CN107828919A - 适用于四荧光通道的单管检测多个高危型hpv的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒，该试剂盒至少包括有分别对应HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68这14个基因型的特异性探针SEQ ID NO.1‑14；以及综合对应该14个基因型的5个正向引物和7个反向引物。本发明通过对现有HPV核酸检测试剂盒配方的改进，使得本申请的技术方案可以仅使用5个正向引物和7个反向引物就能够在四荧光通道的仪器中在单管反应中同时实现高灵敏度、高特异性地检测14种高危型人乳头瘤病毒。

Description

适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒，尤其涉及一种适用于四荧光通道的单管检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68共14种HPV基因型的试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种嗜上皮性双链DNA球形病毒，属于乳头瘤病毒科，主要感染皮肤和粘膜组织。HPV感染可引起疣、良性肿瘤和癌症。目前已有证据显示HPV感染可以导致包括宫颈癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、口咽癌等多种癌症。据国际人乳头瘤病毒参考中心(International Human Papillomavirus Reference Center)的最新统计，目前共发现超过200种HPV基因型。然而并不是所有的HPV基因型均可以诱发癌症。低危型HPV的感染可以诱发生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤等良性病变，只有为数不多的高危型HPV的感染可能致癌。目前了解最深入的HPV致癌的范例是女性宫颈癌。也正是因为在这方面的先驱性工作，德国科学家Harald zur Hausen于2008年获得诺贝尔生理学和医学奖。
宫颈癌是发生在女性子宫下段宫颈处的恶性肿瘤，是女性中第4位高发恶性肿瘤，占妇女癌症死亡率的第4位。据国际卫生组织(WHO)的国际癌症研究中心(IARC)报道，2012年全球宫颈癌新发病例为52.8万例，约有26.6万妇女死于宫颈癌。几乎所有宫颈癌的发生都是高危型HPV的持续感染导致的，而且从最初感染到癌症的发生需要经历5到10年的时间。因此，利用以高危型HPV的遗传物质DNA作为检测对象的HPV分子诊断技术来进行宫颈癌筛查，可以提前发现病因，有效地对宫颈癌进行早期预防，从而降低发病率和死亡率。与醋酸目测检查、巴氏涂片和液基细胞学等传统宫颈癌筛查手段相比，HPV分子诊断具有灵敏度高且不依赖病理医生的主观判断的优势。因此，HPV分子诊断已经成为当前发达国家宫颈癌筛查的首选方法。
HPV分子诊断技术最大的一个挑战是在保证检测灵敏度的同时有效地将高危型HPV与低危型HPV区分开来，以避免因误诊而造成的过度诊断和过度治疗以及由此对患者产生的不必要的精神压力。如前所述，目前发现的HPV基因型已经超过200种，而根据WHO/IARC等权威机构的研究成果，其中只有14种基因型被定义为可以诱发宫颈癌的高危型，即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。此外，即使是14种高危型HPV中也并不是每一种基因型都具有相同的致癌能力。HPV16和18是其中危害最大的两个基因型，二者分别导致55％和15％的宫颈癌病例。因此，能够对HPV16和18进行分型的高危型HPV分子诊断技术对于HPV检测阳性患者的分流具有独到的优势。再有，并不是所有宫颈部位感染了高危型HPV的患者就一定会罹患宫颈癌，大部分此类感染为一过性感染，即人体自身的免疫功能可以在6到24个月内有效地将其清除。高危型HPV能否被免疫系统清除的决定因素是多方面的，既包括患者免疫系统清除感染的能力，也包括所感染HPV的病毒载量。多年来的流行病学研究显示高危型HPV感染存在一个临床阈值。病毒载量低于这一阈值的高危型HPV感染往往是一过性感染，很少会诱发宫颈癌；而病毒载量高于这一阈值的感染诱发宫颈癌的几率将大大升高。因此，用于宫颈癌早期筛查的高危型HPV分子诊断技术还应该具有一定的定量能力以区分低载量的一过性感染和可能最终诱发宫颈癌的高载量感染。
目前针对HPV核酸的检测方法主要有杂交捕获法、PCR-反向点杂交法、液态芯片法和荧光定量PCR法等。针对上述用于宫颈癌早期筛查的高危型HPV分子诊断技术的特点以及其它方面的性能指标，下表中概括了这几种方法的主要优缺点：
由上表可以看出，从方法学角度考虑，目前最能满足宫颈癌早期筛查要求的检测手段是荧光定量PCR技术。该技术的灵敏度和特异性均高于杂交捕获法而与PCR-反向点杂交法和液态芯片法相当。荧光定量PCR法还可以对检测对象在很大跨度范围内进行精确定量，而利用PCR终产物与固定于薄膜或微球上的探针杂交实现靶序列检测的PCR-反向点杂交法和液态芯片法则不能定量。
但是，在现有技术中，采用荧光定量PCR技术进行HPV核酸检测，需要针对每一种HPV基因型提供一个特异性探针、一个正向引物和一个反向引物，在单管反应中同时检测多个HPV基因型时，若干组特异性探针、正向引物和反向引物势必会引起更多的非特异性结合，这在一定程度上影响了检测的灵敏度和精准度。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明旨在提供一种高灵敏度、高特异性的适用于四荧光通道的并且可以在一管荧光定量PCR反应中同时检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68共14种HPV基因型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒，其至少包括有分别对应HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68这14个基因型的特异性探针SEQID NO.1-14；
以及综合对应该14个基因型且数量分别少于14个的正向引物和反向引物。
优选的是，所述的试剂盒，其中，综合对应14个基因型的正向引物数量为5个，分别为：SEQ ID NO.15-19。
优选的是，所述的试剂盒，其中，综合对应14个基因型的反向引物数量为7个，分别为：SEQ ID NO.20-26。
优选的是，所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因互补配对的特异性探针SEQ ID NO.27。
优选的是，所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因互补配对的正向引物SEQ ID NO.28和反向引物SEQ ID NO.29。
本发明的有益效果是：本发明通过对现有HPV核酸检测试剂盒配方的改进，使得本申请的技术方案可以仅使用5个正向引物和7个反向引物就能够在四荧光通道的仪器中在单管反应中同时实现高灵敏度、高特异性地检测14种高危型人乳头瘤病毒。
5个正向引物和7个反向引物中的每一个引物并不是只单独作用于14种高危型HPV中的一种，而是同时贡献于多个HPV基因型，而5个正向引物和7个反向引物作为一个整体，恰好满足了同时贡献扩增14种高危型HPV的需求。
附图说明
图1为2个不同批次的本发明试剂盒对同一组标准品的检测结果对比图；其中，图1A为HPV Ct值；图1B为HBB Ct值；标准品溶液的组成和各组份的浓度见下表3。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
下面列出本案一实施例的适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒，其至少包括有分别对应HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68这14个基因型的特异性探针SEQ ID NO.1-14；
以及综合对应该14个基因型且数量分别少于14个的正向引物和反向引物。
其中，综合对应14个基因型的正向引物数量为5个，分别为：SEQ ID NO.15-19。
其中，综合对应14个基因型的反向引物数量为7个，分别为：SEQ ID NO.20-26。
其中，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因(HBB)互补配对的特异性探针SEQ ID NO.27。
其中，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因互补配对的正向引物SEQ ID NO.28和反向引物SEQ ID NO.29。
当然，试剂盒中还优选包括完成荧光定量PCR反应所需的助剂，例如：PCR缓冲液、4种dNTP混合液、热启动聚合酶等等。
表1示出具体引物和探针的序列：
表1
表1中，HPV16探针(SEQ ID NO.1)使用的荧光基团为JOE；HPV18探针(SEQ IDNO.2)使用的荧光基团为CY5；HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68这12个探针(SEQ ID NO.3-14)使用的荧光基团为ROX；SEQ ID NO.27所使用的荧光基团为TAMRA。
表2提供一具体实施例的包括上述所有引物和探针、可以同时检测全部14种HPV基因型、用于单管多重荧光定量PCR的PCR反应液。该反应液配方见表2：
表2
为了验证本发明试剂盒的技术性能，制备了14个分别包含上述14个HPV基因型的DNA靶序列的质粒，并与人体基因组DNA混合来制备不同组份及不同浓度的标准品。向标准品中加入人体基因组DNA的目的在于模拟临床样本中必然存在的人体DNA。这些标准品中的人体基因组DNA由来源于T细胞白血病患者的Jurkat培养细胞纯化而得。
实施例1：
为了验证本发明试剂盒配方的稳定性，两个实验员于不同日期使用2套不同批次的原材料试剂制备了2个不同批次的试剂盒，并用所得试剂盒对同一组标准品进行检测。所得结果显示2批试剂盒的检测结果非常相近(表3和图1)。
表3.两个不同批次的本发明试剂盒检测同一组标准品所得结果总结。
实施例2：
以290例临床样本为检测对象，完成了本发明试剂盒与瑞士罗氏公司(Roche)cobas 4800HPV试剂盒的对比实验。与本发明试剂盒相似，cobas试剂盒也是利用荧光定量PCR技术检测这14种高危HPV基因型，并可以对HPV16和18实现分型，而其它12种基因型则由同一个荧光通道检测。由某第三方临床检验机构首先按照cobas试剂盒说明书完成对这些样本的检测。本案针对剩余的样本，使用DNA提取试剂盒(参见《宫颈细胞保存及DNA快速提取一体试剂盒和提取方法》，申请号：201510896289.4)完成样本中DNA的提取；而后使用本发明试剂盒对纯化后的DNA进行检测。该对比实验结果显示两个试剂盒的检测结果的总体一致率达到93.8％(表4)。
表4.本发明试剂盒与cobas试剂盒以临床样本为对象的对比实验结果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
编号 名称 序列 两端修饰
SEQ ID NO.1 HPV16探针 TTATGTGCTGCCATATCTACTTCAGAAACT 5'-JOE,3'-BHQ1
SEQ ID NO.2 HPV18探针 CTACACAGTCTCCTGTACCTG 5'-CY5,3'-BHQ2
SEQ ID NO.3 HPV31探针 GTGCTGCAATTGCAAACAGTGATACTAC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.4 HPV33探针 CTTTATGCACACAAGTAACTAGTGAC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.5 HPV35探针 CTGCTGTGTCTTCTAGTGACAG 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.6 HPV39探针 CTATAGAGTCTTCCATACCTTCTAC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.7 HPV45探针 CCTGTGCCAAGTACATATGACCC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.8 HPV51探针 CTGCGGTTTCCCCAAC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.9 HPV52探针 ACTTTATGTGCTGAGGTTAAAAAGG 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.10 HPV56探针 CTGCTACAGAACAGTTAAGTAAATATG 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.11 HPV58探针 TATGCACTGAAGTAACTAAGGAAGG 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.12 HPV59探针 CTACTTCTTCTATTCCTAATGTATACAC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.13 HPV66探针 CTAAATATGATGCCCGTGAAATCAATC 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.14 HPV68探针 CTGAATCAGCTGTACCAAATATTTATG 5'-ROX,3'-BHQ2
SEQ ID NO.15 正向引物1 TGGTAGATACTACACGCAGTAC 无
SEQ ID NO.16 正向引物2 TTGTTTGTTACTGTAGTTGATAC 无
SEQ ID NO.17 正向引物3 CAGCTTTTTATTACCTGTGTTG 无
SEQ ID NO.18 正向引物4 CAATTGTTTTTAACAGTTGTAG 无
SEQ ID NO.19 正向引物5 CAATTATTTCTTACTGTTGTGG 无
SEQ ID NO.20 反向引物1 GCACAGTTGAAAAATAAACTGTAA 无
SEQ ID NO.21 反向引物2 GCACAATTGAAAAATAAATTGTAAA 无
SEQ ID NO.22 反向引物3 GCATAACTGAAATATAAATTGTAAA 无
SEQ ID NO.23 反向引物4 CATAATTGAAAAATAAATTGCAATTC 无
SEQ ID NO.24 反向引物5 GCAAAGCTGAAAAACAAACTGTAAG 无
SEQ ID NO.25 反向引物6 CAAACTGTAGTTCATATTCCTCCAC 无
SEQ ID NO.26 反向引物7 CAACTGAAATATAAATTGCAAATC 无
SEQ ID NO.27 HBB探针 GCTCCTGGGAGTAGATTG 5'-TAMRA,3'-BHQ2
SEQ ID NO.28 HBB正向引物 CCAGAAGAGCCAAGGACAGGTACG 无
SEQ ID NO.29 HBB反向引物 TTTGAGGTTGCTAGTGAACACAG 无

Claims (5)

1.一种适用于四荧光通道的单管检测多个高危型HPV的试剂盒，其特征在于，至少包括有分别对应HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68这14个基因型的特异性探针SEQ ID NO.1-14；
以及综合对应该14个基因型且数量分别少于14个的正向引物和反向引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，综合对应14个基因型的正向引物数量为5个，分别为：SEQ ID NO.15-19。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，综合对应14个基因型的反向引物数量为7个，分别为：SEQ ID NO.20-26。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因互补配对的特异性探针SEQ ID NO.27。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括有用于与作为人体细胞内质控的血红蛋白β基因互补配对的正向引物SEQ ID NO.28和反向引物SEQ ID NO.29。
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