CN105803110B

CN105803110B - 同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105803110B
Application number: CN201410854348.7A
Authority: CN
Inventors: 白艳军; 胡可; 姚见儿
Original assignee: Shanghai Tellgen Life Science Co ltd
Current assignee: Shanghai Tellgen Life Science Co ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN105803110A

Abstract

本发明涉及同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。首次揭示一种特别适合于诊断人乳头瘤病毒的分型和检测方法，所述检测方法经过合理的设计，适用于目前被广泛应用的四通道实时荧光定量PCR仪，不仅可以同时检测多种高危型病毒，而且检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应程序，进一步提高了扩增效率。

Description

同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及病毒诊断领域，更具体地，本发明涉及一种同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。

背景技术

宫颈癌是全球妇女中发病率仅次于乳腺癌的最常见的恶性肿瘤，世界范围内每年约有50万的宫颈癌新发病例。通过宫颈筛查可以将宫颈癌的发病率大大降低。

大量的流行病学和分子生物学研究证明人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)感染是宫颈癌和癌前病变发生的主要因素：世界卫生组织曾经在22个国家进行的调查结果显示，有99.9％的宫颈癌患者可以检测到HPV感染；国际癌症研究协会(IARC)1995年宣布HPV感染是宫颈癌的主要病因。人乳头瘤病毒是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒。目前已分离出130多种，约有30多种可以感染人的生殖道黏膜。大量的科学研究发现，HPV基因型不同，其致癌力、宫颈癌病理分型以及宫颈癌的预后均有所不同。根据HPV感染人生殖道黏膜后的致癌性不同将其分为高危和低危两大类别，低危型包括6、11、54、40、42、43和44等，以6和11最为常见；高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和83等，其中以16和18最为常见。目前WHO及IRAC确认的14种致宫颈癌的高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68。

对HPV进行分型检测可以预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔；更可以区分持续感染和一过性感染，以便及早进行治疗，以降低发生率和死亡率；用于手术后的追踪，确定是否将病灶清除干净，便于治疗后的随访；指导HPV疫苗的研究及使用。

HPV的检测技术发展很快，出现了很多HPV检测技术，大致可分为以下几种：(1)细胞学检查，如传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、计算机辅助细胞检查系统，此类技术操作简单、价格低廉、适宜作初步筛查，但应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、且无法进行HPV分型检测；(2)感染组织中HPV蛋白的检测，针对HPV抗原(主要是衣壳蛋白制备抗体)通过免疫学方法进行检测，如ELISA、免疫沉淀法等，此类方法原理明确、操作简单，但由于HPV至今尚不能在体外培养，且其免疫原型较弱，导致血清学方法检测灵敏度低；(3)HPV基因组检测，如Southern杂交法、原位杂交法、杂交捕获法、以及PCR类检测方法。

Southern杂交法是应用酚氯仿提取纯化DNA，通过限制酶消化、电泳、变性、转膜和放射性标记探针杂交鉴定HPV亚型。此法是以杂交片段大小与杂交的严格性为基础，具有较好的灵敏度，但也具有耗费人力、试验步骤复杂和使用放射性探针等缺点。

原位杂交法应用组织或细胞在病理切片上和分子探针进行HPV DNA杂交，既可观察组织学形态变化，又可检测HPV表达的状况，是理想的病理学检测及研究方法。目前国内尚缺乏稳定的探针，只可分为高危、低危型，操作较复杂，不适于大规模普查。

杂交捕获法原理是利用对抗体捕获信号放大和化学发光的检测。此为经美国FDA认证后用于30岁以上女性宫颈癌的初筛方法，仅用于细胞学标本，是国内妇科学会指定的检查方法。第二代杂交捕获法可检测13种高危型HPV。此种方法具有良好的灵敏度和特异性，但其存在交叉污染、费用昂贵、且不便于HPV分型等缺点。

PCR类检测方法不仅可以对HPV阳性感染进行确诊，还可以进行HPV分型，不足之处是一次反应检测的型别相对较少，尚难做到高通量分型检测。此类方法还需要找到合适的引物和/或探针，当进行多种亚型病毒共同检测时，往往由于引物条数较多，易于发生非特异性结合导致灵敏度降低，因此其对于检测试剂要求很高。

目前，本领域中存在一些用荧光PCR检测HPV病毒的试剂盒，如中山大学达安基因股份有限公司的高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(可检测9种HPV基因型，HPV16、18、31、33、45、52、56、58、67)。但是，这些试剂盒的试剂均仅基于L1区序列进行引物设计，这与人们对HPV的认知是相符的，因为L1区具有高度特异性。然而真是由于L1区的高度特异性导致了这些试剂盒存在不足，若想用一次PCR反应同时检测多种基因型，则需多对引物和多条探针，然而一个PCR反应中若引物和探针过多则会影响PCR反应的效率，严重影响检测试剂盒的特异性和灵敏度。因此中山大学达安基因股份有限公司仅能检测9种HPV病毒且仅能对HPV16和HPV18分型。

综上，本领域还需要进一步开发检测效果更为理想的HPV检测和分型试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时对多种人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的方法，所述方法包括：

(1)根据待测人乳头瘤病毒型别，分别提供特异性的扩增引物和检测探针：

(a)针对第1种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对1和检测探针1，该检测探针1连接荧光标记1，

(b)针对第2种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对2和检测探针2，该检测探针2连接荧光标记2，

(c)针对第3种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对3和检测探针3，该检测探针3连接荧光标记3，

(d)针对第4种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对4和检测探针4，该检测探针4连接荧光标记1或荧光标记5，

(e)针对第5种人乳头瘤病毒，提供特异性引物对5和检测探针5，该检测探针5连接荧光标记2或荧光标记6，

(f)针对第6-X种人乳头瘤病毒，分别提供各自的特异性引物对6～X和检测探针6～X，该检测探针6～X连接荧光标记3或荧光标记7，其中，X为7～100的正整数(如10、20、30、40、50、60、80)；

并且，提供(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接荧光标记4；

其中，荧光标记1～7是不同的；

(2)提供PCR反应管1和2，在反应管1中，加入(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；在反应管2中，加入(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；反应管1和2中还包括PCR反应试剂(如MgCl₂、热启动Taq酶、dNTP、PCR反应缓冲液等)；

(3)将待测样本加入到(2)的反应管1和2中，通过四通道实时荧光定量PCR仪分别检测，分别得出反应管1和反应管2的荧光信号，从而实现第1种～第5种人乳头瘤病毒的分型和第6～X种人乳头瘤病毒的检测(即：不分型的检出)。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断方法，也即其不以确诊疾病为最终目的。

在另一优选例中，反应管中包括PCR预混液，所述的引物以及探针被混合于所述的PCR预混液中。

在另一优选例中，所述的荧光标记1～7分别选自：VIC荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为MGB)；ROX荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ2)；FAM荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为MGB)；Cy5荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ3)；HEX荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ1)；TET荧光基团；JOE荧光基团；NED荧光基团；TAMRA荧光基团。

在另一优选例中，所述的人乳头瘤病毒是高危型人乳头瘤病毒；较佳地，所述的高危型人乳头瘤病毒是HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68；较佳地，所述的第1种～第5种人乳头瘤病毒是HPV16、18、52、33、58，所述的第6-X种人乳头瘤病毒是HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68；较佳地，所述的内参照是β-Globin。

在另一优选例中，针对HPV16型的引物对序列是SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；探针序列是SEQ ID NO:45；

针对HPV18型的引物对序列是SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；探针序列是SEQ IDNO:46；

针对HPV52型的引物对序列是SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；探针序列是SEQ IDNO:47；

针对HPV33型的引物对序列是SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；探针序列是SEQ IDNO:49；

针对HPV58型的引物对序列是SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；探针序列是SEQ IDNO:48；

针对HPV31型的引物对序列是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；

针对HPV35型的引物对序列是SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

针对HPV39型的引物对序列是SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；

针对HPV45型的引物对序列是SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；

针对HPV51型的引物对序列是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；

针对HPV56型的引物对序列是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；

针对HPV59型的引物对序列是SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；

针对HPV66型的引物对序列是SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；

针对HPV68型的引物对序列是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:31；

针对β-Globin的引物对序列是SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；探针序列是SEQ IDNO:25。

在另一优选例中，PCR扩增程序包括：

(1)95℃10分钟；

(2)95℃25秒，67℃20秒，进行10±1个循环；和

(3)95℃20秒，60℃35秒(较佳地，在此步进行荧光采集)，进行35±2个循环；

其中，温度或时间能在2％的上下范围内浮动。

在本发明的另一方面，提供一种用于同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒，所述试剂盒中包括：根据待测人乳头瘤病毒型别制备的特异性的扩增引物和检测探针：

(a)针对第1种人乳头瘤病毒的特异性引物对1和检测探针1，该检测探针1连接荧光标记1，

(b)针对第2种人乳头瘤病毒的特异性引物对2和检测探针2，该检测探针2连接荧光标记2，

(c)针对第3种人乳头瘤病毒的特异性引物对3和检测探针3，该检测探针3连接荧光标记3，

(d)针对第4种人乳头瘤病毒的特异性引物对4和检测探针4，该检测探针4连接荧光标记1或荧光标记5，

(e)针对第5种人乳头瘤病毒的特异性引物对5和检测探针5，该检测探针5连接荧光标记2或荧光标记6，

(f)针对第6-X种人乳头瘤病毒的各自的特异性引物对6～X和检测探针6～X，该检测探针6～X连接荧光标记3或荧光标记7，其中，X为7～100的正整数；和

(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接荧光标记4；其中，荧光标记1～7是不相同的。

在另一优选例中，该试剂盒包括反应管1和2；反应管1中，包括(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；反应管2中，包括(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；较佳地，反应管1和2中还包括PCR反应试剂(如MgCl₂、热启动Taq酶、dNTP、PCR反应缓冲液等)。

在另一优选例中，所述的荧光标记1～4分别选自：VIC荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为MGB)；ROX荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ2)；FAM荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为MGB)；Cy5荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ3)；HEX荧光基团(较佳地，其对应的猝灭基团为BHQ1)；TET荧光基团；JOE荧光基团；NED荧光基团；TAMRA荧光基团。

针对HPV31型的引物对序列是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；

针对HPV35型的引物对序列是SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

针对HPV39型的引物对序列是SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；

针对HPV45型的引物对序列是SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；

针对HPV51型的引物对序列是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；

针对HPV56型的引物对序列是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；

针对HPV59型的引物对序列是SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；

针对HPV66型的引物对序列是SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；

针对HPV68型的引物对序列是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:31；

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(但不限于)：质控品、阴性对照和/或说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A-D、不同酶浓度的PCR体系的扩增结果。A、B分别为A、B管优化前结果；C、D分别为A、B管优化后结果。图上的数字为HPV基因型简称。

图2A-D、不同PCR扩增程序的扩增结果。A、B分别为A、B管优化前结果；C、D分别为A、B管优化后结果。图上的数字为HPV基因型简称。

图3A-B、PCR体系中引物和探针不同浓度的下的扩增结果。A、B分别A、B管优化后结果。图上的数字为HPV基因型简称。

图4A-D、高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的试剂盒的特异性考察结果。A、B分别为阳性参考品A、B管检测结果。C、D分别为阴性参考品A、B管的检测结果。图上的数字为HPV基因型简称。

图5A-B、高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的试剂盒的灵敏度考察结果。A、B分别为A、B管。图上的数字为HPV基因型简称。

图6A-B、A管和B管Cy5通道灵敏度考察结果。cp/test：拷贝/次。

图7A-C、A管FAM、VIC、ROX通道灵敏度考察结果。

图8A-C、B管FAM、VIC、ROX通道灵敏度考察结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种特别适合于诊断人乳头瘤病毒(特别是高危型人乳头瘤病毒)的分型和检测方法(两管法)，所述检测方法经过合理的设计，适用于目前被广泛应用的四通道实时荧光定量PCR仪，不仅可以同时检测多种高危型病毒，而且检测程序简单易操作。本发明人还优化了PCR扩增反应程序，进一步提高了扩增效率。

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。

如本文所用，“目标核酸”是指感兴趣的核酸片段，其是一种高危型HPV特异性的。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(本发明中优选RNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。

鉴于HPV存在非常多的分型，临床检测中亟需找到经济、快捷的方法。以此为目的本发明人设计了适用于四通道实时荧光定量PCR仪的快速对5种HPV进行分型并同时对其它多种HPV进行检测的方法。作为本发明的优选方式，所述的HPV是高危型的HPV。

作为本发明的优选方式，首先确定一组需要分型或测定的HPV，在改组种，确定5种需要分型的HPV以及其它需要测定(不分型测定出)的HPV，并确定一种内参(较佳地为β-Globin)。针对所确定的测定方案，设计针对这些HPV的特异性引物和探针。在进行检测时，每次检测包含两个反应管，每管反应液均采用四种不同荧光基团标记的特定的探针，在一个反应管内同时指示4种目的片段的存在情况。在每管4个目的片段中，至少一个片段是内对照基因，其余的片段为HPV基因。

本发明人通过对大量临床数据的统计研究发现，HPV16和HPV18在全世界范围内有非常高的感染率，而根据中国的相关临床数据统计发现，在中国感染率较高的前五位基因型分别为HPV16，52，58，33，18。因此，作为本发明的优选方式，建立了两管法对HPV16、18、52、33、58五种常见高危型人乳头瘤病毒进行分型检测同时对HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68九种高危型人乳头瘤病毒进行不分型检测，通过在两个PCR管中分别应用适用于四通道PCR仪的四种荧光基团(连接于探针上)，实现在一个管中区分3种HPV型和1种内参照；另一管种区分2种HPV型、1种内参照以及一系列无需分型HPV。较佳地，采用β-Globin作为内参照。

本发明人经过筛选和反复试验，还提供了一类特别适合于诊断高危型人乳头瘤病毒(HPV)以及对HPV16、18、52、33、58进行分型以及其它高危型HPV检测的引物和探针。现有技术中人们一般局限于针对HPV的L1区来设计检测试剂，当针对多种HPV亚型时，往往引物、探针序列众多，导致扩增体系复杂。经过大量的实验和比较，本发明人将PCR扩增区域选定在L1区和L2区的交界处，这一部分区域的特点在于既有特异性，又有重叠性。基于此本发明人设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度统一的探针来识别。因此，本发明的引物和探针经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好、扩增效率高、灵敏度高，且可以同时检测多种高危型病毒，检测程序简单易操作。较佳地，所述的引物和探针如表2所示。

在引物设计时，应用同一条探针检测HPV35、39、45、51、56、66、68，并使得HPV39、68共用一条下游引物，如此设计使得需要合成的引物和探针数量尽可能少，扩增体系不至于过分复杂，但又能实现对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68进行检测，以及对HPV16、18、52、33、58进行分型，满足目前HPV检测方面的临床实际所需。

所述的探针连接有适合于甄别病毒型别的荧光基团。探针的前端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团，其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到HPV病毒DNA的存在。作为本发明的优选方式，以探针选择VIC作为特异性针对人乳头瘤病毒16和33的荧光基团、MGB作为对应的猝灭基团；ROX作为特异性针对人乳头瘤病毒18和58的荧光基团、BHQ2作为对应的猝灭基团；FAM作为特异性针对人乳头瘤病毒52和特异性针对人乳头瘤病毒35，39，45，56，66，68型的探针以及特异性针对人乳头瘤病毒31、51、59型探针的荧光基团，MGB作为对应的猝灭基团；选择Cy5作为特异性针对内参考品人基因组生物β-Globin基因的荧光基团，选择BHQ3作为β-Globin的猝灭基团。

根据临床检测的需要，利用荧光定量PCR的技术进行HPV病毒分型及检测。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。包括优化了PCR预混液的添加量，优化了PCR程序，优化了引物的添加量。

本发明还优化了PCR检测流程，采用两步退火法进行PCR扩增，包括：(1)95℃10分钟；(2)95℃25秒，67℃20秒，进行10±1个循环；和(3)95℃20秒，60℃35秒，进行35±2个循环。采用两步退火法避免了检测过程中的非特异性反映，并使得扩增效果更为理想。

对于PCR反应体系，本发明人发现，由于涉及多对引物及探针同时检测，引物、探针的终浓度对PCR反应的影响是较为明显的。因此，本发明人个性化地优化了引物探针在PCR体系中的浓度，使得PCR反应后，Ct值相对集中，达到理想效果。

应理解，在不优化的情况下能够实现技术效果，而进行PCR扩增程序和扩增体系的优化后，则效果更为理想。

本发明的检测试剂被置于试剂盒中，从而便于人们应用。除了引物和探针试剂，试剂盒中还可包含：PCR反应液，质控品，阴性对照和/或使用说明书。

本发明高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型的方法及试剂盒可供医疗机构定性检测人宫颈脱落细胞样本中的人乳头瘤病毒核酸，作辅助诊断宫颈癌用。本发明设计病毒核酸的检测技术，提供一种高灵敏度、高特异性、操作简便，检测周期短的人乳头瘤病毒核酸检测和分型方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、引物和探针设计

为了开发适用于同时检测14种乳头瘤病毒基因型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)的检测试剂，本发明人针对各病毒基因序列进行了深入研究，筛选适用于设计特异性引物和探针的区段。经过反复研究比对后，选定以HPV的L1区和L2区中间重叠部分的基因序列作为设计的主要区域，进一步地，确定了针对每一HPV基因型的特异性目的片段(即PCR扩增片段)，如表1所示。

表1

根据表1所确定的区域，本发明人进一步设计了特异性引物和探针，同时考虑了两端的引物和探针具有兼并性，以减少多重PCR体系中的引物和探针数量。所设计的引物和探针如表2所示。并且，在设计引物探针时，基于在一个PCR管中分型HPV16、18、52；另一管中分型33、58以及检测其它高危型HPV为分型检测目的。所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2

实施例2、PCR反应体系中热启动Taq酶浓度的优化

目的：优化PCR预混液的添加量来达到的，优化反应体系中的热启动Taq酶浓度，进而优化PCR反应体系。

通过对目前市场上的已有的较为成熟的荧光定量PCR预混液的筛选，筛选得到康为世纪生物科技有限公司的2×GoldStarTaqMan Mixture(Cat:CW0932)最适合本发明的试剂盒。

模板：用含有1ng/μL人基因组(从正常人血液中抽提得到)的TE分别将14种HPV阳性参考品(包含HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68，选定各病毒的L1区和L2区序列，由上海翰宇生物科技有限公司合成质粒)稀释至10⁴拷贝/μL作为本次实验的模板。

引物探针混合液配方：将引物稀释到100μM，引物反应终浓度约为0.08μM，配制混合液时1个PCR反应中需要加入100μM的引物储存液量约为0.02μL。将探针稀释到100μM，探针反应终浓度为0.027μM，配制混合液时1个PCR反应中需要加入100μM的探针储存液量约为0.007uL。1个PCR反应中加入引物探针混合液的体积为10uL，加入体积不足部分补充纯化水。

A管引物探针混合液中加入表2检测HPV16、18、52和β-Globin的引物和探针；B管引物探针混合液中加入检测HPV33、58、31、35、39、45、51、56、59、66、68和β-Globin的引物和探针。

PCR反应体系如表3所示。

表3

检测仪器为ABI 7500荧光定量PCR仪。

PCR扩增程序见表4。

表4

A管的检测结果如图1A所示，因此，采用本发明的设计方案，可以实现对HPV16、18、52、33、58的分型，以及对其它几种高危型HPV(HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68)的检测。

但是，A管检测的目的基因为HPV16、18、52阳性参考品检测结果均为阳性，但检测HPV39参考品时出现一定的非特异性反应(箭头所示)。B管检测结果如图1B所示，阳性参考品HPV33、58、31、35、39、45、51、56、59、66、68检测结果均为阳性但检测HPV39参考品时出现非特异性反应(箭头所示)。因此对于反应体系进一步优化。

为了克服上述非特异性扩增的情况，本发明人确定调整PCR预混液的用量(也即减少Taq酶的添加量)，调整后的PCR反应体系如表5所示。

表5

A管的检测结果如图1C所示，B管检测结果如图1D所示。可看出减少Taq酶的用量后各个阳性样本的Ct值明显后移，但消除了非特异性反应。

可见，优化后，可以更为有效地对HPV16、18、52、33、58进行分型，以及对其它几种高危型HPV(HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68)的检测。

实施例3、PCR扩增方法的优化

1、从退火温度来优化

模板：除实施例2中所述的14种阳性参考品，再增加2种阴性参考品(HPV6和HPV11，选定其L1区和L2区序列，由上海翰宇生物科技有限公司合成质粒)，采用1ng/μL人基因组TE将上述参考品稀释至浓度为1000拷贝/μL。

引物探针混合液配方：与实施例2中相同。

PCR反应体系如实施例2中的表5所示。

将PCR反应的退火提高至65℃，反应程序如表6所示。

表6

A管的检测结果如图2A所示，所有阳性参考品的检测结果均为阳性，所有阴性参考品的检测结果均为阴性。B管检测结果如图2B所示，阳性参考品HPV51呈现阴性，可进一步优化反应体系。

2、通过PCR程序来优化

模板、引物探针混合液、以及PCR反应体系均与前面“1”相同。

PCR扩增程序：在ABI7500上进行PCR反应。PCR扩增程序见表7。

表7

A管检测结果如图2C所示，B管检测结果如图2D所示，所有阳性参考品的检测结果均为阳性，所有阴性参考品的检测结果均为阴性。达到理想效果。

综上，上述优化后，可以更为理想地对HPV16、18、52、33、58进行分型，以及对其它几种高危型HPV(HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68)的检测。

实施例4、引物和探针浓度的优化

实施例1～3中已对PCR反应体系和扩增程序进行了优化，所有阳性样本的检测结果均为检测结果均为阳性，所有阴性样本的检测结果均为阴性，但可明显看出所有相同浓度的阳性参考品的Ct值相对有些分散。因此，本发明人进一步进行了反应条件摸索，最终发现优化引物浓度有利于解决Ct值分散的问题。

模板：引物和探针浓度优化所有实验所采用的模板为用TE稀释的实施例3中所提及的14种阳性参考品和2种阴性参考品。

扩增程序为实施例3中“2”优化后的程序。

本发明根据各次结果调整各对引物和探针的浓度。反应液中各引物和探针的终浓度见表8和表9。

表8、A管反应液的最终配方

表9、B管反应液的最终配方

结果如图3A和3B所示，所有阳性参考品的Ct值相对集中，达到理想效果。

根据上述实施例1～4的实验结果，本发明制订了本发明所述的试剂盒的PCR结果判读方法：

a.基线和阈值的设定：以1～5个循环的荧光信号为基线；阈值：使阈值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct为Undet。

b.质控对照：阴性对照Ct均应显示为Undet；阳性对照Ct值均≤30。

c.结果判断：判定Fam、Vic、Rox通道的Ct值为Undet或者Ct值>30的样本为HPV阴性；判定Ct≤30且增长曲线呈S型曲线的样本为HPV阳性；判定β-Globin(Cy5通道)的Ct值≤32则测试结果有效，若该通道Ct值为Undet或者Ct值>32则该样本需重新检测。

实施例5、反应体系的特异性考察

阳性参考品：国家分型参考品(购自SDA，包括HPV16、18、31、33、35、45、56、58、59、66)和上海翰宇生物科技有限公司合成的HPV39、51、52、68参考品(如实施例2)的混合物。

阴性参考品：为国家分型参考品(购自SDA)，包括高危型人乳头瘤病毒核酸检测和分型试剂盒的检测范围外的10种HPV基因型(HPV6、11、26、61、67、69、71、73、81、82)。

检测方法：用含有1ng/μL人基因组的TE溶液将上述国家分型的阴性和阳性参考品稀释至100拷贝/μL，以此作为模板检测反应体系特异性。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。

检测结果如图4所示。A管检测阳性样本如图4A中所示，B管检测阳性样本结果如图4B中所示，所有阳性参考品的Ct值均小于30，β-Globin的Ct值小于32(箭头所指区域)。如图4C所示所有阴性参考品A管的检测结果显示为阴性，如图4D所示所有阴性参考品B管的检测结果显示为阴性，且β-GlobinCt值小于32检测结果有效。本发明的反应体系无假阴性和假阳性现象，能够准确而明确地区分14种致宫颈癌的高危型HPV基因型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。

实施例6、反应体系的灵敏度考察

1.灵敏度的整体考察

检测方法：用含有1ng/μL人基因组的TE溶液将上述14种阳性参考品稀释至20拷贝/μL，以此作为模板检测反应体系特异性。采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。每个样本重复检测5次。

检测结果如图5所示，所有阳性参考品的Ct值均小于30，β-Globin的Ct值小于32。结果显示，本发明的反应体系对14种致宫颈癌的高危型HPV基因型灵敏度均可达到100拷贝/实验。

2.分别考察四个通道的灵敏度

为了进一步考察本试剂盒的灵敏度，基于1中的实验结果，本发明对四个荧光通道分别进行检测。

采用前面实施例4中优化的PCR流程以及引物探针浓度进行实验。为了准确验证灵敏度，每个实验重复24次。

首先考察Cy5通道的灵敏度。用TE将人基因组分别稀释至100拷贝/实验、200拷贝/实验、500拷贝/实验、1000拷贝/实验(之前用的1ng/μL人基因组相当于1700拷贝/实验)作为本次实验的模板。实验结果如图6A(A管)和6B(B管)所示，当人基因组浓度为100拷贝/实验时，β-Globin的Ct值在29至31之间，接近临界值，因此，可判定本发明的试剂盒对于β-Globin灵敏度可达到100拷贝/实验。

考察A管ROX通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV18稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。实验结果如图7A所示，当HPV18参考品浓度为25拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在25至28之间，小于30。因此，可判定本发明的试剂盒对于HPV18灵敏度可达到25拷贝/实验。

考察A管VIC通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV16稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。为了准确验证灵敏度，每个实验重复24次。实验结果如图7B所示当HPV16参考品浓度为25拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至28之间，小于30。因此，可判定本发明的试剂盒对于HPV16灵敏度可达到25拷贝/实验。

考察A管FAM通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV52稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。实验结果如图7C所示，当HPV52参考品浓度为25拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在28至30之间，但无S形曲线。HPV52参考品浓度为50拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在26至30之间小于30，有S形曲线。因此，判定本发明的试剂盒对于HPV52灵敏度可达到50拷贝/实验。

考察B管ROX通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV58稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。实验结果如图8A所示，当HPV58参考品浓度为25拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在25至28之间，小于30。因此，可判定本发明的试剂盒对于HPV58灵敏度可达到25拷贝/实验。

考察B管VIC通道的灵敏度。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV33稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。实验结果如图8B所示，当HPV33参考品浓度为50拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在24至28之间，小于30。因此，可判定本发明的试剂盒对于HPV33灵敏度可达到50拷贝/实验。

考察B管FAM通道的灵敏度。根据1中实验，HPV68的Ct值最大，因此Fam通道的灵敏度检测针对HPV31进行。用1ng/μL人基因组将国家分型参考品HPV68稀释至25拷贝/实验、50拷贝/实验作为本次试验的模板。实验结果如图8C所示，当HPV68参考品浓度为25拷贝/实验时，24次的实验结果中ROX通道的Ct值在28至30之间小于30。因此，判定本发明的试剂盒对于HPV52灵敏度可达到25拷贝/实验。

综上所述，本发明的试剂盒对于β-Globin灵敏度均可达到100拷贝/实验。对于HPV18和HPV16敏度均可达到25拷贝/实验。对于其它12种HPV基因型灵敏度均可达到50拷贝/实验。因此综合而言，其灵敏度非常理想。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的方法，其特征在于，所述方法包括：

(f)针对第6-14种人乳头瘤病毒，分别提供各自的特异性引物对6～14和检测探针6～14，该检测探针6～14连接荧光标记3或荧光标记7；

其中，荧光标记1～7是不同的；

(2)提供PCR反应管1和2，在反应管1中，加入(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；在反应管2中，加入(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；反应管1和2中还包括PCR反应试剂；

(3)将待测样本加入到(2)的反应管1和2中，通过四通道实时荧光定量PCR仪分别检测，分别得出反应管1和反应管2的荧光信号，从而实现第1种～第5种人乳头瘤病毒的分型和第6～14种人乳头瘤病毒的检测；

其中，所述的第1种～第5种人乳头瘤病毒是HPV16、18、52、33、58，所述的第6-14种人乳头瘤病毒是HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68；

针对HPV16型的引物对序列是SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；探针序列是SEQ ID NO:45；

针对HPV18型的引物对序列是SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；探针序列是SEQ ID NO:46；

针对HPV52型的引物对序列是SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；探针序列是SEQ ID NO:47；

针对HPV33型的引物对序列是SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；探针序列是SEQ ID NO:49；

针对HPV58型的引物对序列是SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24；探针序列是SEQ ID NO:48；

针对HPV31型的引物对序列是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；

针对HPV35型的引物对序列是SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

针对HPV39型的引物对序列是SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；

针对HPV45型的引物对序列是SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；

针对HPV51型的引物对序列是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；

针对HPV56型的引物对序列是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；

针对HPV59型的引物对序列是SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；

针对HPV66型的引物对序列是SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；

针对HPV68型的引物对序列是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:31；

其中，所述的方法为非诊断方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光标记1～7分别选自：VIC荧光基团；ROX荧光基团；FAM荧光基团；Cy5荧光基团；HEX荧光基团；TET荧光基团；JOE荧光基团；NED荧光基团；TAMRA荧光基团。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内参照是β-Globin。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，针对β-Globin的引物对序列是SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；探针序列是SEQ ID NO:25。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序包括：

(1)95℃10分钟；

(2)95℃25秒，67℃20秒，进行10±1个循环；和

(3)95℃20秒，60℃35秒，进行35±2个循环；

其中，温度或时间能在2％的上下范围内浮动。

6.一种用于同时对6种以上人乳头瘤病毒进行分型及检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：根据待测人乳头瘤病毒型别制备的特异性的扩增引物和检测探针：

(f)针对第6-14种人乳头瘤病毒的各自的特异性引物对6～14和检测探针6～14，该检测探针6～14连接荧光标记3或荧光标记7；和

(g)针对内参照的特异性引物对0和检测探针0，该检测探针连接荧光标记4；其中，荧光标记1～7是不相同的；

其中，该试剂盒包括反应管1和2；反应管1中，包括(a)～(c)以及(g)的引物对和探针；反应管2中，包括(d)～(f)以及(g)的引物对和探针；所述的第1种～第5种人乳头瘤病毒是HPV16、18、52、33、58，所述的第6-14种人乳头瘤病毒是HPV31、35、39、45、51、56、59、66、68；

针对HPV31型的引物对序列是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；

针对HPV35型的引物对序列是SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

针对HPV39型的引物对序列是SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；

针对HPV45型的引物对序列是SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；

针对HPV51型的引物对序列是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；

针对HPV56型的引物对序列是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；

针对HPV59型的引物对序列是SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；

针对HPV66型的引物对序列是SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；

针对HPV68型的引物对序列是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:31。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，该反应管1和2中还包括PCR反应试剂。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光标记1～4分别选自：VIC荧光基团；ROX荧光基团；FAM荧光基团；Cy5荧光基团；HEX荧光基团；TET荧光基团；JOE荧光基团；NED荧光基团；TAMRA荧光基团。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的内参照是β-Globin。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，针对HPV16型的引物对序列是SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；探针序列是SEQ ID NO:45；

针对HPV31型的引物对序列是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；

针对HPV35型的引物对序列是SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

针对HPV39型的引物对序列是SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31；

针对HPV45型的引物对序列是SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；

针对HPV51型的引物对序列是SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35；

针对HPV56型的引物对序列是SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37；

针对HPV59型的引物对序列是SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39；

针对HPV66型的引物对序列是SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；

针对HPV68型的引物对序列是SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:31；

针对β-Globin的引物对序列是SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44；探针序列是SEQ ID NO:25。