JP5898831B2 - ヒトパピローマウイルスの検出 - Google Patents
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Description
[実施例]
オリゴヌクレオチドのLuminexマイクロスフェアへのコンジュゲーション
冷蔵庫から試薬(0.1%SDS、Tween 20及び0.1M MES)を取り出し、室温に適合させる。チューブ上の「nmol」濃度に等しい容量の製薬純水を添加することにより凍結乾燥したプローブを再懸濁し、1mMの保存濃度を与える。ビーズセットを選択し、ペレットを分散させ、超音波処理し、1分間ボルテックスする。5.0×106ビーズ(総量1.25×107のうち)を1.5mlチューブに分散させる(1ml総量のうち400μlに相当する)。チューブにプローブID及びLuminexビーズ領域ID、例えばHPV16[01]を貼ることに留意されたい。新しいプローブを試験するために、150μlのビーズストックを使用し、最終再懸濁液のために300μlの0.1M MESを添加する。10,000rpmで1分間遠心分離にかけ、次に、ビーズを除去しないように注意して上澄みを除去する。50μlの0.1M MESを添加し、ボルテックスして、超音波処理する。
0.1M MES:4.88gのMES(2[N-Morpholino] Ethanesulphonic acid)を250mlのSigma水に添加し、次にほぼ5滴の5NのNaOHを添加することによりpHを4.5に調整し、ろ過滅菌する。
0.02%Tween 20:50μlのTween 20を250mlのSigma水に添加し、次にろ過滅菌する。
0.1%SDS:2.5mlのSDS(ラウリル硫酸10%溶液)を250mlのSigma水に添加し、ろ過滅菌する。
一反応用のPCRマスター混合(45μl)を、Qiagen Hot Start PCRキットを使用して以下の通りに作製する。
・PCRプレート又はチューブを、以下のサイクリングパラメータで熱循環装置にセットする:95℃/15分に続いて8サイクルの95℃/30秒、54℃/1分及び72℃/45秒、確実にアニーリング温度は各サイクルで1.5℃下がるようにする。これに続いて、35サイクルの95℃/30秒、42℃/1分、72℃/45秒、さらに72℃/7分の最終伸長、その後4℃で保持する。
・2%アガロースゲルを使用した電気泳動ステップを含めて、PCRアンプリコンサイズ及びバンド強度を確認してもよい。
1.1.5×TMACで複数分析物(ビーズ)溶液を用意する(添加する各ビーズセットの容積は、以前計算したμlあたりのビーズの濃度に基づく)。
2.12μl TE緩衝液をPCRプレート(Millipore社製)に、5μlビオチン標識PCR産物及び33μlのビーズ調製物を各ウェルに添加する。確実に産物とビーズ溶液が十分混ざり合うようにする。
3.プレートを以下のパラメータでプログラムされた熱循環装置に移す:95℃/5分に続いて53℃を15分。サイクルが進行している間、Luminexゴールドブロックを−20℃冷凍庫に移す。
4.プレートを熱循環装置から取り出し、冷却ブロックに移して1分間「スナップ冷凍する」。プレートをブロックから取り出し、2250×g/3分で遠心分離し、プレートを反転させることによって液体を吸引し、ビーズを1つも失わないように注意して80×g/20秒で穏やかに遠心分離する。ゴールドブロックを53℃まで加熱するように設定されたBioPlex/Luminex機器に移す。
5.ストレプトアビジン−R−フィコエリトリン(S−PE)コンジュゲートを1×TMACで1:1000に希釈する(ウェルの数に75μlを掛けることにより準備する容量を計算する)。
6.70μlの1:1000希釈S−PEを添加し、プレートを20秒間振動させることによりビーズを再懸濁し、その後熱循環装置に戻して、さらに5分間53℃でインキュべートする。
7.プレートを熱循環装置から取り出し、BioPlex/Luminex機器中の予熱されたブロックに移す。BioPlex/Luminex機器で読み取る。
1.確実にレーザーを使用前に予熱しておくようにする。機械にすでに30分以上スイッチが入っている場合は、これはすでに自動的に実行されている。前もって実行されていない場合は、「始動」オプションを選択する。機械は、MCVプレートでの滅菌水及び70%イソプロパノールの位置決めを指示する。「始動」プロセスは約4分かかる。
2.メニューからオプション「オープンプロトコル」を選択し、ファイルHPVを開く。メニューから、オプション「分析物を選択する」及びアッセイにおいて試験中の分析物、すなわち16、18等を「添加する」を選ぶ。
3.X(=未知)をクリックし、カーソルを試験中のウェル上にドラッグすることにより鋳型を定義する。適切な数の「B」として示される空白ウェルを含める。
4.メニュー上の「イジェクト/リトラクト」ボタンを使用してマイクロタイタープレートを挿入し、「ラン」ボタンを押す。機器は試料ごとのビーズ/プローブごとに一連の平均蛍光強度(MFI)値を計算する。
5.機器が読み取りを終えたら、オプションを選択してデータを解析のためにエクセルファイルに移す。
1.アッセイのためのカットオフを1500MFIに設定し、試験を繰り返すべき「グレーゾーン」は1500と2000MFI間である。
2.確実に「空白」ウェル中のMFI値すべてが<1000であるようにする。
3.試料中に存在するいかなるHPV遺伝子型(複数可)もMFI値>2000MFIを与える。
Claims (28)
- 試料中のヒトパピローマウイルス核酸をインビトロで検出する方法であって、
(i)ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又は相補体の一部の増幅を促進するのに適した条件下で、前記試料を、前記ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによりアンプリコンを作製するステップであって、前記フォワードプライマーが配列番号1の配列を有する標的部位に結合し、前記リバースプライマーが配列番号2の配列を有する標的部位に結合する、ステップ;
(ii)前記アンプリコンを、該アンプリコン内の標的部位に結合するプローブのセットと接触させるステップ;及び
(iii)前記プローブと前記アンプリコンとの結合を検出するステップを含み、
前記プローブのセットが、
(i)配列番号15の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
(ii)配列番号16の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
(iii)配列番号17の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、及び
(iv)配列番号18の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブを含む、方法。 - プローブのセットが、
(i)配列番号15の核酸配列を含むプローブ、
(ii)配列番号16の核酸配列を含むプローブ、
(iii)配列番号17の核酸配列を含むプローブ、及び
(iv)配列番号18の核酸配列を含むプローブ、
を含む、請求項1に記載の方法。 - プローブのセットが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む少なくとも1つの他のプローブをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 少なくとも1つの他のプローブが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される核酸配列を含むか、該核酸配列からなる、請求項3に記載の方法。
- フォワードプライマーが配列番号3の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含み、
リバースプライマーが配列番号9の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - アンプリコンを作製するステップが、試料を、配列番号1の配列を有する標的部位に結合する少なくとも2つの異なるフォワードプライマー及び配列番号2の配列を有する標的部位に結合する少なくとも2つの異なるリバースプライマーと接触させることを含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも2つのフォワードプライマーがそれぞれ配列番号3の核酸配列、並びに、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列から選択される異なる核酸配列を含み、少なくとも2つのリバースプライマーがそれぞれ配列番号9の核酸配列、並びに、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、及び配列番号14から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列から選択される異なる核酸配列を含む、請求項6に記載の方法。
- フォワードプライマーのそれぞれが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8から選択される異なる核酸配列からなり、リバースプライマーのそれぞれが、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される異なる核酸配列からなる、請求項7に記載の方法。
- アンプリコンを作製するステップが、試料を
(i)配列番号4の核酸配列からなるフォワードプライマー、
(ii)配列番号5の核酸配列からなるフォワードプライマー、
(iii)配列番号10の核酸配列からなるリバースプライマー、及び
(iv)配列番号11の核酸配列からなるリバースプライマー、
と接触させることを含む、請求項6〜8のいずれかに記載の方法。 - プローブのセットのそれぞれのプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 異なる固体担体又はプラットホームのそれぞれが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項10に記載の方法。
- 異なる固定化されたプローブの結合に続いて、ビーズ又はマイクロスフェアをその一意的同定に従ってソーティングすることをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- アンプリコンと、検出可能な分子を含み、且つ前記アンプリコンに結合するレポーター構築物とを接触させることを含む、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- フォワード及び/又はリバースプライマーが標識を含み、アンプリコンを作製するステップが前記標識をアンプリコンに組み込むステップを含み、
(i)前記標識が検出可能な分子を含むか、又は
(ii)前記標識が第1の結合分子を含み、
前記第1の結合分子と、該第1の結合分子に結合する第2の結合分子を含み、且つ検出可能な分子を含むレポーター構築物とを接触させることをさらに含む、請求項1〜12に記載の方法。 - 第1の結合分子がビオチンである、請求項14に記載の方法。
- 検出可能な分子が蛍光分子である、請求項13〜15のいずれかに記載の方法。
- 対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷をインビトロで定量する方法であって、(a)前記対象試料に対して請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(b)所定の既知のヒトパピローマウイルス病原体負荷の試験試料に対して請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(c)前記対象試料から検出されるシグナルを試験試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより前記対象試料中のヒトパピローマウイルス病原体負荷を定量する方法。 - 薬物療法の期間の経過にわたって、薬物の有効性をインビトロで判定する方法であって、(a)薬物療法の期間内の又は先立つ最初の時点で得られる最初の試料に対して請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施すること;
(b)薬物療法の期間内の又は後の1又は複数の後の時点で得られる1又は複数の後期試料に対して請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(c)最初の試料から検出されるシグナルを、前記1又は複数の後期試料から検出されるシグナルと比較することを含み、
それにより薬物療法の期間の経過にわたって薬物の有効性を判定する方法。 - 薬物療法がワクチン療法である、請求項18に記載の方法。
- 試料中のヒトパピローマウイルスをインビトロで分類する方法であって、
(a)試料に対して請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実施すること;及び
(b)ヒトパピローマウイルス核酸に結合しているプローブ又は複数のプローブを同定すること
を含む方法。 - 請求項1〜20のいずれかに記載の方法において使用するためのプローブのセットであって、プローブがヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体内の標的配列に結合し、
前記プローブのセットが、
(i)配列番号15の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
(ii)配列番号16の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、
(iii)配列番号17の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブ、及び
(iv)配列番号18と少なくとも95%の配列同一性を有する核酸配列を含むプローブを含む、プローブのセット。 - (i)配列番号15の核酸配列を含むプローブ、
(ii)配列番号16の核酸配列を含むプローブ、
(iii)配列番号17の核酸配列を含むプローブ、及び
(iv)配列番号18の核酸配列を含むプローブ
を含む、請求項21に記載のプローブのセット。 - プローブのセットが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む少なくとも1つの他のプローブをさらに含む、請求項21又は22に記載のプローブのセット。
- 少なくとも1つの他のプローブが、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34からなる群から選択される核酸配列を含むか、該核酸配列からなる、請求項23に記載のプローブのセット。
- プローブのセットにおけるそれぞれのプローブが、異なる固体担体又はプラットホーム上に固定化されている、請求項21〜24のいずれかに記載のプローブのセット。
- 異なる固体担体又はプラットホームが、一意的に同定可能なビーズ又はマイクロスフェアである、請求項25に記載のプローブのセット。
- 請求項21〜26のいずれかに記載のプローブのセットを含み、ヒトパピローマウイルスL1遺伝子又はその相補体中の標的部位に結合するフォワードオリゴヌクレオチドプライマー及びリバースオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項1〜20のいずれかに記載の方法において使用するためのキット。
- フォワードプライマーが、配列番号3の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7及び配列番号8から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含み;及び/又は
リバースプライマーが、配列番号9の配列を有する核酸配列を含むか、又は配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13及び配列番号14から選択される核酸配列と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項27に記載のキット。
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