KR101717632B1 - 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 - Google Patents
핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101717632B1 KR101717632B1 KR1020090015025A KR20090015025A KR101717632B1 KR 101717632 B1 KR101717632 B1 KR 101717632B1 KR 1020090015025 A KR1020090015025 A KR 1020090015025A KR 20090015025 A KR20090015025 A KR 20090015025A KR 101717632 B1 KR101717632 B1 KR 101717632B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- hpv
- gene
- probe
- detecting
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 특이적 프라이머 및 내재 표준물질을 포함하는 HPV 검출용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 HPV 검출용 조성물, 개체로부터 시료를 수득하는 단계 및 상기 조성물을 이용하여 HPV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HPV의 검출방법 및 상기 조성물을 포함하는 HPV 검출용 키트에 관한 것이다.
핵산 염색체, HPV 스크리닝, PCR, SyBr, 내재 표준물질
Description
본 발명은 특이적 프라이머 및 내재 표준물질을 포함하는 HPV 검출용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 HPV 검출용 조성물, 개체로부터 시료를 수득하는 단계 및 상기 조성물을 이용하여 HPV L1 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HPV의 검출방법 및 상기 조성물을 포함하는 HPV 검출용 키트에 관한 것이다.
인유두종 바이러스 (Human Papillomavirus, HPV)는 약 8Kb의 이중나선 원형의 유전자를 가진 직경 55 nm의 DNA 바이러스로서, 여성의 자궁경부암을 유발하는 여러 가지 악성종양과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Godfroid et al.,J. Virol. Method 75:69-81, 1998). HPV 유전자는 E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 및 L2로 구성되어 있는데, 이들 중 E1 단백질은 바이러스 복제에 관여하고, E2 단 백질은 바이러스의 복제와 전사의 조절에 관여한다고 알려져 있으며 (Wison et al., Virus Genes 24:275-90, 2002), E6 와 E7 유전자는 각각 암유전자 역할, 즉 암 억제 단백질인 p53과 pRB에 결합하는 단백질을 암호화 한다고 보고되고 있다 (Furumoto et al., J. Med. Invest. 49:124-133, 2002). 한편, 후기 유전자인 L1 및 L2은 각각 주외피 단백질 및 부외피 단백질의 합성을 담당하는 것으로 알려져 있다.
이처럼 HPV의 감염은 자궁 경부 종양 발생과 관련이 있는데, 자궁 경부암은 자궁의 경부에서 발생하는 악성 종양으로 전체 자궁암 발생 빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생 빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 새로운 환자로 보고되고 있는 실정이다. 자궁경부암은 성접촉과 밀접한 관계가 있으며, HPV의 감염이 자궁경부 종양발생에 관계가 있다고 알려져 있다. HPV는 현재까지 약 130여 종의 유전자형이 보고되어 있는데, 이 중에서 사람에게 질병을 유발시킬 수 있는 HPV는 약 30여 종이며 이를 크게 '고위험군(high-risk)' (16, 18, 31, 33, 35 등)과 '저위험군(low-risk)' (6, 11, 42, 43, 44 등)으로 분류하고 있다(De Villiers, J. Virol.63:4898-4903, 1989 ; Jacobs et al., J. Clin. Microbiol. 33:901-905, 1995). 또한 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 특이한 유전자형이 발견되어 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인식하게 되었다(Garrenstroom et al., J. Gynecol. Cancer 4:73-78, 1994).
자궁경부암과 관련된 HPV 바이러스의 자체요인으로는 지속적인 감염과 고위험군의 감염 뿐만 아니라 감염된 바이러스의 양도 관여하는 것으로 알려져 있다(Snijers et al., J. pathol. 2003: 201: 1-6). 따라서 감염된 바이러스의 종류 뿐만 아니라, 감염량을 확인하는 것이 자궁경부암의 진단 및 치료에 있어 중요하다.
현재 가장 흔히 시행되는 HPV 검진법은 자궁세포진 검사(PAP smear)가 있으나, 상기 방법은 검사자의 숙련도에 의존하여 검사의 정확도가 떨어지는 단점이 있다(Menezes et al., Acta Cytol. 45:919-926, 2001). 그 밖에 질확대경을 시행하면 HPV의 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 수련된 전문가와 고가의 장비가 필요하며 인유두종바이러스의 유전자형을 분류할 수 없는 단점이 있다(Reidet al., Clin Obstet Gynecol. 32:157-179, 1989).
그 외에 HPV를 검출하기 위하여 사용되는 방법으로서, 전기영동을 이용한 HPV screening PCR (바이오코아, 씨젠)은 여러 타입의 HPV를 검출 및 일부를 구분할 수 있지만, 정량성을 보유하고 있지 않으며, L1 부위를 PCR로 증폭한 후에 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나, 사용하는 제한 효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못할 뿐만 아니라 (Lungu et al., JAMA 267:2493-2496, 1992), 정량성을 보유하고 있지 않은 단점이 있다. 또한 상품화되어 있는 하이브리드 캡쳐 키트(Digene, USA)는 PCR 증폭 과정없이 확인 가능하나 고위험군과 저위험군을 별도로 검사하여야 하며 자궁경부암과 상관관계가 높은 16, 18 형과 다른 고위험군을 구별할 수 없다는 단점이 있다 (Clavel et al., J. Clin. Pathol. 51:737-740, 1998). 또한 매우 좁은 정량 범위를 보유하고 있다.
그 외에 최근에 개발된 마이크로 칩 또는 비드 어레이(bead array) 기술를 이용한 HPV 유전자형 분석 키트들은 검출 방법이 복잡하여 교잡반응 후에 여러 회에 걸쳐서 세척과정을 거쳐야 하는 번거로움이 있으며, 이미지 작업시 기준점을 정하기 어려운 단점이 있다. 한편 핵산 염색제로 처음 사용된 EtBr(Ethidium Bromide)은 전기영동을 통한 중합효소연쇄반응 산물의 확인에 사용되어 분자생물학의 발전에 많은 기여를 하였다. 하지만 발암물질로 규명되어 대체 물질이 요구 되었으며, 이러한 요구에 따라 EtBr의 대체물질로 개발 되어진 핵산염색제 SyBr green은 초기에 전기영동에서의 중합효소연쇄반응 산물의 확인에 사용되었을 뿐만 아니라, 실시간 중합효소 연쇄반응에도 사용되어 반응 산물의 실시간 확인에 이용되고 있다. SyBr을 이용하는 방법은 저렴한 가격으로 실시간 PCR (real time PCR)을 실시할 수 있을 뿐만 아니라 염기서열 다양성이 높아서 특이적 프로브 (specific probe)를 적용하기 어려운 경우에 스크리닝 PCR 목적으로 사용될 수 있는 장점을 가지고 있으나, 모든 PCR 산물과 반응하여 형광을 보이는 특성으로 인하여 내재 표준물질을 설정할 수 없는 단점이 존재하였다.
한편, 이보다 더 늦게 개발된 특이적 프로브 (예, Taqman probe, Hybridization probe, molecular beacon 등)를 이용한 경우 프로브에 결합된 형광 염색제 (dye)의 종류에 따라 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 진행하면서 목적하는 PCR 산물에 사용하는 형광 염색제 외에 다른 형광 염색제를 이용하여 내재 표준물질을 설정할 수 있는 반면, 각각의 경우에 있어서 특이적 프로브를 제조해야 하는 단점이 존재한다.
따라서 본 발명자들은 상기와 같은 기존 진단 방법의 단점을 극복하고 보다 효과적인 HPV 검진방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 타입에 따라 염기서열의 다양성을 갖는 HPV 유전자를 효과적으로 검출하기 위하여 신규한 프라이머 서열을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time polymerase chain reaction, real time PCR)을 수행하는 한편, PCR 수행시 내재 표준물질을 설정함으로써, 기존의 공지 방법에서 필수적으로 사용해야 했던 여러 종의 특이적 프로브 (specific probe)의 사용 없이 하나의 반응용기 (tube) 내에서 민감도 및 특이도가 높고, 단시간에 용이하게 다양한 타입의 HPV 감염 여부를 진단할 수 있으며, 저해물질에 의한 위음성을 방지할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 HPV 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 개체로부터 시료를 수득하는 단계 및 상기 조성물을 이용한 증폭 및 HPV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HPV의 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 HPV 검출용 키트를 제공하는 것이다.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 및 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 HPV 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "HPV"란 인유두종 바이러스 (Human pailloma virus, HPV)를 의미하며, 8kb로 이루어진 환상의 이중나선 바이러스로서, 유전자의 발현 시기에 따라 크게 초기 유전자 (early gene)와 후기 유전자 (late gene)으로 구분된다. 약 4.5kb 의 초기 유전자인 E1, E2, E3, E4, E5, E6 및 E7에 대해서 각각 그 기능이 공지되어 있고, 2.5kb인 후기 유전자는 L1, L2는 각각 주외피 단백질 및 부외피 단백질을 코딩하는 유전자로 알려져 있다. 최근 분자 생물학적 기법이 발달함에 따라 HPV의 게놈 염기서열이 밝혀지고 있는데, HPV 는 E6, E7 및 L1 유전자의 ORF (Open Reading Frame) 서열의 차이에 따라 여러 타입으로 구분되고 있다. 즉, ORF의 뉴클레오티드 서열이 10% 다른 경우에는 새로운 타입(type)으로 정의되고, 2% 이상 10% 미만으로 다른 경우에는 아형 (subtype)으로, 2% 미만의 차이를 보이는 경우에는 변이체 (variant)로 정의된다. 이와 같은 구분에 따라 현재까지 HPV는 120 여 종 이상의 타입이 알려져 있다. 바람직하게 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 유전적을 다양한 변화를 보이는 상기 L1 유전자를 검출함으로써 HPV 감염 여부를 진단할 수 있다.
바람직한 양태로서 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 특정 유전자 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머 (primer)"란 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 (template strand) 복제를 위한 시작 지점 (starting point)으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트 (nucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포 스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 HPV 유전자 및 이에 상동성을 가진 서열을 포함하는 프라이머라면 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명의 목적상 HPV L1 유전자와 상동성을 가지는 프라이머 서열일 수 있다. 바람직하게 본 발명은 다양한 HPV 타입 (type)에서 모두 결합할 수 있는 신규의 프라이머를 개발하였으며, 본 발명의 프라이머를 이용하는 경우 다양한 HPV 타입을 검출하는 한편, 상대적으로 정량할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 프라이머는 HPV의 캡시드 단백질(capsid protein)을 코딩하는 L1 유전자에 대한 프라이머로서, 다양한 타입의 HPV를 모두 검출하기 위하여 L1 부위 중 타입간의 염기서열 상동성이 비교적 높은 MY 또는 gp로 명명된 부위에 대한 프라이머를 사용하였다. 다만 기존에는 이러한 프라이머를 이용한다 하더라도, 생산된 L1 부위가 타입별로 상이하여, 특이적 프로브 (specific probe)를 이용한 PCR을 실시할 정도로 충분한 상동성을 충족하지 못하여 검출이 불가하였다. 그러나 본 발명자들은 핵산 염색제를 이용함으로써, 특이적 프로브 없이 MY 와 gp 프라이머만을 이용하여 하나의 튜브 내에서 네스티드 PCR (nested PCR)을 수행한 결과, HPV를 용이하고 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
바람직하게 본 발명의 HPV L1에 대한 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프 라이머 세트를 쌍으로 포함할 수 있다. 가장 바람직하게 본 발명의 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 프라이머를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 프라이머를 모두 포함하는 프라이머를 검출용 조성물로 사용하여, 대상 시료로부터 HPV의 감염 유무를 확인하였다.
바람직한 양태로서 본 발명은 위양성 및 위음성을 최소화 하기 위하여 내재 표준물질로서 추가적인 프라이머 서열 또는 프로브 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 HPV 검출방법을 이용하는 경우, 단일 반응용기 (tube) 내에서 목적 유전자와 내재 표준물질의 증폭 여부를 실시간으로 검출할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 내재 표준물질은 목적하는 PCR 산물에 영향을 미치지 않으면서 독립적인 PCR 및 이의 검출이 가능한 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 내재 표준물질은 PCR 산물의 Tm (melting temperature) 값이 목적하는 PCR 산물의 Tm 값 보다 충분히 낮음으로써, 양 산물에 대한 형광값을 확연히 구분할 수 있고, PCR 저해 유무에 대한 표지자로 사용될 수 있는 물질이다. 상기 내재 표준물질은 바람직하게는 내재 표준 유전자일 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 이러한 내재 표준물질로 gfp 유전자를 사용하였다. gfp 유전자는 젤리피쉬 (jellyfish)의 일종인 아퀴레아 빅토리아 (Aequorea victoria)에서 유래한 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP) 유전자 (Prasher et al., Gene 111, 229-233, 1992)로서, 본 발명에서는 상기 유전자를 검출할 수 있는 프라이머를 본 발명의 목적에 부합하도록 변형하여 사용하였다. GFP는 395nm에서 빛을 흡수하여 508nm에서 형광을 발하는 단백질로, 형광 발색에 특정한 인자나 기질을 필요로 하지 않고 빛에 의해 발광하기 때문에 유전자 발현 연구 분야에서 효과적인 표지 인자이다 (Chalfie et al., Science 263, 802-805, 1994). 본 발명에서는 이러한 GFP를 통상적으로 사용되는 용도와는 달리 PCR 저해물질 유무에 대한 표지 물질로 gfp 유전자를 선택하여 사용하는 한편, 실시간 중합효소 연쇄반응에 적합한 크기의 증폭산물이 형성되는 부위를 선택하고, 검출 대상 증폭산물보다 Tm이 낮도록 하기 위해 gfp 유전자를 검출할 수 있는 프라이머의 염기서열을 일부 변형한 형태로 사용하였다. 이러한 내재 표준물질을 구성하는 프라이머 및 프로브는 특히 낮은 농도의 HPV 검출에 있어서 내재 표준물질의 PCR 증폭 산물 형성으로 인해 HPV PCR 증폭 산물 형성이 저해를 하지 않아, 위음성을 보다 효과적으로 방지할 수 있게 된다. 내재 표준물질에 대한 프로브의 염기서열은 하기의 표 2 (실시예 1 참조)에 나타내었다.
바람직한 양태로서 본 발명은 상기 HPV에 대한 프라이머 및 내재 표준물질에 대한 프라이머 외에 내재 표준물질에 대한 프로브 (probe)를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"란, 올리고뉴클레오타이드 (즉, 뉴클레오타이드 서열)를 말하는 것으로, 자연적으로 발생하거나, 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로, 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 바람직한 양태로 서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성, 및 발광성 시스템을 포함할 수 있고, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될 수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 프로브는 gfp 유전자에 결합 가능한 프로브일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 11 또는 서열번호 12로 제시되는 프로브이다. 가장 바람직하게 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 서열번호 11 및 서열번호 12를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 HPV 검출용 조성물 내에 내재 표준물질을 설정함으로써, HPV 존부에 대한 상대적 정량, 및 민감도 및 특이성이 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
바람직한 하나의 양태로서 본 발명은 상기 프로브의 5' 말단 및 3' 말단에 형광 물질을 포함하는 프로브일 수 있다. 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 형광물질이 표지되어 있고, 5' 말단에 표지된 형광 물질(reporter)과 3' 말단에 표지된 형광물질(quencher)은 상호 간섭 현상을 나타내는 것일 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 5'-UTR에 결합된 상태에서는 발색이 제한되고, 중합효소 연쇄반응의 수행시 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광 물질은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 형광물질이 발색 반응을 하게 된다. 이와 같은 상기 발색 반응에 의하여 시료로 부터 내재 표준물질의 증폭 여부를 확인할 수 있게 된다.
상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광 물질 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein,FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), Cyanine-5 (Cy5) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 5' 말단 형광물질이 제한되는 것은 아니다.
3' 말단에 표지될 수 있는 형광물질 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한없이 사용될 수 있으며, 그 예로, 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine, TAMRA), BHQ-1,2,3 (black hole quencher-1,2,3) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 형광물질이 한정되는 것은 아니다.
바람직하게 본 발명은 개체로부터 HPV 감염 여부를 진단하기 위하여 상기 프라이머 및 프로브 외에 증폭 및 검출에 필요한 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상 HPV 유전자의 증폭 여부를 확인하기 위하여 증폭된 HPV 유전자를 확인할 수 있는 핵산 염색제를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게 사용 가능한 핵산 염색제의 종류는 DNA를 확인하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 핵산 염색제라면 제한 없이 사용가능하며, 그 예로 SyBr Green, SYTO 13 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용가능한 핵산 염색제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
그 외에도 본 발명의 HPV 검출용 조성물은 증폭 반응에 필요한 구성요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 포함될 수 있는 구성 요소는, 증폭 반응에 있어서 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질이라면 제한 없이 사용가능하며, 예를 들면 완충용액, DNA 중합 효소, dNTP 및 멸균 증류수 등이 있으나, 상기 예들에 의해 추가될 수 있는 구성요소가 제한되는 것은 아니다. 바람직한 본 발명의 실시예에서는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 표시된 모든 프라이머 및 프로브를 각 100 μM씩 포함하는 한편, 미량의 GFP, dNTP를 포함하는 HS PCR premix, 핵산 염색제인 SYTO 13, Taq 중합효소 (Taq polymerase), 및 멸균 증류수를 포함하는 HPV 감염 진단용 조성물을 제조하였으며, 상기 조성물에 개체로부터 수득한 시료를 첨가하여 실시간 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 수행함으로써 해당 개체에 대한 HPV 감염 여부를 확인하였다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 개체로부터 시료를 수득하는 단계 및 상기 조성물을 이용한 증폭 및 HPV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HPV의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란 인간을 포함하는 영장류, 말, 양, 돼지, 염소, 개 고양이, 설치류 및 다양한 종류의 조류를 모두 포함하는 개념이며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
또한 본 발명에서 사용되는 시료는 HPV의 서열이 포함되어 있을 것이라고 예상하는 시료이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 시료의 예로는 혈액, 림프, 뇨, 부 인과 체액 (gynecological fluid), 생검 및 스미어 (smear)를 포함하는 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 시료는 HPV 의심 개체의 자궁경부탈락세포로부터 수득되는 시료임이 바람직하다.
본 발명의 증폭 단계는 당업계에서 통상적으로 사용될 수 있는 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 방법이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 PCR 반응일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time PCR)일 수 있다.
이러한 실시간 중합효소 연쇄반응 분석은 시판되고 있는 실시간 중합효소 연쇄반응기기를 사용하여 수행될 수 있는 바, 실시간 중합효소 연쇄반응 기기의 예를 들면, SLAN real time PCR detection system (LG 생명과학, 한국), LightCyclerTM (Roche, Germany), ABI PRISMTM 7000/7700 (Applied Biosystems, USA), iCyclerTM (Bio-Rad, USA), Rotor-GeneTM(Corbett, Australia), OpticonTM (PharmaTech, USA) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 SLAN real time PCR detection system을 사용하는 한편, HPV 검출용 조성물에 개체로부터 수득한 시료를 첨가하여 실시간 네스티드 PCR을 수행함으로써, 효과적으로 HPV 감염 유무를 진단할 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 HPV 검출용 키트에 관한 것이다.
바람직하게 키트의 구성으로는, 본 발명의 서열을 갖는 프라이머, 및 내재 표준물질로서의 프라이머 서열 및 프로브를 포함하는 키트로 제조될 수 있으며, HPV의 검출을 위하여 완충용액, DNA 중합효소, dNTP 및 핵산 염색제 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 하기에 나타내는 표 3 (실시예 4 참조)의 조성을 가진 키트를 사용함으로써, HPV의 증폭 및 검출이 가능한 키트를 제조할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기와 같은 조성을 갖는 조성물을 제조하여 높은 민감도 및 특이도를 갖는 HPV를 검출할 수 있음을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 목적 유전자 및 내재 표준물질을 하나의 반응 용기에서 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 목적 유전자의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적상 상기 목적 유전자의 검출방법은, (a) 목적 유전자에 특이적인 프라이머, 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 준비하는 단계로서, 상기 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머는 내재 표준 유전자의 PCR 산물의 Tm (melting temperature)값이 목적 유전자의 PCR 산물의 Tm 값 보다 낮도록 변형된 것인 단계; (b) 목적 유전자 및 내재 표준 유전자가 포함된 용기에 상기 (a)에서 준비한 목적 유전자에 특이적인 프라이머, 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 넣고 핵산 염색제를 이용하여 실시간 PCR (real-time PCR)을 수행하는 단계; (c) 각 사이클의 연장반응 시기에 목적 유전자의 형광값을 측정하는 단계; 및 (d) 연장과정에서 형광신호를 70 내지 80에서 측정하여 내재 표준 유전자의 형광값을 측정하는 단계를 포함하는, 핵산 염색제를 이용하는 실시간 PCR 방법을 이용하여 목적 유전자를 검출하는 방법일 수 있다. 보다 바람직하게 상기 목적 유전자는 HPV 유전자일 수 있으며, 내재 표준 유전자는 PCR 반응에서 목적 유전자보다 낮은 Tm 값을 갖는 유전자이면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게 내재 표준 유전자는 gfp 유전자이다. 또한 바람직하게 본 발명에서 사용되는 핵산 염색제는 SyBr green 또는 Syto 13일 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 핵산 염색제의 종류가 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 결합시킬 수 있으며, 바람직하게 각 말단에 결합될 수 있는 물질은 5'의 경우 리포터 형광물질 (reporter dye)일 수 있고, 3'의 경우 퀀쳐 형광물질 (Quencher dye) 일 수 있다. 각 말단에 결합될 수 있는 형광물질은 상기에 언급한 바와 같이 5' 말단의 경우 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloroflorescein), CY5 (cyanine-5), FAM (5-carboxy fluorescein) 및 VIC일 수 있고, 3' 말단의 경우 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ-3 (black hole quencher 3) 일 수 있다.
바람직하게 본 발명의 목적 유전자 검출용 조성물은 상기 목적 유전자에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있으며, 바람직하게 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 서열일 수 있다. 또한 본 발명의 내재 표준 유전자는 gfp 유전자일 수 있으며, PCR을 수행하기 위하여 내재 표준 유전자에 대한 특이적인 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 9 내지 서열번호 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 서열일 수 있다. 또한 상기 내재 표준 유전자를 검출하기 위하여 프로브를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 프로브 서열은 서열번호 11 및 서열번호 12일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하고, 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
상기에서 살펴 본바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 PCR 방법을 이용하면, HPV를 기존방법보다 단 시간내에 간편한 방법으로 검출 및 상대적 정량할 수 있으며, 내재 표준물질을 적용하여 반응저해물질에 의한 위음성 결과를 배제할 수 있다.
실시예 1 : 프라이머와 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 MY와 gp 특이 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 genebank 의 entrez에서 HPV L1 유전자를 확보한 후 clustal X를 이용하여 보존 부위를 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 HPV만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기 서열임을 확인하였다.
한편 GFP 유전자의 특이 프라이머와 프로브도 위와 마찬가지로 genebank의 entrez에 등록되어 있는 염기서열을 바탕으로 BLAST로 분석하여 GFP만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다. 이후 HPV 검출 PCR 증폭산물보다 Tm이 낮도록 하기 위해 양쪽 프라이머 부위의 바깥 일부 부위의 염기서열을 변형하여 제작하였다.
제작한 프라이머의 염기서열은 하기의 표 1과 같다.
제작한 프로브의 염기서열은 하기의 표 2와 같다.
실시예 2 : 프라이머의 합성
실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harbor laboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 메타비온사(metabion, 독일)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 3: 개체 또는 표준세포주로부터 HPV DNA 추출
1) HPV 감염이 의심되는 환자의 자궁경부탈락세포 또는 표준세포주 용액 1ml를 튜브에 넣고 13,000rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 1 ml의 PBS 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)를 넣어 잘 교반시킨 후, 13,000rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고 PBS 버퍼 1 ml을 넣고 교반시킨 후 13,000rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 또 다시 상층액을 제거하고 침전물에 5%(w/v) Chelex 100 resin(Bio-Rad 사)을 50-100 ul를 넣고 100에서 20분간 가열한 후, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 분리된 DNA 상층액을 PCR의 주형 DNA로 사용하였다.
실시예 4: 상기 프라이머 프로브를 이용한 실시간 다중 PCR
1) 표 3과 같은 PCR 반응 조성으로 PCR 반응 조성물을 제조하고, 표4와 같은 조건으로 PCR 반응을 SLAN real time PCR detection system(LG 생명과학, 한국)에서 시행하였다. 표 4의 경우 형광량 측정 온도가 일반적인 중합효소연쇄반응과 다른 것은 도 1에 나타난 것과 같은 원리로 검출 대상 중합효소 산물과 내재표준물질의 중합효소 산물을 구분하여 측정하기 위함이다.
2) 실시간으로 반응 산물을 측정하였으며, 반응이 완료된 후 결과를 SLAN 8.0 프로그램을 이용하여 분석하였다.
3) 도 2는 HPV 고양성, 도 3은 HPV 저양성, 도 4는 음성, 도 5는 반응저해물질로 인한 위음성으로 판단할 수 있었다.
실시예 6: 기존 사용되는 HPV genotyping chip(식품의약품안전청 허가 제품, 바이오코아, 한국)과 본 발명 키트의 HPV 진단 효과 비교 실험
기존에 사용되는 HPV genotyping chip (식품의약품안전청 허가 제품, 바이오코아, 한국)과 본 발명의 키트를 이용하여 HPV 진단효과를 비교하였다. 비교시 사용한 biochip의 경우 제조사의 사용설명서에 따라 실시하였으며, 양성 개체의 경우 염기서열 분석을 통하여 최종 결과를 확인하였다. 또한 본 발명 키트의 경우는 상대적 정량을 위한 Ct값을 표시하였다. 양성 시료의 경우에 대한 결과를 표 5 내지 표 7에 나타내었다. 표 5 내지 표 7은 발명 키트의 진단 효과 비교 실험 결과를 나타낸 것으로서 표 5는 각 시료별 Ct 값, Chip 결과 및 시퀀싱 (sequencing) 결과이고, 표 6 은 시퀀싱과 Biochip 결과표로써 HPV 양성/음성 통계표, 및 민감도 및 특이도를 나타내었고, 표 7은 시퀀싱과 실시간 다중 PCR 결과표로써 HPV 양성/음성 통계표, 및 민감도 및 특이도를 나타낸 결과이다. 한편 HPV 양성/음성 여부는 PCR 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 통해 최종 확인하였다.
60개의 시료를 대상으로 실험한 결과, 시퀀싱과의 결과 일치율은 biochip이 90%, 실시간 다중 PCR이 90%로 동등 이상의 결과를 보였다. 민감도와 음성예측률의 경우 실시간 다중 PCR이 biochip보다 더 좋은 결과를 보여서 screening 목적에 더 적합한 결과를 보였으며, 특이도와 양성예측률은 biochip이 실시간 다중 PCR보다 더 좋은 결과를 보여서 confirm 목적에 더 적합한 결과를 보였다.
이를 통해 실시간 다중 PCR이 기존 허가 제품과 동등한 수준의 결과를 가지며, HPV screening을 목적으로 사용하기에 더 적합함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 검출 대상 산물인 HPV L1에 대한 증폭 산물과 내재 표준물질의 산물을 구분하여 측정하기 위해 내재 표준물질의 Tm 값을 낮추는 경우에 대한 개념도이다.
도 2는 HPV 고양성 시료의 실시간 다중 PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 HPV 저양성 시료의 실시간 다중 PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HPV 음성 시표의 실시간 다중 PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 반응 저해물질로 인한 위음성 시료의 실시간 다중 PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
<110> LG LIFE SCIENCES, Ltd.
<120> A METHOD FOR A DETECTION OF HPV AT THE REAL TIME PCR WITH AN
INTERCALATING DYE
<130> PA090012/KR
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for MY11
<400> 1
gcmcagggwc ataayaatgg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for MY12-1
<400> 2
cacagggyca yaayaatgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for MY09
<400> 3
cgtccmarrg gawactgatc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for MY10
<400> 4
cgtcccarrg gawaytgatc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GP5
<400> 5
tttgttactg tggtagatac cac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GP5-1
<400> 6
tttgttactg ttgtrgatac yac 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GP6
<400> 7
gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GP6-1
<400> 8
gaaaaataaa ctgyaaatca waytc 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for IC-GFP
<400> 9
ctttctaatc cttttacatt t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for IC-GFP
<400> 10
actacaagga tctttgatta a 21
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GFP probe
<400> 11
attacctgtc cacacaatct gccctt 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for GFP_probe2
<400> 12
attacctgtc cacacaatct gccctt 26
Claims (19)
- 삭제
- 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 포함하는 HPV 검출용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물에 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 프로브를 추가적으로 포함하는 HPV 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 완충용액, DNA 중합 효소, dNTP, 핵산 염색제 및 멸균 증류수를 추가적으로 포함하는 HPV 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그된 HPV 검출용 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 5' 말단의 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloroflorescein), 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고, 상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ3 (black hole quencher 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 HPV 검출용 조성물.
- 개체로부터 시료를 수득하는 단계; 및제6항에 따른 조성물을 이용한 증폭 및 HPV 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 HPV의 검출방법.
- 제7항에 있어서, 상기 HPV의 검출방법은 단일 반응용기 내에서 실시간으로 수행되는 것을 특징으로 하는 HPV의 검출방법.
- 제7항에 있어서, 상기 시료는 자궁경부탈락세포인 HPV의 검출방법.
- 제3항의 조성물을 포함하는 HPV 검출용 키트.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물에 완충용액, DNA 중합 효소, dNTP, 핵산 염색제 및 멸균 증류수를 추가적으로 포함하는 HPV 검출용 키트.
- (a) 서열번호 1 및 서열번호 2; 서열번호 3 및 서열번호 4; 서열번호 5 및 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 세트를 포함하는, 목적 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 세트를 포함하는, 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 준비하는 단계로서, 상기 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 내재 표준 유전자의 PCR 산물의 Tm (melting temperature)값이 목적 유전자의 PCR 산물의 Tm 값 보다 낮도록 변형된 것인 단계;(b) 목적 유전자 및 내재 표준 유전자가 포함된 용기에 상기 (a)에서 준비한 목적 유전자에 특이적인 프라이머 세트, 내재 표준 유전자에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 넣고 핵산 염색제를 이용하여 실시간 PCR (real-time PCR)을 수행하는 단계;(c) 각 사이클의 연장반응 시기에 목적 유전자의 형광값을 측정하는 단계; 및(d) 연장과정에서 형광신호를 70 내지 80에서 측정하여 내재 표준 유전자의 형광값을 측정하는 단계를 포함하는, 핵산 염색제를 이용하는 실시간 PCR 방법을 이용하여 목적 유전자를 검출하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 목적 유전자는 HPV 유전자인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 내재 표준 유전자는 gfp (green fluorescence protein) 유전자인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제12항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 11 및 서열번호 12인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 핵산 염색제는 SyBr Green인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그된 것이며, 상기 5' 말단의 형광 물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichloroflorescein), 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질이고, 상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ3 (black hole quencher 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090015025A KR101717632B1 (ko) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090015025A KR101717632B1 (ko) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100095957A KR20100095957A (ko) | 2010-09-01 |
| KR101717632B1 true KR101717632B1 (ko) | 2017-03-17 |
Family
ID=43003768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020090015025A KR101717632B1 (ko) | 2009-02-23 | 2009-02-23 | 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101717632B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101703776B1 (ko) * | 2014-08-14 | 2017-02-08 | 대한민국(관리부서 질병관리본부장) | Hpv 유전형 분석의 정확성을 평가하기 위한 hpv 표준물질 |
-
2009
- 2009-02-23 KR KR1020090015025A patent/KR101717632B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Biotechniques, Vol. 21, No. 6, pp. 1102-1108 (1996.12.)* |
| J. Virol. Methods., Vol. 88, No. 2, pp. 125-134 (2000.08.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20100095957A (ko) | 2010-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6177844B2 (ja) | 試験サンプル中のヒトパピローマウイルスおよびヒトベータグロビン配列を検出するためのプライマーおよびプローブ | |
| US6355424B1 (en) | Assessment of human papillomavirus-related disease | |
| EP2352845B1 (en) | Diagnostic transcript and splice patterns of hpv16 in different cervical lesions | |
| JP4976429B2 (ja) | オリゴ核酸探針ビーズアレイを用いたヒトパピローマウイルス検出キットおよび方法 | |
| KR20070105992A (ko) | 생물학적 시료에서 사람 유두종 바이러스를 검출하기 위한시스템, 방법 및 조성물 | |
| EP2373819B1 (en) | Multiparameter assay | |
| KR101717632B1 (ko) | 핵산 염색제를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｐｖ 검출 방법 | |
| JP5546085B2 (ja) | 早期がん予測のための方法及びキット | |
| TWI757239B (zh) | 檢測ｈｐｖ之方法、擴增混合物及套組 | |
| KR101579298B1 (ko) | 개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 | |
| JP5898831B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスの検出 | |
| KR101196930B1 (ko) | 인체유두종바이러스 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 인체유두종바이러스의 검출방법 | |
| KR102499837B1 (ko) | 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 | |
| AU2003267861A1 (en) | Method for detecting and typing of cutaneous hpv and primers and probes for use therein | |
| KR20170044077A (ko) | 인유두종바이러스의 고감도 검출 방법 및 그 키트 | |
| KR20110116644A (ko) | 결핵의 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 결핵 진단용 키트 | |
| JP7218887B2 (ja) | 子宮頸がん検査用検体 | |
| KR101545015B1 (ko) | 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 | |
| AU2008212633B2 (en) | Detection of human papillomavirus | |
| Abdulhamit et al. | FDA-Approved Molecular Tests Used to Define Human Papillomavirus (HPV) Infections which Cause Cervix Cancer | |
| CN116814854A (zh) | 人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒 | |
| WO2005100610A2 (en) | Virus detection method, primers therefor and screening kit | |
| KR20160061289A (ko) | 인유두종바이러스 검출 방법 및 키트 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200116 Year of fee payment: 4 |