KR101545015B1 - 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 - Google Patents

자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트{A method for diagnosing uterine cervical cancer and a kit therefor}
본 발명은 신규한 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트에 관한 것이다.
자궁경부암은 세계적으로 여성에게 발생하는 암 중 두 번째로 많이 발생하는 암이며(Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM.Int J Cancer. 2010. 127: 2893-2917.), 국가암등록사업에 의해 자궁경부암의 5년 생존율이 약 80%이상으로 나타났고 이에 따라 조기에 발견 할수록 생존율이 높아짐을 알 수 있다. 자궁경부암 환자의 99.7%에서 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 유전자가 존재하는 것이 밝혀졌으며, 이러한 HPV 감염의 존속이 침윤성 자궁경부암, 자궁경부 전암으로의 전이를 일으키는 것으로 알려져 있다.
현재 HPV의 유전자형은 100가지 이상이 알려져 있고 이 중에서 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 유전자형은 30가지 정도로 알려선져 있으며 그 유전자형은 고위험군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 과 저위험군 (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81), 잠재위험군(34, 57, 83)으로 분류하고 있으며, 각각의 유전자형을 지닌 HPV가 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 유전자형 특이적으로 발견됨으로써 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인지하게 되었다.
HPV의 감염여부를 진단하기 위하여 가장 많이 쓰이는 방법은 자궁경부에서부터 얻은 탈락세포를 이용해 세포진단학적 검사를 수행하는 자궁경부 세포진검사 (Papanicolaou smear, 이하 Pap 도말검사) 가 있으며, 이는 검사방법이 간단하고 비용이 적게 드는 경제적인 이유로 자궁경부암 선별 검사로서 유용성이 높다고 알려져 있지만, 민감도가 약 20~50% 로 위음성률이 매우 높다는 단점이 있다 (Hwang TS, Jeong JK, Park M, Han HS, Choi HK, Park TS. Gynecol Oncol.2003. 90: 51-56). 특히 High-grade squamous intraepithelial lesion (이하 HSIL)에 대한 낮은 민감도와 예측도 (predictive value)가 보고되고 있고, 편평세포암에 비해 선병변 (grandular lesion)이나 선암 (adenocarcinoma)에 대한 낮은 선별력으로 인해 자궁경부암의 조기 진단이 어렵다는 등 자궁경부암 진단에 있어 Pap 도말검사의 여러 가지 제한점이 나타나고 있다 (Kim YS, Lee HJ, Lee GG. Korean J Clin Pathol. 2001. 21: 210-214;Kwon HS, Kim YT, Kim JW, Kim SH. Korean J Gynecol Oncol Colposc. 2002. 13: 327-335.).
또한 질확대경을 이용한 검사 방법은 자궁세포진 검사보다 정확한 결과를 얻을 수는 있지만, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 감염유무를 구별할 수 없다는 단점이 있다.
자궁경부암으로 진행하는 과정에 HPV가 중요한 원인으로 알려지면서 기존에 자궁경부암검사에 사용되던 세포학적 검사법인 Pap test와 더불어 자궁암의 조기 진단에 HPV DNA의 존재 유무를 밝히는 것이 중요하게 여겨지고 있다.
자궁경부암으로 발전함에 있어서 인유두종바이러스 (human papillomavirus; 이하 HPV)의 감염이 연관이 있다는 점이 알려지면서, 자궁경부에서부터 HPV DNA를 검출하는 방법부터 HPV의 캡시드 단백질을 암호화하는 L1 유전자를 기초로 HPV 유전형을 검사하는 HPV 유전형 검사법 등 HPV DNA 검사법들이 많이 개발되어 상용화되었고, 현재 이러한 분자진단학적 방법들은 Pap 도말검사의 보조적인 검사로 함께 사용되고 있으며 (Thomas I, Liesje G, Ryan S. J Clin Microbiol. 1999. 37: 2508-2517), 그 이용이 국내에서 또한 증가하고 있다 (Cho EJ, Do JH, Kim YS, Bae S, Ahn WS. J Med Microbiol.2011. 60: 162-171).
HPV DNA 검사법으로는 대표적으로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용해 HPV의 DNA 존재 유무를 알아볼 수 있는 방법 또는 DNA chip나 reverse blot hybridization assay(REBA)를 이용해 HPV의 유전자형을 검사하는 방법이 알려져 있다.
HPV DNA 검사와 HPV Genotyping 검사는 민감도가 매우 높고, 감염되어 있는 HPV의 유전형을 알 수 있다는 장점이 있지만, 분석적 민감도가 너무 높아 고등급 병변인 SCC와 HSIL에서 뿐만 아니라 저등급 병변과 정상 소견에서도 약 40~50% 가량 높은 비율로 검출이 된다는 제한점이 있으며 HPV DNA의 존재만으로는 HPV의 감염을 검출할 수는 있지만, 자궁겸부암을 바로 진단할 수 없다는 단점이 있다.
자궁경부가 HPV에 감염되면, HPV의 발암유전자인 E6/E7가 과발현되어 p53과 pRB와 같은 암 억제 단백질의 기능을 억제해 암을 유도하게 된다.
하지만, 최근 몇 년간의 연구결과에 따르면, 자궁경부암환자 뿐만 아니라 암으로 발생하기 이전인 염증단계 또는 정상인의 자궁경부에서도 HPV DNA 양성률이 매우 높게 나오고 있기 때문에, HPV DNA가 검출되더라도 임상적인 자궁경부암의 치료 및 예방을 하기에 매우 어려운 실정에 있다.
그동안 HPV DNA 검출 및 유전자형 검출을 위해서 HPV의 핵산 중 가장 큰 크기의 L1(late gene 1) capsid 단백질을 암호화하는 부위를 표적으로 개발되어 왔지만, 이 보다는 암을 유도할 때 발현되는 단백질인 E6/E7을 암호화하는 mRNA를 표적으로 그 유전자 발현양의 정도를 검출하는 것이 자궁경부암 및 자궁경부암의 예후를 판정하는데 보다 유용성이 있다고 본다.
현재까지 알려진 바로는 국내에서는 HPV 발암유전자 E6, E7 mRNA를 표적으로 한 HPV mRNA검사법의 개발이 미미한 상황이며 국내 중대형병원에서의 HPV DNA 유전형검사의 수행은 증가하고 있는 추세에 있지만, HPV DNA 양성율이 자궁경부암뿐만 아니라 정상에서의 양성율이 모두 높게 나타났기 때문에 직접적인 임상적 치료나 예방치료에 바로 적용하기는 힘든 상황이다.
최근에는 HPV의 DNA를 이용한 검사가 아닌 HPV 고위험군의 발암유전자인 E6와 E7유전자를 암호화 하고 있는 mRNA를 표적으로 한 검사법이 개발되고 있는 추세이며, 이미 전 세계적으로 자궁경부암에서 가장 많이 존재한다고 알려진 HPV 16, 18, 31, 33, 45형의 E6, E7 mRNA를 검출할 수 있는 real-time NASBA 검사법이 상용화되었지만 이러한 검사키트들은 상당히 고가(단가:3만원/검사)이며, real-time NASBA를 하기위해서는 전용분석기계가 필요하지만, 현재 중대형 병원에서는 이러한 전용분석기계를 보유하고 있지 않기 때문에, 실질적으로 임상검사에 적용하기는 힘든 상황이며, 또한, 현재 상용화되어있는 E6, E7 mRNA 검사법의 경우 전 세계적으로 유행하는 HPV의 5개 유전형(HPV 16, 18, 31, 33, 45)을 포함하고 있기 때문에 국내에서 발생하는 자궁경부암으로부터 분리되는 HPV의 유전형과는 차이를 나타내기 때문에 국내의 환자들에게 적용하기에는 제한점이 있다.
[선행 특허문헌]
대한민국특허공개번호 제1020040078506호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신속하고 정확한 자궁경부암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신속하고 정확한 자궁경부암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 합성된 cDNA를 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브, 및 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및 d) 상기 발현된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 real-time RT-PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 real-time RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.
본 발명에 적용되는 real-time RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.
mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 real-time RT-PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 realtime RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 realtime PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 증폭된 양을 정상인에 대해 증폭된 양과 비교하는 단계는 컷오프 값에 의하여 수행되는 것이 바람직하며, 컷오프로 Ct값이 35 이하로 검출되는 검체에 대해서는 양성으로 표기하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하고,
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 4 및 5에 기재되고, 프로브는 서열번호 6에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하며,
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 7 및 8, 또는 10 및 11에 기재되고, 프로브는 서열번호 9 또는 12에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 프로브; HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 6에 기재된 프로브; 및 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8 또는 10 및 11에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9 또는 12에 기재된 프로브로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있으며 보다 바람직하게는 본 발명의 서열번호로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 형광표지된 프로브를 포함할 수 있다.
그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "암 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
용어 "프로브"는 단일 연쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 세계적으로 자궁경부암과 연관이 있다고 알려진 HPV 16, 18, 31, 33, 45 유전형과 더불어 국내 및 주변국들에서 자궁경부암과 연관이 있다고 알려진 HPV 35, 52, 56, 58, 39, 51, 59, 68, 53, 66, 69 유전형을 표적으로 E6, E7 발암유전자의 mRNA 발현양상을 정확히 측정할 수 있는 국내실정에 맞는 TaqMan 프로브를 이용한 Multiplex real-time RT-PCR검사법을 개발하였다.
개발하고자 하는 진단법의 기술적 측면으로 임상적 치료 및 예방치료가 필요한 환자군을 보다 신속하고 정확하게 제공하여 기존 HPV DNA검사법의 제한점을 극복할 수 있을 것으로 예상되며, 탈락세포로부터의 RNA 추출의 자동화가 가능하고 real-time RT-PCR을 사용함으로써, 결과분석이 소프트웨어에 의해 가능하기 때문에 보다 객관적이고 정확한 결과를 보다 신속하게 제공할 수 있을 것이다.
도 1은 임상검체 GAPDH mRNA real-time RT-PCR 결과
도 2는 주요 고위험군 16종 HPV의 E6/E7 표준염기서열 분석 및 프라이머와 TaqMan 프로브 위치
도 3은 HPV mRNA를 이용한 E6/7에서의 민감도
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명의 임상검체의 수집 및 확보는 연세대학교 원주기독병원 병리과로부터 자궁경부 액상세포검사 (Thin Prep PAP TEST, PreservCyt Solution, Hologic Inc.Marlborough, MA, USA)를 시행한 환자를 대상으로 남아있는 자궁경부의 탈락세포를 가지고 RNA추출을 위해 100% 무수에탄올에 보관하여 수집하여 확보하였다.
실시예 1:임상검체(자궁경부 탈락세포)로부터 total RNA 추출
임상검체로부터 total RNA를 분리하기위해 자동핵산추출장비인 MagNA Pure LC 2.0(Roche)와 MagNA Pure LC RNA Isolation Kit High Performance (Roche)를 사용하였다.
추출한 total RNA의 상태를 평가하기 위해 1.0% TBE Agarose gel에 전기영동하여 확인한 결과 18S, 28S rRNA의 밴드가 뚜렷이 나타나는 것을 확인하여 임상검체로부터 자동추출장비를 이용한 total RNA의 추출이 본 과제진행을 위해 적합한 것을 확인하였다(표 1).
순서 샘플번호 RNA농도(ng/ul) 260/280 Ratio
1 11-1203 not extracted 　
2 11-1234 192.72 2.03
3 11-1254 185.28 1.97
4 11-1259 201.28 2.01
5 11-1260 514.88 1.98
6 11-1261 195.28 2.06
7 11-1274 172.56 2.01
8 11-1283 244.96 1.99
9 11-1364 157.52 2.03
10 11-1372 205.52 2.07
11 11-1373 176.16 2.14
12 11-1374 669.6 1.96
13 11-1483 206.88 2
14 11-1321 325.6 2.04
15 11-1312 461.84 2.04
16 11-1296 331.76 2.1
17 11-1285 159.52 2.06
18 11-1273 708.88 1.98
19 11-1226 243.28 2.08
20 11-1225 248.88 1.99
표 1은 임상검체로부터 추출한 total RNA의 농도 및 순도
실시예 2:추출된 total RNA 로부터 cDNA 의 합성
임상검체로부터 분리한 total RNA 2 ug, random primer (Invitrogen) 0.2 5 ug, dNTP(Cosmo gene tech) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl2 3mM,DTT 8mM와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 20 ul가 되도록 DEPC treated DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA가 real-time RT-PCR을 수행하기에 적절한지를 확인하기위해 human gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 endogenous control로 하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과 임상검체로부터 추출하여 합성된 cDNA가 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 확인하였다 (도 1).
실시예 3: Multiplex RT - qPCR 을 위한 고위험군 HPV 주요 16종 유전형의 E6 / E7 mRNA 염기서열 분석 및 프라이머 TaqMan 프로브 디자인
자궁경부암에서 가장 많이 발견되는 고위험군 HPV 주요 16종의 E6/E7 mRNA의 NCBI 표준 염기서열을 기초로 확보하였고, 이러한 염기서열들을 multi-align system을 통해 적절한 프라이머와 TaqMan 프로브 위치를 선정하고 이를 디자인하였다(도 2).
Set I 검출 type 16, 35, 31, 58, 33, 52 　 　
F1 TTAGATTTRBADCCHGARVCAACTGAYCT(서열번호 1) 10p 　
R1 CYGGTTBTGCTTGTCCAKCTGG(서열번호 2) 10p 　
P1-2 CTGYTATGAGCAATTRNVYGRCAGCTCAGA(서열번호 3) 10p FAM-BHQ1
Set II 검출 type 18, 45, 39, 68, 59 　 　
F2-4 TGCARGAMATTGTDTTRSATTTRKRDCC(서열번호 4) 10p
R2-1 TGTGACGYTGTKGTTCRKCYCGTCKRGCT(서열번호 5) 10p 　
P2-2 TTGACYTKBWRTGYYACGAGCAATT(서열번호 6) 10p Cy5-BHQ2
Set III 검출 type 53, 56, 66, 51, 69, 26, 30 　 　
F3-1 TRTWTTAGAACTDRYACCDCAAAC(서열번호 7) 10p 　
R3-2 GTCTAYTTCATCCTCATCCTCYTCCTCTG(서열번호 8) 10p 　
P3-3 TTGACCTRCADTGCHATGAGCAATTGRAC(서열번호 9) 10p HEX-BHQ1　
51-69F GATGTWRTATTRSATTTRRYRCC(서열번호 10) 10p 　
26-51-69R ACGCAYATTATCTRYTTCATCCTCMTC(서열번호 11) 10p 　
51-69-P TTGACYTRCAVTGYTACGARCAATTKGAC(서열번호 12) 10p HEX-BHQ1
표 2는 본 발명에 사용된 Primer와 Probe sequence
실시예 4: Real - time PCR 수행
Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,200μM 각 dNTP,1unit Taq polymerase(TAKARA)와 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe 또한 10pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행하였다. PCR 반응은 CFX 96(BioRad-USA)를 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 55℃에서 20초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
1. 각 타입별 민감도
각 타입별 민감도를 확인해 본 결과 100~10fg에서 검출됨을 확인할 수 있었다(도 3).
2. Multiplex real-time PCR을 이용한 16종의 HPV검출
Set I은 FAM dye를 이용하여 HPV type 16, 31, 33, 35, 52, 58이 검출 확인하였으며
Set II은 Cy5 dye를 이용하여 HPV type 18, 39, 45, 59, 68을 검출하였으며
Set III는 HEX dye를 이용하여 HPV type 53, 56, 66, 51, 69이 검출 확인됨을 알 수 있었다(표 3).
　 　 　F2-2(3)mix/R2-1　 F2-4/R2 F2-4/R2-1
　 　 set 1 set 2 set 3 set 1 set 2 set 3 set 1 set 2 set 3
1 HPV-16 19.35 N/A N/A 20.45 24.89 N/A 20.73 N/A N/A
2 HPV-18 N/A 25.29 N/A 22.46 22.57 N/A N/A 22.07 N/A
3 HPV-31 19.13 13.84 N/A 18.4 N/A N/A 20.43 N/A N/A
4 HPV-33 19.98 N/A N/A 19.85 N/A N/A 19.82 N/A N/A
5 HPV-35 19.62 N/A N/A 19.36 N/A N/A 21.48 N/A N/A
6 HPV-39 N/A 28.98 N/A N/A 24.72 N/A N/A 26.06 N/A
7 HPV-45 N/A 26.28 N/A N/A 23.46 N/A N/A 24.36 N/A
8 HPV-51 N/A N/A 28.82 N/A N/A 34.89 N/A N/A 29.56
9 HPV-52 17.57 N/A N/A 18.97 N/A 1.84 16.81 N/A 1.93
10 HPV-53 N/A N/A 23.72 N/A N/A 22.71 N/A N/A 22.8
11 HPV-54 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
12 HPV-56 N/A N/A 22.78 N/A N/A 23.21 N/A N/A 22.77
13 HPV-58 19.77 N/A N/A 19.39 N/A N/A 20.74 N/A N/A
14 HPV-59 N/A 30.26 N/A N/A 25.22 N/A N/A 26.48 N/A
15 HPV-66 N/A N/A 22.27 N/A N/A 19.49 N/A N/A 20.2
16 HPV-68 N/A 26.5 N/A N/A 25.86 N/A N/A 26.58 N/A
17 HPV-69 12.55 N/A 25.4 N/A N/A 26.24 N/A N/A 26.56
18 HPV-06 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
19 HPV-11 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
20 HPV-84 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
21 HPV-87 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
표 3은 HPV 타입에 따른 Multiplex real-time PCR의 검출
3. 임상에서 기존방법(Real-time NASBA)과의 검출 비교 민감도 확인
기존 DNA chip의 결과가 있는 임상검체 68검체와 특이도 검사를 위한 정상인 검체 49의 총 117검체를 대상으로 기존에 나와 있는 Real-time NASBA와의 비교테스트를 진행하였다.
그 결과 정상인 검체에서는 모두 나오지 않음을 확인할 수 있었고, 세포병리학적으로 고등급 병변을 나타내는 총 68개의 임상검체에서 Real-time NASBA(Biometriux, HPV 16, 18, 31, 33, 45의 5개 타입만 검출이 가능)를 수행하였다. Real-time NASBA는 Internal control (IC)에서 양성이 나온 검체에서 각 타겟 유전형별 E6/E7 mRNA를 검출할 수 있다. 68개의 임상검체 중 38검체에서 real-time NASBA의 IC 양성이 나와 각 타겟 유전형별 E6/E7 mRNA를 검출 해 본 결과 28/38 (73.7%)의 양성률을 보였으며, 음성이 나온 10개의 검체 중 Real-time NASBA에서 검출할 수 없는 유전형에 대한 검체는 5/38 (13.2%)였으며, Real-time NASBA에서 검출 할 수 있으나 검출되지 않은 경우는 5/38(13.2%)로 나타났다. 반면에 Multiplex Real-time PCR의 경우에서는 real-time NASBA에서 양성이 나온 38개의 검체에서 38/38 (100%)의 양성률을 확인 하였다. 또한, Real-time NASBA에서 IC가 음성이 나와 HPV E6/E7 mRNA를 검출하지 하지 못했던 30검체에 대해서도 동일하게 Real-time PCR을 수행한 결과 24/30 (80%)에서 양성이 나옴을 확인할 수 있었다. 이와 같이 Multiplex real-time PCR (62/68, 91.2%)을 수행할 경우 Real-time NASBA (28/68, 41.2%)를 수행하였을 때 보다 50% (34/68) 의 민감도가 높아짐을 확인 할 수 있었다(표 4).
Cytology results DNA chip (Goodgen) Sample No. Real-time NASBA (biomeriux)U1A, 16, 18, 31, 33, 45 type Real time E6-7 PCR
Positive rate (%)
Positive rate (%) Negative rate (%)
SCC &ADC High risk 15 11 (73.3%) 4 (26.7%) 15 (100%)
HSIL High risk 23 17 (73.9%) 6 (26.1%) 23 (100%)
SCC* High risk 9 9 (100%) 9 (100%)
HSIL* High risk 21 21 (100%) 15 (71.4%)
Normal Normal 60 0 (0.0%) 60 (100.0%)　 0 (0%)
표 4는 HPV mRNA를 이용한 Real-time NASBA와 Multiplex Real-time PCR의 검출비교
* Real-time NASBA Internal control 음성인 검체
4. 임상검체를 이용한 Multiplex Real-time PCR의 양성율과 음성율
세포병리학적 검사에서 고등급 병변을 나타내면서 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV 고위험군이 감염된 75개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행한 결과 양성율이 98.7%, 음성율이 1.3% 였다. 또한 세포병리학적 검사에서 정상을 나타내면서 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV에 감염되지 않은 110개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행한 결과 양성율이 0%, 음성율이 100% 였다. 이 결과 검사의 특이도는 100%, 민감도는 98.7%로 기존의 검사법에 비해 매우 높음을 확인할 수 있었다(표 5).
HPV mRNA Multiplex Real-time PCR
Clinical Specimens Positive Negative Total
Cytologic Test HPV DNA Chip Test
SCC &HSIL HPV High-risk Positive 74 (98.7 %) 1 (1.3%) 75 (100%)
Normal HPV Negative 0 (0%) 110 (100%) 110 (100%)
표 5는 임상검체로부터 분리한 HPV mRNA를 이용한 Multiplex Real-time PCR의 결과
5. DNA 유전형 검사 (DNA chip)과 Multiplex Real-time PCR의 특이도 비교
정상인의 자궁경부에서도 HPV DNA 양성률이 매우 높게 나오고 있기 때문에 mRNA를 표적으로 한 검사의 유용성을 확인 하고자 세포병리학적 검사에서 정상으로 나왔으나 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV 고위험군으로 감염된 66개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행하였으며 그 결과 6.3%(6/95)가 검출되어 DNA chip에 대한 위양성 문제를 줄일수 있음을 확인하였다 (표 6)
No . Molecular No . Cytology Result ( Goodgen kit ) Multiplex
1 M-11-1392 - 16 28.95
2 M-11-150 - 52 30.14
3 M-11-917 - 31 32.88
4 M-11-551 - 58 undetermined
5 M-11-672 - 16, 33 undetermined
6 M-10-1708 - 16 undetermined
7 M-11-152 - 16 undetermined
8 M-11-106 - 52 undetermined
9 M-10-1578 - 16 undetermined
10 M-11-149 - 16 undetermined
11 M-10-1299 - 58 undetermined
12 M-11-119 - 35, 66 32.54
13 M-10-993 - 33 undetermined
14 M-10-1170 - 16 undetermined
15 M-10-1517 - 58 undetermined
16 M-11-52 - 16 undetermined
17 M-11-94 - 31 undetermined
18 M-11-104 - 33, 58 undetermined
19 M-11-253 - 16 undetermined
20 M-11-286 - 16 undetermined
21 M-11-287 - 16 undetermined
22 M-11-327 - 16 undetermined
23 M-11-389 - 33, 58 undetermined
24 M-11-466 - 16, 18 undetermined
25 M-11-467 - 16, 18, 39, 58, 68 undetermined
26 M-11-486 - 16 undetermined
27 M-11-605 - 18, 58 undetermined
28 M-11-617 - 16, 18 undetermined
29 M-11-623 - 33 undetermined
30 M-11-633 - 16, 18 undetermined
31 M-11-696 - 33 undetermined
32 M-11-742 - 18, 35 undetermined
33 M-11-925 - 16 undetermined
34 M-11-858 - 58, 68 undetermined
35 M-11-948 - 16 undetermined
36 M-11-964 - 16 undetermined
37 M-11-986 - 58 undetermined
38 M-11-993 - 16, 58 undetermined
39 M-11-1027 - 16 undetermined
40 M-11-1038 - 58 undetermined
41 M-11-1042 - 16 undetermined
42 M-11-1043 - 16 undetermined
43 M-11-1057 - 16, 68 undetermined
44 M-11-1059 - 58 undetermined
45 M-11-1083 - 16, 18, 56 undetermined
46 M-11-1084 - 16 undetermined
47 M-11-1087 - 16, 18 undetermined
48 M-11-1088 - 16 undetermined
49 M-11-1416 - 16, 58 undetermined
50 M-11-1454 - 16, 18 undetermined
51 M-11-1497 - 52 undetermined
52 M-11-1536 - 16, 18, 33 undetermined
53 M-11-1543 - 16, 39, 66 undetermined
54 M-11-1562 - 16 undetermined
55 M-11-1563 - 33 undetermined
56 M-11-1637 - 16 undetermined
57 M-11-1658 - 16, 18, 39 undetermined
58 M-11-1663 - 52 undetermined
59 M-11-1669 - 16 undetermined
60 M-11-1747 - 18, 58 26.52
61 M-11-1748 - 16 undetermined
62 M-11-1798 - 16 undetermined
63 M-11-1799 - 33 undetermined
64 M-11-1812 - 16 undetermined
65 M-11-1897 - 18, 58 undetermined
66 M-11-1932 - 16 undetermined
67 M-11-47 - 18 undetermined
68 M-10-1056 - 66 33.3
69 M-10-1542 - 56 undetermined
70 M-10-1651 - 45 undetermined
71 M-11-69 - 45 undetermined
72 M-11-73 - 56 undetermined
73 M-11-239 - 59 undetermined
74 M-11-241 - 18 undetermined
75 M-11-328 - 18 undetermined
76 M-11-460 - 68 undetermined
77 M-11-472 - 18, 56 undetermined
78 M-11-523 - 18 undetermined
79 M-11-729 - 18 undetermined
80 M-11-738 - 18 undetermined
81 M-11-846 - 18 undetermined
82 M-11-919 - 18 undetermined
83 M-11-1089 - 39 undetermined
84 M-11-1154 - 18 undetermined
85 M-11-1535 - 45 undetermined
86 M-11-1654 - 69 undetermined
87 M-11-1661 - 18 undetermined
88 M-11-1718 - 66 undetermined
89 M-11-1728 - 18 undetermined
90 M-11-1793 - 66 undetermined
91 M-11-1808 - 68 undetermined
92 M-11-1809 - 56, 69 undetermined
93 M-11-1894 - 18 undetermined
94 M-11-320 - 66 undetermined
95 M-11-1880 - 56 undetermined
표 6은 DNA를 이용한 DNA chip 결과와 mRNA를 이용한 Multiplex real-time PCR의 결과비교
<110> Molecules and Diagnostics Inc. Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A method for diagnosing uterine cervical cancer and a kit therefor <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttagatttrb adcchgarvc aactgayct 29 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cyggttbtgc ttgtccakct gg 22 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 ctgytatgag caattrnvyg rcagctcaga 30 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcargamat tgtdttrsat ttrkrdcc 28 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgtgacgytg tkgttcrkcy cgtckrgct 29 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ttgacytkbw rtgyyacgag caatt 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 trtwttagaa ctdryaccdc aaac 24 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtctayttca tcctcatcct cytcctctg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ttgacctrca dtgchatgag caattgrac 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatgtwrtat trsatttrry rcc 23 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acgcayatta tctryttcat cctcmtc 27 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 ttgacytrca vtgytacgar caattkgac 29

Claims (7)

  1. a) 환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    c) 상기 합성된 cDNA를 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍 및 서열번호 3에 기재된 프로브,HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍 및 서열번호 6에 기재된 프로브, 및 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8, 또는 10 및 11에 기재된 프라이머 쌍 및 서열번호 9 또는 12에 기재된 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및
    d) 상기 실시간-PCR을 수행하여 발현된 양을 정상인에 대해 상기 실시간-PCR을 수행하여 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 프로브;
    HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 6에 기재된 프로브; 및
    HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8 또는 10 및 11에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9 또는 12에 기재된 프로브를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물.
  6. 삭제
  7. HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 프로브;
    HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 및 5에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 6에 기재된 프로브; 및
    HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 7 및 8 또는 10 및 11에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 9 또는 12에 기재된 프로브를 포함하는 자궁경부암 진단용 키트.
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