CN104293974A - 人乳头瘤病毒核酸检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于诊断人乳头瘤病毒(HPV)感染的检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样本中HPV基因型以诊断其是否属于所述24个型中的某一型。属于生命科学和技术领域。本发明的方法包括一个以PCR为技术基础聚合酶链式反应(PCR)，包含针对多种型别的荧光标记的上游引物和未标记简并下游引物，在特定PCR条件下可在一个反应管中同时检测HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4和cp8304等24种型的DNA，毛细管变性凝胶电泳后利用测序仪读取数据，利用提供的软件直接将其分为具体的型。
Description
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断人乳头瘤病毒(HPV)感染的检测方法，以及利用该方法制成的试剂盒检测患者体内分离出的DNA样本中HPV基因型以诊断其是否属于所述24个型中的某一型。属于生命科学和技术领域。
背景技术：
由于感染HPV是引起子宫颈癌的一大原因，所以现在这一研究已成为子宫颈癌预防的前沿学科。在西方工业化国家，对于所有的恶性肿瘤疾病，子宫颈癌也许是公共预防措施做得最好的例子。
子宫颈癌是妇女中最常见的恶性肿瘤，主要发生于多产妇女的早期绝经期。每年全世界有约19万人死于子宫颈癌，而其中超过3/4的死亡发生在发展中国家。子宫颈癌的发生率在所有癌症中排名第七，而在妇女中排名第三，仅次于乳腺癌和大肠癌。在发展中国家，少于50％的患子宫颈癌的妇女能存活5年以上，而在发达国家，5年存活率是66％左右。
在过去的10年中，估计全世界每年有将近371000例新的侵入性子宫颈癌，占到整个妇女癌症的10％。子宫颈癌高发病区主要位于中南美洲、南非、东非和加勒比地区，这些地区每年的平均发病率达到万分之四。东欧和北美的发病率低于每年万分之三，但在巴西东北部，发病率要比北美高10倍，一生中累积风险性可高达10％。
现有子宫颈癌的筛查技术可分两类，基于形态学的方法是在细胞或组织水平检查以识别不正常，基于分子生物学的方法是检查子宫颈上皮瘤的子宫颈癌的标志物。进一步区分这些方法可根据他们释放借助于显微镜或物理和电光学的特性。表1总结了当前各种子宫颈癌筛查的方法，而其中最关联或最有先兆的方法总结在如下几节。
Pap细胞学：Pap检测是最早的癌症检测方法之一，毫无疑问，它同时也是现代医学中最有成效的一种方法。Pap检测主要是检查子宫颈癌先兆，通过重复检测，可以密切监测可疑的或低度异常，或提议病人立即进行阴道镜、细胞切片检查，并对高度或严重的损害进行治疗。通过Pap检测预防侵入性子宫颈癌，可在它还只是上皮组织时就阻止其恶性发展。
薄层液相为基础的细胞学：ThinPrepTM和Autocyte Prep系统是两种基于液体的用于代替传统Pap涂片的制片方法。从子宫颈取得的样本被溶于细胞保存液而不是直接涂在玻璃片上。通过这种方法几乎所有的细胞都可给予检测。在传统Pap涂片法中，约20％从子宫颈收集的细胞会被置于玻璃片上，而在薄层样本中，多余的血细胞和炎症细胞会被裂解，而含有 约50000细胞的随机样本会由自动细胞处理机转移到玻璃片，并形成一薄层涂片，这涂片经染色后由细胞技术员进行检查。这种自动的薄层技术可以使涂片更清晰、均一，并且没有血细胞、炎症细胞碎片和细胞集落这些影响显微镜检测的因子，从而提高对非典型细胞、癌症先兆和癌症的检出率。
自动化细胞学：自动化的系统正处于测试和市场推广的阶段。这些系统包括一种能自动把子宫颈癌细胞悬浮液制成标准薄层玻璃片的装置，及通过计算机辅助扫描来首先发现不正常细胞，并把这些涂片分离处理以便作进一步的人工细胞学检测。这些方法最关键的优点是可减轻因缺乏合格的细胞学家而引起的人员紧张。现在在北美和欧洲，有许多私人公司赞助的比较性实验正在验证这些自动化机器的筛查效率和经济效益。
醋酸法目视筛查(VIA)：在低收入国家，目查法已成为一种技术要求低、能代替细胞学筛查的方法。这些目查法包括直接检查子宫颈，借助醋酸的目查法(也称为直接目查DVI,子宫镜和辅助目查)，低倍镜醋酸目查(VIAM)，Lugol’s碘酒目查法(VILI)和子宫颈图像。
筛查中检查HPV：目前研究人员正在比较HPV检测与Pap检测作为子宫颈癌筛查方法的优缺点。由于HPV难以进行体外培养，而且不是所有的感染者都有可检测的抗体反应。因此，HPVDNA的检测是非介入式检测HPV感染最好方法。目前HPV检测的方法主要有三类：
第一类是直接探针结合，如southern印迹和点印迹，原位杂交过滤法等。这些方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐等缺点。
第二类是信号放大法，大多数的研究所采用的是唯一经FDA批准的Digene的第一和第二代Hybrid Capture(HC)系统。另一些用不同的PCR方法来检测HPV。相比于HC法，PCR的检测灵敏度更高，但第二代HC2的检测灵敏度已大大提高，接近于PCR的水平。HC2检查是通过微孔板化学发光信号扩增的核酸杂交技术，定性检查子宫颈样本中高危HPV病毒，这些病毒通常与子宫颈癌有联系，它们是：16、18、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
第三类是基于PCR的把序列片段扩增，PCR方法是用型别特异或通用引物扩增目标片段并与特异性探针杂交。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。
基于多重PCR技术所进行的分型技术有多种，包括：水解探针或Taqman探针、膜杂交、悬浮芯片等。相比较于水解探针或Taqman探针、膜杂交、悬浮芯片等具有分析灵敏度高等优点，缺点在于价格昂贵。本发明在使用荧光标记引物的基础上，通过优化引物序列和PCR反应体系，使用电泳后读取荧光的技术同样达到准确检测的目的。
目前进行HPV分型检测的产品有
1.上海之江生物科技有限公司的高危型人乳头瘤病毒(HPV)分型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)，分别检测13个型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
2.亚能生物技术(深圳)有限公司的人乳头瘤病毒基因分型(23型)检测试剂盒(PCR-反向点杂交法)，分别检测23个型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、6、11、42、43、44、53、66、73、82、83)。
3.上海透景生命科技有限公司的高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(流式荧光杂交法)，分别检测13个型别(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。
4.港龙生物技术(深圳)有限公司的人乳头瘤病毒分型检测试剂盒(基因芯片法)，分别检测26个型别(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、40、42、43、44、53、54、55、57、66、67、73)。
上述专利和产品，分别使用Taqman探针、膜杂交技术和悬浮芯片技术，存在通量低或易污染或者配套耗材价格高等问题使得难以进行应用于临床诊断。
基于上述内容，尽管HPV DNA检测已发展诸多技术，但开发一种操作简单、准确、便宜及具有多型HPV检测能力的方法是十分有用的。
发明内容：
已知与宫颈癌高度相关的HPV约有20多个型，能导致皮肤疣状病变的HPV约有5个型，临床上需要一种能针对多种HPV进行检测，尤其是能快速、准确和高通量的方法。结合了PGR的高灵敏度，DNA长度多样性和光检测的高精确性等优点，具有操作简单，结果直观和无污染的特点。
本方法涉及一种使用荧光标记的引物的PGR检测方法，本方法在在单一管中进行24个型别HPV(6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、53、66、73、83、MM4和cp8304)的检测，利用毛细管电泳后使用测序仪读取结果，判读所检测人乳头瘤病毒的具体型别。
为达到上述目的，采取的技术方案：
一种人类乳头瘤病毒检测的方法和试剂盒，其特征在于：
该试剂盒含有：
(1)DNA提取：NP-40；chelex100；TRIS-HCL；
(2)DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；UNG酶；
(3)PCR反应液：dNTPs，荧光标记引物，DNA聚合酶Buffer；
(4)PCR反应体系：DNA聚合酶选择Taq HSDNA聚合酶及荧光标记引物：
| 序列名称 | 核苷酸序列5’-3’ |
| 6 | TTTTAACTACATCTTCCACATACAC |
| 11 | TGTCTAAATCTGCTACATACAC |
| 16 | TTTTATTATGTGCTGCCTTATTTACTTC |
| 18 | TTTGCTTCTACACAGTCTCCT |
| 31 | TTATGTCTGTTTGTGCTGC |
| 33 | TATGTCTGTTTGTGCTGC |
| 35 | TATGCTATTAAAAAACAAGATTCT |
| 39 | TTTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTA |
| 42 | TTCATGACTTTTTGTGCCACTGC |
| 43 | TTTTTGCCTCTACTGACC |
| 44 | TCTACACAGTCCCCTCC |
| 45 | TTTTTTTGAGTCTTCCATACCTTCT |
| 51 | TTTTGCCTCTACACAAAAT |
| 52 | TTTTTTTTTCTGCTGCGGTTTCC |
| 53 | TTTTTCGCAACCACACAGTCTAT |
| 56 | TGTGCTGAGGATAAAAAG |
| 58 | TTTTTTTTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATA |
| 59 | TGGGGCACTGAAGTAACTAAGG |
| 66 | TTTTTAAAAACACATTAACTAA |
| 68 | TTTTTTTTTTATTGTCCACTACTACAGACTC |
| 73 | TTGTAGGTACACAGGCTAGTAG |
| 81 | TTTTTCACTGCTGTTACTCAATCTGT |
| 82 | TTTTGCTACACAGGCAAATGAATACACA |
| 83 | TGCTACATCTGCTGCT |
| 下游简并引物 | CGTCCMARRGGAWACTGATC |
表1
(5)标准品为为SIZ荧光标记引物扩增的长度为345、355、360、365、370和380的PCR产物。
将24个型的人类乳头瘤病毒分为4组，5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、TAMRA和ROX4种。分组和标记方法如下表所述。
| 组别 | 荧光标记物 | HPV型另 |
| A | FAM | 45，52，51，81，43，68 |
| B | HEX | 6，16，39，66，82，58 |
| C | TAMRA | 11，18，42，53，31，59 |
| D | ROX | 56，83，44，33，73，35 |
表2
根据扩增产物长度分为6组，分组方法如下表所述。
| 组别 | 长度 | HPV型别 |
| 1 | 345bp | 45，6，11，56 |
| 2 | 355bp | 52，16，18，83 |
| 3 | 360bp | 51，39，42，44 |
| 4 | 365bp | 81，66，53，33 |
| 5 | 370bp | 43，82，31，73 |
| 6 | 380bp | 68，58，59，35 |
表3
使用的方法为多重引物的PCR反应，由一组特异性上游引物和一条下游简并引物进行如下反应：
A)模板变性，特征在于，模板变性温度在95℃；
B)引物退火及延伸，特征在于，引物退火温度在52℃，延伸温度在72℃；
C)按A-B循环进行扩增，特征在于循环数为35-45个。
附图说明：
附图为从测序仪输出结果判断峰的标记荧光和所处通道图
具体实施方式：
实施案例：
人类乳头瘤病毒检测试剂盒检测新鲜的宫颈分泌物样本。
| 序列名称 | 核苷酸序列5’-3’ |
| 6 | TTTTAACTACATCTTCCACATACAC |
| 11 | TGTCTAAATCTGCTACATACAC |
| 16 | TTTTATTATGTGCTGCCTTATTTACTTC |
| 18 | TTTGCTTCTACACAGTCTCCT |
| 31 | TTATGTCTGTTTGTGCTGC |
| 33 | TATGTCTGTTTGTGCTGC |
[0048]
| 35 | TATGCTATTAAAAAACAAGATTCT |
| 39 | TTTGTGTTCTGCTGTGTCTTCTA |
| 42 | TTCATGACTTTTTGTGCCACTGC |
| 43 | TTTTTGCCTCTACTGACC |
| 44 | TCTACACAGTCCCCTCC |
| 45 | TTTTTTTGAGTCTTCCATACCTTCT |
| 51 | TTTTGCCTCTACACAAAAT |
| 52 | TTTTTTTTTCTGCTGCGGTTTCC |
| 53 | TTTTTCGCAACCACACAGTCTAT |
| 56 | TGTGCTGAGGATAAAAAG |
| 58 | TTTTTTTTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATA |
| 59 | TGGGGCACTGAAGTAACTAAGG |
| 66 | TTTTTAAAAACACATTAACTAA |
| 68 | TTTTTTTTTTATTGTCCACTACTACAGACTC |
| 73 | TTGTAGGTACACAGGCTAGTAG |
| 81 | TTTTTCACTGCTGTTACTCAATCTGT |
| 82 | TTTTGCTACACAGGCAAATGAATACACA |
| 83 | TGCTACATCTGCTGCT |
| 下游简并引物 | CGTCCMARRGGAWACTGATC |
表1
标准品为为SIZ荧光标记引物扩增的长度为345、355、360、365、370和380的PCR产物。
将24个型的引物分为4组，5′端标记荧光基团为是FAM、HEX、TAMRA和ROX4种。分组和标记方法如下表所述。
| 组别 | 荧光标记物 | HPV型另 |
| A | FAM | 45，52，51，81，43，68 |
| B | HEX | 6，16，39，66，82，58 |
| C | TAMRA | 11，18，42，53，31，59 |
| D | ROX | 56，83，44，33，73，35 |
表2
根据扩增产物长度将24个型别分为6组，分组方法如下表所述。
| 组别 | 长度 | HPV型别 |
| 1 | 345bp | 45，6，11，56 |
| 2 | 355bp | 52，16，18，83 |
| 3 | 360bp | 51，39，42，44 |
| 4 | 365bp | 81，66，53，33 |
[0056]
| 5 | 370bp | 43,82,31,73 |
| 6 | 380bp | 68,58,59,35 |
表3
1。新鲜的宫颈分泌物样本由XXX医院采集。
2。DNA提取：参照chelex-100法提取。
3。扩增和扩增产物的分析
3。1人类乳头瘤病毒(24分型)检测试剂盒
3。1。1PCR扩增体系
| 组份 | 体积 |
| 2×PCR Buffer | 20ul |
| Primers | 5ul |
| 模板 | 5ul |
| ddH2O | 10ul |
3。1。2PCR扩增程序
| 预变性 | 95℃ |
| 循环 | 95℃，5sec；52℃，5sec；72℃，10sec； |
| 延伸 | 10℃ |
| 保温 | 4℃ |
4。扩增产物在测序仪上荧光检测
先配置上样缓冲液(0。5ul内标+12ul去离子甲酰胺)×上样数。上样样品(12。5ul上样缓冲液+2。5ul扩增产物)混合。95℃变性3min，冰浴3min，毛细管电泳。使用ABI3130测序仪读取结果。
5。结果分析
步骤1，打开测序仪输出结果的峰值图，观察图上所出现的峰。如图所示，样品12处于FAM通道的355bp处，样品13处于HEX通道的355bp处。
步骤2，参看表2，使用FAM标记的有45，52，51，81，43，68；使用HEX标记的有6，16，39，66，82，58。
步骤3，参看表3，长度为355bp的有52，16，18，83。综上所述，样品12为hpv52型，样品13为hpv16型。
Claims (4)
1.一种人类乳头瘤病毒检测的方法和试剂盒，其特征在于：
该试剂盒含有：
(1)DNA提取：NP-40；chelex100；TRIS-HCL。
(2)DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；UNG酶。
(3)PCR反应液：dNTPs，荧光标记引物，DNA聚合酶Buffer。
(4)PCR反应体系：DNA聚合酶选择Taq HS DNA聚合酶及荧光标记引物，如表1。
表1
(5)标准品为为SIZ荧光标记引物扩增的长度为345、355、360、365、370和380的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的检测，其特征在于将24个型的人类乳头瘤病毒分为4组，5′端标 记荧光基团为是FAM、HEX、TAMRA和ROX4种。分组和标记方法如表2所述。
表2。
3.根据权利要求1所述的检测，其特征在于根据扩增产物长度分为6组，分组方法如表3所述。
表3。
4.根据权利要求1中的HPV荧光检测，使用的方法为多重引物的PCR反应，由一组特异性上游引物和一条下游简并引物进行如下反应：
A)模板变性，特征在于，模板变性温度在95℃。
B)引物退火及延伸，特征在于，引物退火温度在52℃，延伸温度在72℃。
C)按A-B循环进行扩增，特征在于循环数为35-45个。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN201310303335.6A CN104293974A (zh) | 2013-07-19 | 2013-07-19 | 人乳头瘤病毒核酸检测方法和试剂盒 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834545A (zh) * | 2017-03-13 | 2017-06-13 | 苏州市立医院 | 高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法 |
| CN111321206A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-06-23 | 杭州博日科技有限公司 | 五重荧光pcr的检测体系及其应用和产品 |
| WO2021115406A1 (zh) * | 2019-12-13 | 2021-06-17 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 检测人类乳头瘤病毒的方法和试剂盒 |
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2013
- 2013-07-19 CN CN201310303335.6A patent/CN104293974A/zh active Pending
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| CN111321206B (zh) * | 2020-03-06 | 2023-09-22 | 杭州博日科技股份有限公司 | 五重荧光pcr的检测体系及其应用和产品 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150121 |