CN105087827A - 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒 - Google Patents

16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒，该引物及探针可以快速、准确、简便地对HPV病毒相关性疾病进行筛查，不与其他病毒发生交叉反应，能同时检测出常见的HPV高危型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型，且HPV高危型覆盖范围广，比目前市场上的试剂盒检测更为准确和全面。本发明的试剂盒还包括阴性、阳性和弱阳性质控品，进一步增加了检测的准确性。

Description

16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒（HPV）属乳头瘤病毒家族，是一种小型无包膜的DNA病毒。病毒颗粒由单拷贝DNA和蛋白质组成，具有双链闭环DNA基因组，大小约8000bp，其基因组由三个基因区组成，包括含有8个早期开放阅读框的早期区（EarlyRegion，E），有2个晚期开放阅读框的晚期区（LateRegion，L）和非编码长控区（LongControlRegion，LCR）。早期区编码与HPV复制、转录和细胞转化相关的蛋白；晚期区编码HPV的结构蛋白，如组成病毒衣壳的主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPV各型的本质区别在于L1区核苷酸序列的差异。
目前已知的HPV型别有100多种，其中约40种涉及生殖道感染，约20种与肿瘤相关。根据HPV感染与宫颈病损的关系，将其分为高危型（致癌型）、可能致癌型、低危型。高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68等，与子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变(CIN）相关。低危型HPV包括HPV6、11、42、43和44等，常引起生殖道尖锐湿疣等良性病变。HPV感染的亚型分布具有一定的地域性差异，文献报道，中国妇女宫颈癌组织中HPV检出率较高的型别为16、18、58、31、33等亚型，第16型占51%，第18型次之，占16.2%。但在拉丁美洲33型最常见，其次是39和59型，在亚洲国家中，除了l6和18型之外，58和52型引起的宫颈癌所占比例较西方国家及非洲国家多。
人类乳头状瘤病毒感染率高低主要取决于人群的年龄和性行为习惯。许多研究发现性活跃的年轻妇女HPV感染率最高，高峰年龄在18~28岁，随着年龄的增长而明显下降。大多数HPV感染可在短期内消失，机体通过自身免疫系统使病毒逐渐清除，尤其是低危型别HPV更容易被机体清除，大约持续18个月左右。但对于高危型别HPV感染，许多研究报道其感染的高峰年龄是20~30岁，此阶段感染为暂时性，感染率较高，可达到25%~30%，此后，感染率逐渐下降。
高危型HPV的持续性感染与宫颈癌的发生有关。子宫颈HPV感染后可有三种临床过程。①隐匿感染：病毒基因组呈稳定状态，寄宿于宿主细胞但不整合入上皮，子宫颈鳞状上皮无临床和形态学的感染证据，但DNA技术可显示有HPV感染；②低危型HPV感染：HPV持续复制使鳞状上皮良性增生形成尖锐湿疣或引起低度鳞状上皮内病变（LSIL）；③高危型HPV感染：HPV-H基因整合入宿主基因组，干扰控制增生的癌基因和抑癌基因的表达，在临床上常表现为高度鳞状上皮内病变（HSIL），即发展至CINII以上病变。在妇女的一生当中可重复感染HPV，也可同时感染多种不同型别的HPV，从宫颈上皮内瘤变（CIN）到发展为宫颈癌，一般需要10~20年，而HPV多重感染可能使该病变时间缩短。据报道宫颈浸润癌的5年生存率是67%，宫颈早期癌是90%，而宫颈原位癌则几乎是100%。因此，早期筛查、早期诊断能有效降低宫颈癌的发病率和病死率。
随着人们对HPV和宫颈病变关系认识的逐渐加深以及医学实验技术发展，HPV感染的检查方法也由组织细胞水平发展到分子水平，主要包括细胞学检测方法、组织病理学检测方法、HPVDNA和RNA检测方法等几大型。其中细胞学技术是检测HPV感染的一种简便而经济的方法，常用于HPV的过筛检查。但实际工作中由于刮片、固定方法或阅片技术等多种因素的影响常造成较高的假阴性率。且细胞学技术不能直接检测到HPV本身，无法对HPV进行分型；阴道镜检可发现低度和高度异常，但无法发现微浸润疾病。另外，阴道镜检查的准确性通常受其自身及检查者的经验和技术水平影响，常造成假阴性，且其特异性较低，成本较高。
以基因扩增为基础的HPVDNA检测是目前最灵敏的检测方法，可以检测出低水平的病毒感染，并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类，也可检测潜在期感染。对于HPVDNA检测，有两种不同的PCR方法，即型特异或通用引物PCR。型特异PCR就是应用仅扩增某个HPV基因型的引物，因此为了检测一个临床样本是否存在HPVDNA，必须单独进行多个型特异的PCR反应。目前国内已经获得批准上市的HPVPCR检测试剂产品仅有深圳匹基一家公司，该公司此产品即是分别针对HPV6/11、16/18四个型别进行片段特异性扩增和分型检测。该法总的来讲，劳动强度大、一次可检测的标准数量较少，费用昂贵，而且无法检出新的HPV亚型。
综上亟需能够实现快速、有效且准确检测HPV病毒型别的产品，以用于HPV病毒高低危型的全面的检测，HPV病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术中无法同时检测多种型别HPV病毒的问题，本发明提供了基于荧光定量PCR技术的16种型别HPV病毒的检测引物和探针，以实现快速、有效且准确检测HPV病毒型别，用于HPV病毒高低危型的全面的检测，HPV病毒相关性疾病的预测及治疗监测。
该16种型别HPV病毒的检测引物和探针，包括16种型别基因的特异性扩增引物序列以及与该引物相应的Taqman荧光探针序列，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，各型别检测引物及探针序列下：
HPV6型：
上游引物HPV6-F：核苷酸序列如SEQIDNO:1，
下游引物HPV6-R：核苷酸序列如SEQIDNO:2，
Taqman荧光探针HPV6-P：核苷酸序列如SEQIDNO:3；
HPV11型：
上游引物HPV11-F：核苷酸序列如SEQIDNO:4，
下游引物HPV11-R：核苷酸序列如SEQIDNO:5，
Taqman荧光探针HPV11-P：核苷酸序列如SEQIDNO:6；
HPV16型：
上游引物HPV16-F：核苷酸序列如SEQIDNO:7，
下游引物HPV16-R：核苷酸序列如SEQIDNO:8，
Taqman荧光探针HPV16-P：核苷酸序列如SEQIDNO:9；
HPV18型：
上游引物HPV18-F：核苷酸序列如SEQIDNO:10，
下游引物HPV18-R：核苷酸序列如SEQIDNO:11，
Taqman荧光探针HPV18-P：核苷酸序列如SEQIDNO:12；
HPV31型：
上游引物HPV31-F：核苷酸序列如SEQIDNO:13，
下游引物HPV31-R：核苷酸序列如SEQIDNO:14，
Taqman荧光探针HPV31-P：核苷酸序列如SEQIDNO:15；
HPV33型：
上游引物HPV33-F：核苷酸序列如SEQIDNO:16，
下游引物HPV33-R：核苷酸序列如SEQIDNO:17，
Taqman荧光探针HPV33-P：核苷酸序列如SEQIDNO:18；
HPV35型：
上游引物HPV35-F：核苷酸序列如SEQIDNO:19，
下游引物HPV35-R：核苷酸序列如SEQIDNO:20，
Taqman荧光探针HPV35-P：核苷酸序列如SEQIDNO:21；
HPV39型：
上游引物HPV39-F：核苷酸序列如SEQIDNO:22，
下游引物HPV39-R：核苷酸序列如SEQIDNO:23，
Taqman荧光探针HPV39-P：核苷酸序列如SEQIDNO:24；
HPV45型：
上游引物HPV45-F：核苷酸序列如SEQIDNO:25，
下游引物HPV45-R：核苷酸序列如SEQIDNO:26，
Taqman荧光探针HPV45-P：核苷酸序列如SEQIDNO:27；
HPV51型：
上游引物HPV51-F：核苷酸序列如SEQIDNO:28，
下游引物HPV51-R：核苷酸序列如SEQIDNO:29，
Taqman荧光探针HPV51-P：核苷酸序列如SEQIDNO:30；
HPV52型：
上游引物HPV52-F：核苷酸序列如SEQIDNO:31，
下游引物HPV52-R：核苷酸序列如SEQIDNO:32，
Taqman荧光探针HPV52-P：核苷酸序列如SEQIDNO:33；
HPV56型：
上游引物HPV56-F：核苷酸序列如SEQIDNO:34，
下游引物HPV56-R：核苷酸序列如SEQIDNO:35，
Taqman荧光探针HPV56-P：核苷酸序列如SEQIDNO:36；
HPV58型：
上游引物HPV58-F：核苷酸序列如SEQIDNO:37，
下游引物HPV58-R：核苷酸序列如SEQIDNO:38，
Taqman荧光探针HPV58-P：核苷酸序列如SEQIDNO:39；
HPV59型：
上游引物HPV59-F：核苷酸序列如SEQIDNO:40，
下游引物HPV59-R：核苷酸序列如SEQIDNO:41，
Taqman荧光探针HPV59-P：核苷酸序列如SEQIDNO:42；
HPV66型：
上游引物HPV66-F：核苷酸序列如SEQIDNO:43，
下游引物HPV66-R：核苷酸序列如SEQIDNO:44，
Taqman荧光探针HPV66-P：核苷酸序列如SEQIDNO:45；
HPV68型:
上游引物HPV68-F：核苷酸序列如SEQIDNO:46，
下游引物HPV68-R：核苷酸序列如SEQIDNO:47，
Taqman荧光探针HPV68-P：核苷酸序列如SEQIDNO:48。
HPV6-F：AATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGA(SEQIDNO:1)，
HPV6-R：ATAACCCAAAGTTCCAGTCTTCCAA(SEQIDNO:2)，
HPV6-P：AACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCA(SEQIDNO:3)，
HPV11-F：ACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCAC(SEQIDNO:4)，
HPV11-R：ATGGCGCATGTATTCCTTATAATCTGA(SEQIDNO:5)，
HPV11-P：AGCAGATTTAGACACAGATGCACATAGTGTC(SEQIDNO:6)，
HPV16-F：CCAACTATTTGTTACTGTTGTTGATACTAC(SEQIDNO:7)，
HPV16-R：CCCATGTCGTAGGTACTCCTTAA(SEQIDNO:8)，
HPV16-P：TGGCAGCACATAATGACATATTTGTACTGCGT(SEQIDNO:9)，
HPV18-F：CGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACC(SEQIDNO:10)，
HPV18-R：CGTCCAAGGGGATATTGATCTAAGTC(SEQIDNO:11)，
HPV18-P：AGGGATCCTTATTTTCAGCCGGTGCAG(SEQIDNO:12)，
HPV31-F：GTGCTCAGGGACACAATAATGG(SEQIDNO:13)，
HPV31-R：ACCATGTCTTAAATACTCTTTAAAATTACTACT(SEQIDNO:14)，
HPV31-P：TGGTATCTACCACAGTAACAAATAACTGATTGCC(SEQIDNO:15)，
HPV33-F：CACAAGGTCATAATAATGGTATTTGTTG(SEQIDNO:16)，
HPV33-R：CAAACTGTAGATCATATTCTTCAACATGTC(SEQIDNO:17)，
HPV33-P：ATTAGTACTGCGAGTGGTATCTACCACAGTAAC(SEQIDNO:18)，
HPV35-F：TGGAGTAACCAATTGTTTGTTACTGTAG(SEQIDNO:19)，
HPV35-R：GTAAATCATATTCTTCACCATGCCT(SEQIDNO:20)，
HPV35-P：CAGAACACACAGACATATTTGTACTACGGGTTG(SEQIDNO:21)，
HPV39-F：CAGTCTGCAGCCATTACATGTCA(SEQIDNO:22)，
HPV39-R：GTTCCAAACTAAACTTTTCCCTTAAGTC(SEQIDNO:23)，
HPV39-P：TGCTCCAGCACCTGAAAAGAAAGATCC(SEQIDNO:24)，
HPV45-F：CAGGGCCATAACAATGGTATTTG(SEQIDNO:25)，
HPV45-R：CTGTAAATCATATTCCTCCACATGTCTAC(SEQIDNO:26)，
HPV45-P：TGTGTAGAGGCACATAATGTTAAATTAGTACTGCG(SEQIDNO:27)，
HPV51-F：CGTCTGCTAGTTTGGAGGATGC(SEQIDNO:28)，
HPV51-R：GAAAATCGTTCCTTTAAATCAACATC(SEQIDNO:29)，
HPV51-P：CTTAGCCTGTGGAGGGGTGTCCTTTTG(SEQIDNO:30)，
HPV52-F：GACTGGCAATTTGGCCTTACC(SEQIDNO:31)，
HPV52-R：TCCACCTCCCAAAACATATAGTCC(SEQIDNO:32)，
HPV52-P：TGTCCTCCAAAGATGCAGACGGTG(SEQIDNO:33)，
HPV56-F：CCTACTGGAGGACTGGAATATTGG(SEQIDNO:34)，
HPV56-R：CTGTAGAAAAACTGTCCTGTAAGTTAACA(SEQIDNO:35)，
HPV56-P：TGGCCACTGGCGGGGATAAC(SEQIDNO:36)，
HPV58-F：GCACAAGGTCATAACAATGGCAT(SEQIDNO:37)，
HPV58-R：CTTCAACATGACGTACATATTCCTTAA(SEQIDNO:38)，
HPV58-P：TGGTATCAACCACGGTAACAAATAACTGATTGC(SEQIDNO:39)，
HPV59-F：ACCGTTTTGTTCAATCTGCTGC(SEQIDNO:40)，
HPV59-R：GATCTGCAGAAAACCTTTCCTTAAG(SEQIDNO:41)，
HPV59-P：CTGTTTAACTGGCGGTGCGGTGTC(SEQIDNO:42)，
HPV66-F：GTGCACAGGGCCATAATAATGG(SEQIDNO:43)，
HPV66-R：GAAACACAAACTGTAGTTCATATTCCTC(SEQIDNO:44)，
HPV66-P：TCTGGTAGTATCCACAACAGTAACAAATACCTGAT(SEQIDNO:45)，
HPV68-F：ATACTATGAATCCTGCTATTTTGGATG(SEQIDNO:46)，
HPV68-R：GTCCAGTTCAGAACTAAACTTTTCCT(SEQIDNO:47)，
HPV68-P：TGTTGCCCCTCCACCATCTGCTAGTC(SEQIDNO:48)。
荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。用荧光PCR检测人乳头瘤病毒，结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后续处理的问题，减少了污染，是用于HPVDNA检测的理想手段。
本发明在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
以上每一对扩增引物和探针，都有非常高的特异性，不和其他的病毒例如HPV42型、HPV43型、HPV53型、HPV73型和HPV83型发生交叉反应，能同时检测出常见的HPV高危型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型。
本发明的引物可全面检测16种型别HPV病毒（6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、66型和68型），同步区分检测HPV低危型和HPV高危型的检测范围，覆盖全面。
作为优选方案，以上所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein，6-FAM）、六氯-6-甲基荧光素（Hexachloro-6-methylfluorescein，HEX）、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素（tetrachloro-6-carboxyfluorescein，TET）、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）、磺酰罗丹明（Sulforhodamine101，TexasRed）、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯（6-Carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein，JOE）、花菁3（cyanine3，Cy3）、花菁3.5（cyanine3.5，Cy3.5）、花菁5（cyanine5，Cy5）和花菁5.5（cyanine5.5，Cy5.5）中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1（BlackHoleQuencher1，BHQ1）、黑洞淬灭剂2（BlackHoleQuencher2，BHQ2）或黑洞淬灭剂3（BlackHoleQuencher3，BHQ3）中的至少一种。
更优选地，按照下表1所示来选择荧光报告基团和荧光淬灭基团。
表1
荧光淬灭基团 荧光报告基团
DABCYL 6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3中的至少一种
TAMRA 6-FAM、TET、JOE、HEX中的至少一种
BHQ1 6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3中的至少一种
BHQ2 TAMRA、Cy3、ROX、Texas Red中的至少一种
BHQ3 Cy5或Cy5.5
最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM和HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明还提供一种检测16种型别HPV病毒的试剂盒，包括以上任一所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，还包括PCR反应液，阳性质控品和阴性质控品，其中阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品和弱阳性质控品是以提纯的16种型别HPV病毒基因组为模板，由本发明提供的16种型别相应的基因扩增引物进行PCR扩增，16种扩增产物连接，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒。其中假病毒包装为现有常规技术，可以自行包装或者委托生物技术公司进行。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，盒内试剂包括独立包装的HPV裂解液、PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品和以下8组引物探针混合液：
A组：由HPV6型和HPV11型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
B组：由HPV16型和HPV18型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
C组：由HPV31型和HPV52型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
D组：由HPV33型和HPV45型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
E组：由HPV35型和HPV51型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
F组：由HPV39型和HPV59型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
G组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
H组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成。
其中，HPV裂解液为含有无水碳酸钠、Tris-HCl和EDTA的水溶液。
由于HPV亚型众多，且亚型之间的基因相似度很高，因此为避免错检，对型别引物及探针进行了上述组合，可以确保我们设计的每一种引物探针，在这种特定的组合下，不会产生因相互干扰而引起的非特异性扩增或相互抑制。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒中，HPV6型、HPV16型、HPV31型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV58型和HPV68型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记6-FAM，3’端标记BHQ1；
HPV11型、HPV18型、HPV33型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV59型和HPV66型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记HEX；3’端标记BHQ1。
通过分别标记不同的荧光标记，使得集成在每一管的两种型别引物探针混合液中，都有一组FAM标记的引物探针和一组HEX标记的引物探针加以区分，检测结果能直观反映在荧光定量PCR仪上，准确获得待检样品型别特征。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒中，阳性质控品中假病毒的浓度为1×105拷贝/mL，弱阳性质控品中假病毒的浓度为1×103拷贝/mL。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒，各组引物探针混合液中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μM，上游引物用量0.75μL，下游引物用量0.75μL，探针用量0.5μL，最后用无菌超纯水补足至5.5μL。
作为优选方案，上述检测16种型别HPV病毒的试剂盒的使用方法，待检样品使用HPV裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到8组引物探针混合液，再加入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为35~38℃条件下反应1~3分钟；93~95℃条件下反应3~5分钟；然后92~95℃反应10~15秒，55~65℃反应10~45秒，共35~45个循环；荧光信号收集时设定为FAM和HEX荧光素，荧光信号收集设在60℃；
结果判断：
如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为HPV病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤36，则对应的HPV型别判定为阳性。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1．利用本发明的检测引物、探针和试剂盒可以快速、简便地对HPV病毒相关性疾病进行筛查，能同时检测出常见的HPV高危型和低危型，共2种HPV低危型和14种HPV高危型，且HPV高危型覆盖范围广，比目前市场上的试剂盒检测更为全面。
2．本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到1×103拷贝/mL；同时，本发明的检测方法的特异性很好，不和其他的病毒发生交叉反应，例如HPV42型、HPV43型、HPV53型、HPV73型和HPV83型；
3.本发明的检测方法反应快速，一般1.5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对HPV病毒的快速、有效且准确的定性检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
附图说明
图1为采用荧光定量PCR仪检测HPV假病毒质控品得到的曲线；
图2是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35和HPV39的荧光定量PCR检测曲线；
图3是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的荧光定量PCR检测曲线；
图4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的荧光定量PCR检测曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1HPV质控品的构建
（1）将16种型别的HPV病毒片段连接后制备成为假病毒。
将16种型别的HPV病毒分别以各自相应的特异性引物扩增出片段（例如HPV6型病毒模板，使用本发明设计的HPV6型上游引物HPV6-F和下游引物HPV6-R进行扩增，收集产物），16种型别的HPV病毒扩增产物经基因测序确认正确后包装成假病毒，假病毒由北京博恒科创生物科技有限公司进行制备并提供浓度。
（3）将HPV假病毒按照北京博恒科创生物科技有限公司提供的浓度进行稀释，分别稀释至1×105拷贝/mL和5×103拷贝/mL，然后采用ABI7500荧光定量PCR仪进行检测。
结果如图1所示：左边是16种HPV型别引物探针检测到的1×105拷贝/mL的假病毒，右边是16种HPV型别引物探针检测到的5×103拷贝/mL的假病毒的扩增曲线。
将HPV假病毒稀释成1×105拷贝/mL、5×103拷贝/mL，分别作为试剂盒的阳性质控品和弱阳性质控品。
实施例2检测试剂盒组成及使用
1、试剂盒组成
试剂 成分 用量
HPV裂解液 无水碳酸钠、Tris-HCl、EDTA 50μL
PCR反应液 DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+ 14.5μL
阴性质控品 灭菌生理盐水
阳性质控品 假病毒（1×105 拷贝/mL）
弱阳性质控品 假病毒（1×103 拷贝/mL）
A组引物探针混合液 HPV6-F，HPV6-R，HPV6-P； HPV11-F，HPV11-R，HPV11-P 5.5μL
B组引物探针混合液 HPV16-F，HPV16-R，HPV16-P；HPV18-F，HPV18-R，HPV18-P 5.5μL
C组引物探针混合液 HPV31-F，HPV31-R，HPV31-P；HPV52-F，HPV52-R，HPV52-P 5.5μL
D组引物探针混合液 HPV33-F，HPV33-R，HPV33-P；HPV45-F，HPV45-R，HPV45-P 5.5μL
E组引物探针混合液 HPV35-F，HPV35-R，HPV35-P；HPV51-F，HPV51-R，HPV51-P 5.5μL
F组引物探针混合液 HPV39-F，HPV39-R，HPV39-P；HPV59-F，HPV59-R，HPV59-P 5.5μL
G组引物探针混合液 HPV56-F，HPV56-R，HPV56-P；HPV68-F，HPV68-R，HPV68-P 5.5μL
H组引物探针混合液 HPV58-F，HPV58-R，HPV58-P；HPV66-F，HPV66-R，HPV66-P 5.5μL
其中，HPV6型、HPV16型、HPV31型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV58型和HPV68型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记6-FAM，3’端标记BHQ1；
HPV11型、HPV18型、HPV33型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV59型和HPV66型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记HEX；所述荧3’端标记BHQ1。
各组引物探针混合液由初始浓度10μM的每种引物序列0.75μL，初始浓度10μM的探针0.5μL，最后用无菌超纯水将反应体系补足至5.5μL。
2、试剂盒使用方法如下：
（1）宫颈分泌物样本：取1mL样本至1.5mL离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清；沉淀中加入500μL灭菌生理盐水混匀，12000rpm离心2分钟；再用灭菌生理盐水重复洗涤一次；去尽上清，沉淀中加入50μLHPV裂解液充分混匀，95℃作用10分钟，12000rpm离心10分钟，上清即为纯化的病毒核酸，作为待检模板。（待检模板的提取可以使用现有技术中任意方法，只要能获得样本DNA核酸即可，也可以直接使用市售商品DNA提取试剂盒，不限于上述方法）。
（2）取PCR反应液14.5μL分别置于8个反应管内，分别加入8组引物探针混合液5.5μL（1个单位）配制成反应体系，然后分别加入5.0μL待检模板。
荧光定量PCR反应条件：37℃，2分钟；95℃，3分钟；94℃，15秒；60℃，45秒，40个循环。
采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM和VIC（HEX）荧光素，荧光信号收集设在60℃。
每批次反应均设置阴性质控品（灭菌生理盐水）、阳性质控品和弱阳性质控品（HPV假病毒）。
（3）结果判断：检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为HPV病毒阴性。
检测通道出现S型扩增曲线，则对应的HPV型别判定为阳性，具体标准见下表。
引物探针混合液 FAM通道Ct值≤36 HEX或VIC通道Ct值≤36
A组引物探针混合液 HPV6型阳性 HPV11型阳性
B组引物探针混合液 HPV16型阳性 HPV18型阳性
C组引物探针混合液 HPV31型阳性 HPV52型阳性
D组引物探针混合液 HPV45型阳性 HPV33型阳性
E组引物探针混合液 HPV35型阳性 HPV51型阳性
F组引物探针混合液 HPV39型阳性 HPV59型阳性
G组引物探针混合液 HPV68型阳性 HPV56型阳性
H组引物探针混合液 HPV58型阳性 HPV66型阳性
3、临床检测
利用上述方法对1例HPV6型宫颈分泌物样本、1例HPV11型宫颈分泌物样本、1例HPV16型宫颈分泌物样本、1例HPV18型宫颈分泌物样本、1例HPV31型宫颈分泌物样本、1例HPV33型宫颈分泌物样本、1例HPV35型宫颈分泌物样本、1例HPV39型宫颈分泌物样本、1例HPV45型宫颈分泌物样本、1例HPV51型宫颈分泌物样本、1例HPV52型宫颈分泌物样本、1例HPV56型宫颈分泌物样本、1例HPV58型宫颈分泌物样本、1例HPV59型宫颈分泌物样本、1例HPV66型宫颈分泌物样本、1例HPV68型宫颈分泌物样本、1例HPV42型国家参考品、1例HPV43型国家参考品、1例HPV53型国家参考品、1例HPV73型国家参考品和1例HPV83型国家参考品，共计21份样本进行检测。国家参考品是由中国食品药品检定研究院制备的国家标准物质，包含HPV各种型别的质粒，是由北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司研发的标准品。
结果如图2~图4所示，图2是HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35和HPV39的检测曲线；图3是HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68的检测曲线；图4是HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83的检测曲线：
其中16例宫颈分泌物样本（HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和HPV68）检测均为阳性，有S型扩增曲线（图2和图3）；5例国家参考品（HPV42、HPV43、HPV53、HPV73和HPV83）检测均为阴性，无S型扩增曲线（图4）。
结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为16种型别的HPV病毒基因序列。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
<120>16种型别HPV病毒的检测引物、探针及试剂盒
<130>P20150150
<160>48
<170>PatentInversion3.3
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Claims (9)

1.16种型别HPV病毒的检测引物和探针，其特征在于，包括16种型别基因的特异性扩增引物序列以及与该引物相应的Taqman荧光探针序列，探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，各型别检测引物及探针序列如下：
HPV6型：
上游引物HPV6-F：核苷酸序列如SEQIDNO:1，
下游引物HPV6-R：核苷酸序列如SEQIDNO:2，
Taqman荧光探针HPV6-P：核苷酸序列如SEQIDNO:3；
HPV11型：
上游引物HPV11-F：核苷酸序列如SEQIDNO:4，
下游引物HPV11-R：核苷酸序列如SEQIDNO:5，
Taqman荧光探针HPV11-P：核苷酸序列如SEQIDNO:6；
HPV16型：
上游引物HPV16-F：核苷酸序列如SEQIDNO:7，
下游引物HPV16-R：核苷酸序列如SEQIDNO:8，
Taqman荧光探针HPV16-P：核苷酸序列如SEQIDNO:9；
HPV18型：
上游引物HPV18-F：核苷酸序列如SEQIDNO:10，
下游引物HPV18-R：核苷酸序列如SEQIDNO:11，
Taqman荧光探针HPV18-P：核苷酸序列如SEQIDNO:12；
HPV31型：
上游引物HPV31-F：核苷酸序列如SEQIDNO:13，
下游引物HPV31-R：核苷酸序列如SEQIDNO:14，
Taqman荧光探针HPV31-P：核苷酸序列如SEQIDNO:15；
HPV33型：
上游引物HPV33-F：核苷酸序列如SEQIDNO:16，
下游引物HPV33-R：核苷酸序列如SEQIDNO:17，
Taqman荧光探针HPV33-P：核苷酸序列如SEQIDNO:18；
HPV35型：
上游引物HPV35-F：核苷酸序列如SEQIDNO:19，
下游引物HPV35-R：核苷酸序列如SEQIDNO:20，
Taqman荧光探针HPV35-P：核苷酸序列如SEQIDNO:21；
HPV39型：
上游引物HPV39-F：核苷酸序列如SEQIDNO:22，
下游引物HPV39-R：核苷酸序列如SEQIDNO:23，
Taqman荧光探针HPV39-P：核苷酸序列如SEQIDNO:24；
HPV45型：
上游引物HPV45-F：核苷酸序列如SEQIDNO:25，
下游引物HPV45-R：核苷酸序列如SEQIDNO:26，
Taqman荧光探针HPV45-P：核苷酸序列如SEQIDNO:27；
HPV51型：
上游引物HPV51-F：核苷酸序列如SEQIDNO:28，
下游引物HPV51-R：核苷酸序列如SEQIDNO:29，
Taqman荧光探针HPV51-P：核苷酸序列如SEQIDNO:30；
HPV52型：
上游引物HPV52-F：核苷酸序列如SEQIDNO:31，
下游引物HPV52-R：核苷酸序列如SEQIDNO:32，
Taqman荧光探针HPV52-P：核苷酸序列如SEQIDNO:33；
HPV56型：
上游引物HPV56-F：核苷酸序列如SEQIDNO:34，
下游引物HPV56-R：核苷酸序列如SEQIDNO:35，
Taqman荧光探针HPV56-P：核苷酸序列如SEQIDNO:36；
HPV58型：
上游引物HPV58-F：核苷酸序列如SEQIDNO:37，
下游引物HPV58-R：核苷酸序列如SEQIDNO:38，
Taqman荧光探针HPV58-P：核苷酸序列如SEQIDNO:39；
HPV59型：
上游引物HPV59-F：核苷酸序列如SEQIDNO:40，
下游引物HPV59-R：核苷酸序列如SEQIDNO:41，
Taqman荧光探针HPV59-P：核苷酸序列如SEQIDNO:42；
HPV66型：
上游引物HPV66-F：核苷酸序列如SEQIDNO:43，
下游引物HPV66-R：核苷酸序列如SEQIDNO:44，
Taqman荧光探针HPV66-P：核苷酸序列如SEQIDNO:45；
HPV68型:
上游引物HPV68-F：核苷酸序列如SEQIDNO:46，
下游引物HPV68-R：核苷酸序列如SEQIDNO:47，
Taqman荧光探针HPV68-P：核苷酸序列如SEQIDNO:48。
2.根据权利要求1所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。
3.一种检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的16种型别HPV病毒的检测引物和探针。
4.根据权利要求3所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，阳性质控品和阴性质控品，其中阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品和弱阳性质控品是以提纯的16种型别HPV病毒基因组为模板，由权利要求1中16种型别相应的基因扩增引物进行PCR扩增，16种扩增产物连接，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒。
5.根据权利要求4所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，盒内试剂包括独立包装的HPV裂解液、PCR反应液、阴性质控品、阳性质控品、弱阳性质控品和以下8组引物探针混合液：
A组：由HPV6型和HPV11型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
B组：由HPV16型和HPV18型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
C组：由HPV31型和HPV52型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
D组：由HPV33型和HPV45型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
E组：由HPV35型和HPV51型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
F组：由HPV39型和HPV59型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
G组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成；
H组：由HPV56型和HPV68型的上游引物、下游引物和Taqman荧光探针溶于无菌超纯水组成。
6.根据权利要求5所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，HPV6型、HPV16型、HPV31型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV58型和HPV68型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记6-FAM，3’端标记BHQ1；
HPV11型、HPV18型、HPV33型、HPV51型、HPV52型、HPV56型、HPV59型和HPV66型的Taqman荧光探针核苷酸序列5’端标记HEX；3’端标记BHQ1。
7.根据权利要求6所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，阳性质控品中假病毒的浓度为1×105拷贝/mL，弱阳性质控品中假病毒的浓度为1×103拷贝/mL。
8.根据权利要求7所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒，其特征在于，各组引物探针混合液中，上游引物、下游引物和探针的浓度均为10μM，上游引物用量0.75μL，下游引物用量0.75μL，探针用量0.5μL，最后用无菌超纯水补足至5.5μL。
9.权利要求8所述的检测16种型别HPV病毒的试剂盒的使用方法，其特征在于，待检样品使用HPV裂解液采用煮沸裂解法提取DNA，分别加入到8组引物探针混合液，再加入PCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为35~38℃条件下反应1~3分钟；93~95℃条件下反应3~5分钟；然后92~95℃反应10~15秒，55~65℃反应10~45秒，共35~45个循环；荧光信号收集时设定为FAM和HEX荧光素，荧光信号收集设在60℃；
结果判断：
如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为HPV病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤36，则对应的HPV型别判定为阳性；扩增曲线。
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