CN109468381B - 用于宫颈癌筛查的甲基化位点及其检测引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点，所述甲基化位点为CHRM2基因的cg24575234位点、CHAD基因的cg06818777位点、FGF10基因的cg08361126位点以及ITGA8基因的cg08976810位点，同时公开了检测宫颈癌样本基因甲基化水平的试剂盒所包括的引物对。本发明能做到全程自动化，结果客观，易于判读，避免了主观因素的影响；本发明检测筛查宫颈癌的特异性为100％，大于HPV基因检测法的特异性(80％)，阳性预测值从0.0474％提高为100％，筛查结果客观，易于判读。本发明还可与当前宫颈癌筛检实验进行并联使用，很大程度的节约检查成本，避免太多假阳性病人因阳性结果而造成经济损失和心理负担。

Description

用于宫颈癌筛查的甲基化位点及其检测引物
技术领域
本发明属于肿瘤筛查技术领域，尤其涉及一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点及其检测引物。
背景技术
宫颈癌是最常见的女性肿瘤之一，其主要致病因素为人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)，其虽然有防御性疫苗，但是在其大规模推广前，已经有很多女性超过了疫苗接种年龄，尤其在欠发达地区，疫苗的普及还需时日，而宫颈癌的发病率却居高不下，早诊断早治疗依然是防治宫颈癌的主要方法。
目前宫颈癌的早期筛查方法包括宫颈脱落细胞检查法和HPV基因检测法，但这两种筛选方法存在如下缺点：(1)宫颈脱落细胞检查法，该方法细胞学标本满意度差、异常细胞检出率低、依赖诊断者的经验、诊断者间结果重复性差、缺乏质量控制等；(2)HPV基因检测法，虽然HPV在人群中感染率高达20％，但是大多数的HPV感染是可以被机体自动清除的，只有很少部分持续感染高危型HPV(HR-HPV)才最终发展为宫颈癌，大多数HPV阳性的非宫颈癌患者承担一定的经济负担和精神压力，有过度医疗之嫌，因此需要寻找更符合临床需求的检测指标。
综上所述，现有的宫颈癌早期筛查技术存在的问题是：宫颈脱落细胞检查法检测结果客观性差，HPV基因检测法检测阳性预测值低。
发明内容
为解决上述背景技术中指出的问题，本发明提供一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点及其检测引物，筛查结果客观，易于判读，检测引物对宫颈癌的特异性强，本发明与当前宫颈癌筛检实验进行并联使用时能很大程度的节约检查成本，避免太多假阳性病人因阳性结果而造成经济损失和心理负担。
由于甲基化是表观遗传学中最常见的DNA修饰方式，它在细胞生长、细胞分化、细胞增殖和疾病状态中起到了关键性的作用，尤其与癌症密切相关。因此，本发明是这样实现的，一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点，所用宫颈癌样本为通过手术切除获得浸润性鳞状上皮宫颈癌组织保存的蜡块标本，采用DNA甲基化芯片检测宫颈癌样本的全基因组DNA甲基化水平，进行甲基化差异位点分析、基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析，筛选出差异CpG位点，应用焦磷酸测序对筛选出的位点予以甲基化水平验证，再进行临床样本验证，对各位点甲基化做生存分析，得到阳性判断值。
所检测甲基化程度的甲基化位点为CHRM2基因的cg24575234位点、CHAD基因的cg06818777位点、FGF10基因的cg08361126位点以及ITGA8基因的cg08976810位点，将这些甲基化位点与阳性判断值相比，判断所检测的样本是否为宫颈癌，从而达到筛查宫颈癌的目的。
本发明进一步提供了一种检测宫颈癌样本基因甲基化水平的试剂盒，包括以下引物对：
(1)CHRM2基因的cg24575234位点：
F:ATAGGTTATAGATTAGTTAAGTGGTTGAGA，
R:AAAAAACCCACCCCAAAACTCTAAC；
(2)CHAD基因的cg06818777位点：
F:GAGAGAGGGAGGAGTTTTTTTAATTTATT，
R:CCTCCCATCCAAAACACCC；
(3)FGF10基因的cg08361126位点：
F:GGTTTAGTTGGTGGTTGGA，
R:AAACTAATTATCCTTAAAATAAAACTACA；
(4)ITGA8基因的cg08976810位点：
F:GTGGTGTTTGTAGATTTGAAGGTT，
R:TCCCCCAAAACAAAAAATAACTTT。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明能做到全程自动化，结果客观，易于判读，避免了主观因素的影响；且本发明检测筛查宫颈癌的特异性为100％，阳性预测值为100％，本发明提高了宫颈癌早筛的特异性和阳性预测值，减少过度医疗，节约卫生资源，从而弥补当前宫颈癌早筛检测的不足。
附图说明
图1是本发明实施例提供的甲基化位点cg06818777的ROC曲线图。
图2是本发明实施例提供的甲基化位点cg24575234的ROC曲线图。
图3是本发明实施例提供的甲基化位点cg08361126的ROC曲线图。
图4是本发明实施例提供的甲基化位点cg08976810的ROC曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点，所用宫颈癌样本为通过手术切除获得浸润性鳞状上皮宫颈癌组织保存的蜡块标本，标本来源于兰州市第一人民医院病理科，甘肃省人民医院病理科，2014年1月-2016年12月，经门诊或住院部接受检查、治疗的妇科患者。标本均经40.0g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色确诊处理，确保宫颈癌样本为侵入性鳞状细胞宫颈癌，按照FIGO(2000年)临床分期标准划分，宫颈癌样本为病例组，选取正常的宫颈组织作为对照组，正常的宫颈组织来自同期宫颈无病变的子宫肌瘤患者子宫全切标本。
采用Illumina infiniummethylation EPIC Beadchip，DNA甲基化850k芯片检测宫颈癌样本的全基因组DNA甲基化水平，进行甲基化差异位点分析、基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析，筛选出差异CpG位点，应用焦磷酸测序对筛选出的位点予以甲基化水平验证，再在The Cancer Genome Atlas中的宫颈癌数据集(cervicalsquamous cell carcinoma，CESC)中进行临床样本验证，GEO(GSE99511)(GSE46306)中进行临床样本验证，对各位点甲基化做生存分析，绘制ROC曲线，得到阳性判断值，即cutoff值。
所检测甲基化程度的甲基化位点为CHRM2基因的cg24575234位点、CHAD基因的cg06818777位点、FGF10基因的cg08361126位点以及ITGA8基因的cg08976810位点，将这些甲基化位点与阳性判断值相比，判断所检测的样本是否为宫颈癌，从而达到筛查宫颈癌的目的。
上述检测宫颈癌样本基因甲基化位点的甲基化水平的试剂盒包括以下引物对：
(1)CHRM2基因的cg24575234位点：
F:ATAGGTTATAGATTAGTTAAGTGGTTGAGA，
R:AAAAAACCCACCCCAAAACTCTAAC；
(2)CHAD基因的cg06818777位点：
F:GAGAGAGGGAGGAGTTTTTTTAATTTATT，
R:CCTCCCATCCAAAACACCC；
(3)FGF10基因的cg08361126位点：
F:GGTTTAGTTGGTGGTTGGA，
R:AAACTAATTATCCTTAAAATAAAACTACA；
(4)ITGA8基因的cg08976810位点：
F:GTGGTGTTTGTAGATTTGAAGGTT，
R:TCCCCCAAAACAAAAAATAACTTT。
实验检测结果分析：
(1)DNA甲基化850k芯片检测宫颈癌样本及正常对照组的全基因组DNA甲基化结果如表1所示。
表1 850k甲基化芯片检测候选基因的甲基化程度
序号 分组 cg06818777 cg24575234 cg08361126 cg08976810
1 正常对照 0.048944 0.071878 0.131656 0.036699
2 正常对照 0.094146 0.045626 0.080226 0.027228
3 正常对照 0.053191 0.092392 0.058331 0.046803
4 宫颈癌样本 0.714103 0.77854 0.715472 0.734564
5 宫颈癌样本 0.488079 0.517612 0.475043 0.337895
6 宫颈癌样本 0.629191 0.688399 0.671478 0.57276
7 宫颈癌样本 0.134458 0.262882 0.109272 0.060953
8 宫颈癌样本 0.115777 0.203317 0.119187 0.061237
9 宫颈癌样本 0.298459 0.463654 0.355243 0.232125
10 宫颈癌样本 0.487911 0.576867 0.481838 0.307612
11 宫颈癌样本 0.602531 0.597522 0.556726 0.472456
12 宫颈癌样本 0.6278 0.702364 0.559869 0.588853
(2)GSE46306中进行临床样本验证获得的数据集如表2所示。
表2 GSE46306采集的数据集
Figure BDA0001870113990000051
Figure BDA0001870113990000061
(3)用spss19统计分析并制作各候选甲基化位点的诊断ROC曲线
a).甲基化位点cg06818777的ROC曲线如图1所示，由图1可得到ROC曲线下的面积如表3所示。
表3甲基化位点cg06818777的ROC曲线下的面积
Figure BDA0001870113990000062
a：在非参数假设下；b：零假设：实面积＝0.5。
由表3及图1可知，甲基化位点cg06818777的ROC曲线下的面积为0.893，渐近Sig.b即P<0.01，最佳诊断值为0.2404，灵敏度66.7％，特异度为100.0％。
b).甲基化位点cg24575234的ROC曲线如图2所示，由图2可得到ROC曲线下的面积如表4所示。
表4甲基化位点cg24575234的ROC曲线下的面积
Figure BDA0001870113990000063
a：在非参数假设下；b：零假设：实面积＝0.5。
由表4及图2可知，甲基化位点cg24575234的ROC曲线下的面积为0.928，渐近Sig.b即P<0.01，最佳诊断值为0.1789，灵敏度86.7％，特异性为100.0％。
c).甲基化位点cg08361126的ROC曲线如图3所示，由图3可得到ROC曲线下的面积如表5所示。
表5甲基化位点cg08361126的ROC曲线下的面积
Figure BDA0001870113990000071
a：在非参数假设下；b：零假设：实面积＝0.5。
由表5及图3可知，甲基化位点cg08361126的ROC曲线下的面积为0.875，渐近Sig.b即P<0.01，最佳诊断值为0.2246，灵敏度80.0％，特异性为100.0％。
d).甲基化位点cg08976810的ROC曲线如图4所示，由图4可得到ROC曲线下的面积如表6所示。
表6甲基化位点cg08976810的ROC曲线下的面积
Figure BDA0001870113990000072
a：在非参数假设下；b：零假设：实面积＝0.5。
由表6及图4可知，甲基化位点cg08976810的ROC曲线下的面积为0.878，渐近Sig.b即P<0.01，最佳诊断值为0.1422，灵敏度80.0％，特异性为100％。
(4)HPV病毒在我国人群中的感染率大概为20％，而宫颈癌的发病率是9.84/10万，因此，用HPV DNA检测方法来检测宫颈癌的特异性为80％，阳性预测值为0.0475％；而本发明检测筛查宫颈癌的特异性为100.0％，阳性预测值为100％，即通过该检测可以将假阳性病人排除，与HPV DNA检测方法相比具有显著的优势。如果将本发明与当前宫颈癌筛检实验进行并联使用，将很大程度的节约检查成本，避免太多假阳性病人因阳性结果而造成经济损失和心理负担。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于宫颈癌筛查的甲基化位点，其特征在于，所述甲基化位点为CHRM2基因的cg24575234位点、CHAD基因的cg06818777位点、FGF10基因的cg08361126位点以及ITGA8基因的cg08976810位点。
2.如权利要求1所述的用于宫颈癌筛查的甲基化位点，其特征在于，包括检测基因甲基化水平的试剂盒，所述试剂盒包括以下引物对：
(1)CHRM2基因的cg24575234位点：
F:ATAGGTTATAGATTAGTTAAGTGGTTGAGA，
R:AAAAAACCCACCCCAAAACTCTAAC；
(2)CHAD基因的cg06818777位点：
F:GAGAGAGGGAGGAGTTTTTTTAATTTATT，
R:CCTCCCATCCAAAACACCC；
(3)FGF10基因的cg08361126位点：
F:GGTTTAGTTGGTGGTTGGA，
R:AAACTAATTATCCTTAAAATAAAACTACA；
(4)ITGA8基因的cg08976810位点：
F:GTGGTGTTTGTAGATTTGAAGGTT，
R:TCCCCCAAAACAAAAAATAACTTT。
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