目的基因的方法步骤
以TIMP1、ITGB5为目的基因筛查与诊断前列腺癌，实时荧光定量PCR分析检测过程中将目的基因选择为TIMP1和ITGB5，TIMP1的上、下游引物分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，ITGB5的上、下游引物分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2。结果计算方法为：前列腺癌的诊断模型表述为1.52×ΔCTTIMP1-0.53×ΔCTITGB5-14.15，其对应的前列腺癌的诊断阈值为-0.22，危险评分值大于-0.22即诊断为前列腺癌，相应的敏感性为87.5％，特异性为81.2％；惰性前列腺癌的预测模型表述为Risk score＝1.67×ΔCTTIMP1-2.73×ΔCTITGB5+14.56，其对应的惰性前列腺的诊断阈值为-0.5，危险评分值小于-0.5则诊断为惰性前列腺癌，相应的敏感性为85.0％，特异性为93％。本实施例的其他步骤如外周血RNA的提取、总RNA纯度和完整性检测、cDNA的合成的方法等及内参基因均同实施例二。
实施例五：以TIMP1、TMEM176B为目的基因的方法步骤
以TIMP1、TMEM176B为目的基因筛查与诊断前列腺癌，实时荧光定量PCR分析检测过程中将目的基因选择为TIMP1和TMEM176B，TIMP1的上、下游引物分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6，TMEM176B的上、下游引物分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。结果计算方法为：前列腺癌的诊断模型表述为Riskscore＝0.70×ΔCTTIMP1+0.81×ΔCTTMEM16B-21.52，其对应的前列腺癌的诊断阈值为0.49，危险评分值大于0.49即诊断为前列腺癌，相应的敏感性为83.3％，特异性为92.7％；惰性前列腺癌的预测模型表述为Risk score＝0.87×ΔCTTIMP1+0.43×ΔCTTMEM16B-20.11，其对应的惰性前列腺的诊断阈值为0.3，危险评分值小于0.3则诊断为惰性前列腺癌，相应的敏感性为90.0％，特异性为65.0％。本实施例的其他步骤如外周血RNA的提取、总RNA纯度和完整性检测、cDNA的合成的方法等及内参基因均同实施例二。
以ITGB5、TMEM176B、TIMP1中至少一个基因为目的基因，预测惰性前列腺癌及诊断前列腺癌的AUC(目的基因所对应的ROC曲线的曲线下面积)如表6所示，AUC体现了所采用目的基因的价值。
表6
| AUC(预测惰性癌) | AUC(诊断前列腺癌) | |
| TIMP1 | 0.805 | 0.878 |
| TMEM176B | 0.757 | 0.901 |
| ITGB5 | 0.890 | 0.682 |
| TIMP1+TMEM176B | 0.815 | 0.914 |
| TIMP1+ITGB5 | 0.950 | 0.904 |
| ITGB5+TMEM176B | 0.948 | 0.935 |
| TIMP1+TMEM176B+ITGB5 | 0.965 | 0.943 |
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.用于早期筛查与诊断前列腺癌的分子标记物，其特征在于：所述分子标记物为分泌性基因ITGB5、TMEM176B和TIMP1或其中任何两个基因。
2.一种用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括ITGB5、TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的上下游引物；其中，ITGB5引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，TIMP1的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求2所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参基因18S引物对，18S引物对如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
4.根据权利要求2或3所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA提取试剂、cDNA合成试剂和荧光定量试剂。
5.根据权利要求4所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述RNA提取试剂包括life试剂盒、β-巯基乙醇和无水乙醇。
6.根据权利要求4所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述cDNA合成试剂包括逆转录酶、5X逆转录buffer、RNA酶抑制剂、dNTP、锚定寡核苷酸(dT)18引物、随机六聚寡核苷酸引物和PCR级水。
7.根据权利要求4所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量试剂为SYBR Green qPCR SuperMix。
8.根据权利要求2所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA纯度和完整性检测试剂。
9.一种用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法包括如下步骤：
(1)外周血RNA的提取：以含1％β-巯基乙醇的细胞裂解液提取全血中总RNA，RNA样品溶解后转移到过滤柱中，经洗涤、干燥、孵育后保存备用。
(2)总RNA纯度和完整性的检测；
(3)以步骤1所得总RNA为模板，合成cDNA；
(4)以ITGB5、TMEM176B和TIMP1中至少两个基因的引物对及内参基因18S引物对为上下游引物，以步骤(3)所得cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测外周血中ITGB5、TMEM176B和TIMP1或其中任何两个基因的mRNA的表达量；其中，ITGB5引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TMEM176B引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，TIMP1的引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
(5)基于目标基因的相对表达水平ΔCT，使用logistic回归模型来建立前列腺癌或惰性前列腺癌的预测模型。
10.根据权利要求9所述的用于早期筛查与诊断前列腺癌的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述使用方法中，外周血RNA的提取试剂还包括life试剂盒和无水乙醇；合成cDNA使用的试剂包括逆转录酶、5X逆转录buffer、RNA酶抑制剂、dNTP、锚定寡核苷酸(dT)18引物、随机六聚寡核苷酸引物和PCR级水；荧光定量试剂为SYBR Green qPCR SuperMix。
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