CN109777887B - 一种检测病毒多种分型的方法和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的方法和检测试剂盒。所述方法包括以下步骤：1)确定病毒及其不同亚型；2)对病毒的不同亚型设计特异性引物和探针；3)设计一个或多个筛选组合及其对应的分型组合；4)通过设计一个或多个筛选组合确定待测样本的病毒亚型所属的亚组；5)通过与筛选组合对应的分型组合确定病毒的具体分型。所述方法及试剂盒灵敏度高，特异性强，可以一次检测多种常见高低危类型的病毒，大大提高了病毒的检测效率，缩短检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及采用多种荧光标记的多重核酸扩增的荧光检测方法及检测试剂盒。
背景技术
随着人类对基因组的逐步探索，细菌与病毒基因组的差异分成多种亚型，人类基因组的多态性被发现。针对病毒、细菌不同亚型或人基因组多态性的细致分析，有利于疾病的进一步治疗。病毒分型如人乳头瘤病毒分型、流感病毒分型、乙肝病毒分型、丙肝病毒分型等，对不同病毒基因型研究，对分子流行病学调查、临床诊治过程中出现的基因变异、对抗病毒治疗的反应和病情预后评估等方面都具有重大意义。
例如，病毒中的人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是属于乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，是对皮肤及黏膜上皮细胞具有特殊嗜性的一类小DNA病毒。完整的病毒颗粒为一个感染单位，外形呈20面体对称型，外壳有72个衣壳体，直径约45-55nm，相对分子质量5×l06。HPV基因组为环状双链DNA，含有近8000碱基对(bp)，由3个部分组成，包括早期区(early region，E)含有E1、E2、E4、E5、E6和E7共6个基因，是维持病毒复制、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因；晚期区(late region，L)和长控制区(longcontrol region，LCR)。
HPV是一类具有严格宿主范围和组织特异性的病毒，主要感染人的皮肤或黏膜上皮细胞，引起感染部位发生病变。宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一。已有的研究表明，高危型人乳头瘤病毒持续感染及多重感染是导致宫颈癌变的重要原因之一。宫颈癌是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的连续性病理过程。通常为宫颈上皮内瘤样变I-II-III-宫颈原位癌-宫颈早期浸润癌-宫颈浸润癌。已有的研究表明，90％以上的宫颈癌标本中有HPV DNA的存在。HPV具有致癌危险性，感染生殖道和肛门的HPV分为低危型和高危型。高度致癌危险的病毒主要包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、66等亚型。通常在高度鳞状上皮内病变中发现。低度致癌危险的病毒主要包括HPV6、11、42、43、44、53、61等亚型。一般伴随尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变极少引起浸润癌。
目前检测基因分型方法较多，包括如DNA直接测序，基因芯片也称为DNA微列阵(DNA microarray)，原位杂交技术、液态悬浮芯片技术等。
DNA直接测序为基因检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，通量低，不适合快速检测。
基因芯片是指采用原位合成或直接点样的方法将大量DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等固体介质上形成微矩阵。样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的各点同时进行杂交，通过检测杂交信号的强度而获取样品分子的数量和序列信息，从而对基因序列及功能进行研究。基因芯片的优点是：(1)利用其高通量特性达到对某种基因亚型的同步检测和筛查，具有简化检测步骤、缩短检测时间、降低患者检测费用等优势；(2)具有病毒检测与分型同时进行的优点，对高度CIN预测虽敏感性较HCII法差，但特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值均很高，一次可检测多种亚型的病毒亚型，其结果可协助临床诊断。其局限性在于：(1)由于其敏感性较HCII法差，用于筛查尚存在一定的漏诊率，还有待于大样本临床实验的验证；(2)样品的PCR处理，不可避免地带来PCR所具有的问题；(3)检查价格昂贵，很难投入临床实际应用。
实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)是近些年发展起来的更加灵敏和特异的方法，可以检测出原始临床标本中甚至几个拷贝数的病毒。实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，直接检测PCR扩增过程中荧光信号的变化，对靶病原体核酸进行快速检测，通过实时荧光PCR法检测标本的病毒核酸，该方法具有快速、特异、敏感度高的特点。
发明内容
技术问题
本发明所要解决的技术问题是设计一种检测病毒，特别是人乳头瘤病毒的多种分型的方法和试剂盒。
技术方案
一种检测病毒多种分型的方法，其包括以下步骤：
1)确定病毒及其不同亚型；
2)引物和探针设计：采用PCR扩增方法结合荧光探针检测技术，分别对病毒的不同亚型设计特异性引物和探针；
3)设计一个或多个筛选组合及其对应的分型组合，其中，通过筛选组合对病毒亚型进行初步筛分，由此确定待测样本的病毒亚型所属的亚组，以及通过分型组合确定病毒亚型，
其中，每个筛选组合包含针对病毒不同亚型的引物和探针，并且每个筛选组合通过在探针上引入用不同的荧光基团而被分成若干亚组(subgroups)，其中每个亚组中针对病毒不同亚型的探针标记相同的荧光基团，并且
其中，每个对应的分型组合包含针对病毒不同亚型的引物和探针，并且其包含的针对病毒不同亚型的探针与上述每个亚组中针对病毒不同亚型的探针相对应，并且其包含的针对病毒不同亚型的探针分别标记不同的荧光基团；
4)运用步骤3)中设计的筛选组合在进行PCR扩增的同时使用荧光监测系统检测不同波长的荧光信号，以确定待测样本的病毒亚型所属的亚组；
5)在确定待测样本的病毒亚型所属的亚组后，选择其对应的分型组合，在进行PCR扩增的同时使用荧光监测系统检测不同波长的荧光信号，根据检测的荧光信号确定病毒分型。
在一个具体实施方式中，所述病毒为人乳头瘤病毒(HPV)。
根据不同的检测仪器，在上述检测病毒多种分型的方法的步骤3)中，所述荧光基团可包括FAM、VIC、HEX、JOE、TAMARA、NED、ROX、LIZ、CY3、CY5、Joda-4，同时也可以使用将来技术升级后出现的一些新的荧光基团。例如，所述荧光基团可包括FAM、VIC、ROX以及CY5。
此外，在上述检测病毒多种分型的方法的步骤3)中，筛选组合及其亚组的数目可以根据待检测的病毒亚型的数目及选择的荧光基团的种类而定。
在上述检测病毒多种分型的方法的一个具体实施方式中，步骤1)中的病毒的亚型可为HPV的以下28种亚型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV33、HPV66、HPV35、HPV53、HPV51、HPV52、HPV45、HPV73、HPV59、HPV72、HPV54、HPV6、HPV11、HPV39、HPV68、HPV26、HPV81、HPV61、HPV44、HPV40、HPV43、HPV42、HPV83，但不限于此。
在上述检测人乳头瘤病毒多种分型的方法的一个具体实施方式中，通过下表中列出的筛选组合和分型组合来检测HPV的所述28种亚型：
具体地，在第一轮荧光检测中采用筛选组合1和筛选组合2两个反应，当筛选组合1的FAM标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合1即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的VIC标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合4即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的ROX标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合2即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的CY5标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合3即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的FAM标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合5即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的VIC标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合6即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的CY5标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合7即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。
另一方面，本发明提供一种检测病毒多种分型的试剂盒，其包含：
一个或多个筛选组合，每个筛选组合中可包含针对病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且每个筛选组合中通过在探针上引入用不同的荧光基团而被分成若干亚组(subgroups)，其中每个亚组中针对病毒不同亚型的探针标记相同的荧光基团；以及
多个分型组合，每个分型组合包含针对病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且其包含的针对病毒不同亚型的探针与上述每个亚组中针对病毒不同亚型的探针相对应，并且其包含的针对病毒不同亚型的探针分别标记不同的荧光基团。
根据本发明的一个实施方式，提供了一种用于检测人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒，其包含：
一个或多个筛选组合，每个筛选组合中可包含针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且每个筛选组合中通过在探针上引入用不同的荧光基团而被分成若干亚组(subgroups)，其中每个亚组中针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针标记相同的荧光基团；以及
多个分型组合，每个分型组合包含针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且其包含的针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针与上述每个亚组中针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针相对应，并且其包含的针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针分别标记不同的荧光基团。
本发明的用于检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，每个筛选组合可以进一步包含：PCR缓冲液、UDG酶、Taq DNA聚合酶以及ddH2O，
本发明的用于检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，每个分型组合可以进一步包含：PCR缓冲液、UNG酶、Taq DNA聚合酶以及ddH2O。
具体地，本发明的用于检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，根据不同的检测仪器，所述荧光基团可包括FAM、VIC、HEX、JOE、TAMARA、NED、ROX、LIZ、CY3、CY5、Joda-4，同时也可以使用将来技术升级后出现的新的一些荧光基团。例如，在本申请的具体实例中，所使用的荧光基团为FAM、VIC、ROX以及CY5。
具体地，本发明的用于检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，所述试剂盒可包含一个以上，例如两个筛选组合。
具体地，本发明的用于检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，所述试剂盒可包含一个以上，例如2个，3个，4个，5个，6个或7个分型组合。如上所述，虽然在本文的具体实例中，采用上表中的筛选组合和分型组合进行两轮筛选确认HPV的28种分型，但是，本领域的技术人员可以理解为，可以根据可选的荧光标记基团的数目和可检测的病毒亚型的数目对筛选组合以及分型组合的分配组合进行合理变换，以得到最佳的组合，而不仅仅限于上表中列出的组合方式。
具体地，在本发明的用于检测人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒中，HPV亚型的上游引物以及下游引物序列及HPV亚型探针如以下表1和表2所列出，并且，本发明的用于检测人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒的配置体系如以下表4和5所示。进一步，所述试剂盒可用于检测以下列出的HPV的28种亚型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV33、HPV66、HPV35、HPV53、HPV51、HPV52、HPV45、HPV73、HPV59、HPV72、HPV54、HPV6、HPV11、HPV39、HPV68、HPV26、HPV81、HPV61、HPV44、HPV40、HPV43、HPV42、HPV83。
有益效果
本发明的检测方法及检测试剂盒灵敏度高，特异性强，可以一次检测多种常见高低危类型的病毒，大大提高了病毒的检测效率，缩短检测时间。
附图说明
图1：根据本发明实施例的方法的示意图；
图2：HPV 28种亚型筛选组合1；
图3：HPV 28种亚型筛选组合2；
图4：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合1检测出16型、18型、31型、56型HPV；
图5：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合2检测出58型、33型、66型、35型HPV；
图6：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合3检测出53型、51型、52型、45型HPV；
图7：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合4检测出6型、11型、39型、68型HPV；
图8：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合5检测出73型、59型、72型、54型HPV；
图9：HPV 28种亚型7种组合中的分型组合6检测出28型、81型、61型、44型HPV；
图10：HPV28种亚型7种组合中的分型组合7检测出40型、43型、42型、83型HPV。
具体实施方式
本文中所使用的术语“多个”或“若干”是指大于1的整数，例如可以为2个，3个，4个，……等等，其可以根据分型的数目来确定。
以下通过HPV的28种具体亚型的实例来描述本发明以使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但以下实施例并不用于限制本发明的范围。而是本领域的技术人员将理解本发明的方法适用于各种病毒的不同亚型的鉴定。
以下实例中采用的试剂购自天根生化科技有限公司，试剂包括PCR缓冲液、UNG酶、Taq DNA聚合酶以及UDG酶。
1.引物和探针的设计
本申请中HPV28种亚型的引物和探针分别如以下表1和表2所示。
表1：HPV 28种亚型引物
表2：HPV 28种亚型探针
2.筛选组合的选择
将以上28种亚型分成2个筛选组合，利用探针标记不同的荧光，检测是否有HPV28种亚型，筛选组合1包括16个亚型，筛选组合2包括12个亚型。筛选组合具体荧光标记如下：
筛选组合1：16型、18型、31型、56型标记FAM荧光(亚组1)；58型、33型、66型、35型标记ROX荧光(亚组2)；53型、51型、52型、45型标记CY5荧光(亚组3)；6型、11型、39型、68型标记VIC荧光(亚组4)；
筛选组合2：73型、59型、72型、54型标记FAM荧光(亚组5)；26型、81型、61型、44型标记VIC荧光(亚组6)；40型、43型、42型、83型标记CY5荧光(亚组7)。
3.分型组合的选择
将以上HPV的28种亚型分成7个分型组合，7个分型组合与筛选组合标记探针相对应，筛选组合1、2中共同标记FAM、VIC、CY5、ROX的四个亚型分别做不同荧光标记，组成分型组合。分型组合荧光标记如下：
分型组合1：16型标记FAM荧光、18型标记VIC荧光、31型标记ROX荧光、56型标记CY5荧光，与筛选组合1标记FAM荧光对应；
分型组合2：58型标记FAM荧光、33型标记VIC荧光、66型标记ROX荧光、35型标记CY5荧光，与筛选组合1标记ROX荧光对应；
分型组合3：53型标记FAM荧光、51型标记VIC荧光、52型标记ROX荧光、45型标记CY5荧光，与筛选组合1标记CY5荧光对应；
分型组合4：6型标记FAM荧光、11型标记VIC荧光、39型标记ROX荧光、68型标记CY5荧光，与筛选组合1标记VIC荧光对应；
分型组合5：73型标记FAM荧光、59型标记VIC荧光、72型标记ROX荧光、54型标记CY5荧光，与筛选组合2标记FAM荧光对应；
分型组合6：26型标记FAM荧光、81型标记VIC荧光、61型标记ROX荧光、44型标记CY5荧光，与筛选组合2标记VIC荧光对应；
分型组合7：40型标记FAM荧光、43型标记VIC荧光、42型标记ROX荧光、83型标记CY5荧光，与筛选组合2标记CY5荧光对应。
筛选组合1、2检测出感染HPV样品，根据检测标记荧光类型，进行分型检测，确定感染HPV亚型。HPV亚型组合方式与探针荧光标记类型如以下表3所示：
表3：HPV亚型组合方式与探针荧光标记类型
如附图1以及表3所示，在第一轮荧光检测中采用筛选组合1和筛选组合2两个反应，当筛选组合1的FAM标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合1即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的VIC标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合4即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的ROX标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合2即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合1的CY5标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合3即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的FAM标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合5即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的VIC标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合6即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。当筛选组合2的CY5标记有信号时，则第二轮荧光检测采用分型组合7即可通过四重荧光标记检测出具体的亚型。
在上述方法中，筛选组合1、筛选组合2试剂配制体系具体如下表4所示。
表4：筛选组合1、筛选组合2试剂配制体系
7个分型组合配制体系相同，具体配制体系如下表5：
表5：分型组合配制体系
注：本发明的荧光定量PCR仪器上机检测的反应条件为50℃2min；95℃5min；95℃15s，54℃20s，60℃45s，共40个循环，60℃时收集荧光。
从以上结果可以看出，经过两轮的筛选，可以确认28种人乳头瘤病毒的具体分型，该检测方法灵敏度高，检测效果高，时间短。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连晶泰生物技术有限公司
<120> 一种检测病毒多种分型的方法和检测试剂盒
<130> DI17-1313-XC03
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cctgccaaaa gggtccttcc gc 22
Claims (3)
1.一种检测人乳头瘤病毒(HPV)多种分型的非疾病诊断目的的方法，其包括以下步骤：
1)确定病毒及其不同亚型；
2)引物和探针设计：采用PCR扩增方法结合荧光探针检测技术，分别对病毒的不同亚型设计特异性引物和探针；
3)设计一个或多个筛选组合及其对应的分型组合，其中，通过筛选组合对病毒亚型进行初步筛分，由此确定待测样本的病毒亚型所属的亚组，以及通过分型组合确定病毒亚型，
其中，每个筛选组合包含针对病毒不同亚型的引物和探针，并且每个筛选组合通过在探针上引入用不同的荧光基团而被分成若干亚组，其中每个亚组中针对病毒不同亚型的探针标记相同的荧光基团，并且
其中，每个对应的分型组合包含针对病毒不同亚型的引物和探针，并且其包含的针对病毒不同亚型的探针与上述每个亚组中针对病毒不同亚型的探针相对应，并且每个对应的分型组合所包含的针对病毒不同亚型的探针分别标记不同的荧光基团；
4)运用步骤3)中设计的筛选组合在进行PCR扩增的同时使用荧光监测系统检测不同波长的荧光信号，以确定待测样本的病毒亚型所属的亚组；
5)在确定待测样本的病毒亚型所属的亚组后，选择其对应的分型组合，在进行PCR扩增的同时使用荧光监测系统检测不同波长的荧光信号，根据检测的荧光信号确定病毒分型，
其中，所述人乳头瘤病毒(HPV)的分型分别如下：HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV33、HPV66、HPV35、HPV53、HPV51、HPV52、HPV45、HPV73、HPV59、HPV72、HPV54、HPV6、HPV11、HPV39、HPV68、HPV26、HPV81、HPV61、HPV44、HPV40、HPV43、HPV42、HPV83；
其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、ROX以及CY5；以及
通过下表中列出的筛选组合和分型组合来检测HPV的所述28种亚型：
2.一种用于检测人乳头瘤病毒多种分型的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测以下列出的HPV的28种亚型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV33、HPV66、HPV35、HPV53、HPV51、HPV52、HPV45、HPV73、HPV59、HPV72、HPV54、HPV6、HPV11、HPV39、HPV68、HPV26、HPV81、HPV61、HPV44、HPV40、HPV43、HPV42、HPV83，
所述试剂盒包含下表中列出的筛选组合和分型组合：
上表中的每个筛选组合中包含针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且每个筛选组合中通过在探针上引入用不同的荧光基团而被分成若干亚组，其中每个亚组中针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针标记相同的荧光基团；以及
上表中的每个分型组合包含针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针及上游引物和下游引物，并且其包含的针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针与上述每个亚组中针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针相对应，并且每个分型组合所包含的针对人乳头瘤病毒不同亚型的探针分别标记不同的荧光基团。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，每个筛选组合进一步包含：PCR缓冲液、UDG酶、Taq DNA聚合酶以及ddH2O；每个分型组合进一步包含：PCR缓冲液、UNG酶、Taq DNA聚合酶以及ddH2O。
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